ICS07.080國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)I Ⅲ 12規(guī)范性引用文件 1 14原理 15試劑或材料 1 2 2附錄A(規(guī)范性)瓊脂糖凝膠電泳 4ⅢGB/T41799—2022本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由全國(guó)工具酶標(biāo)準(zhǔn)化工作組(SAC/SWG11)提出并歸口。本文件起草單位：福建南生科技有限公司、通用生物(安徽)股份有限公司、夏禾(深圳)生物技術(shù)有生命科技有限公司、雷谷(廈門)生物醫(yī)藥有限公司、北京化工大學(xué)、山東大學(xué)、安琪酵母股份有限公司、復(fù)旦大學(xué)、武漢科技大學(xué)、北京中天標(biāo)科標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)研究院有限公司、廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司。GB/T41799—2022限制性核酸內(nèi)切酶是一類識(shí)別雙鏈DNA中特定核苷酸序列的DNA水解酶，以內(nèi)切方式水解DNA,產(chǎn)生5'-PO?和3'-OH末端。限制性核酸內(nèi)切酶的作用底物是脫氧核糖核酸(DNA),其他核酸內(nèi)切酶或核酸外切酶的污染會(huì)導(dǎo)致底物的降解或消失，降低其他核酸內(nèi)切酶或核酸外切酶的污染是限制性核酸內(nèi)切酶最重要的質(zhì)量保證。制定限制性核酸內(nèi)切酶雜質(zhì)檢測(cè)方法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，用以推動(dòng)該類工1GB/T41799—2022限制性核酸內(nèi)切酶雜質(zhì)檢測(cè)方法本文件描述了限制性核酸內(nèi)切酶中污染其他核酸內(nèi)切酶或核酸外切酶等雜質(zhì)的檢測(cè)方法。本文件適用于限制性核酸內(nèi)切酶雜質(zhì)的檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語和定義3.1以內(nèi)切方式水解DNA,產(chǎn)生5'-PO?和3'-OH末端，識(shí)別雙鏈DNA中特定核苷酸序列的DNA水解酶。3.2影響核酸底物存在的其他核酸內(nèi)切酶和核酸外切酶。由于BamHI切開DNA雙鏈產(chǎn)生一對(duì)黏性末端，其各有5個(gè)堿基失去互補(bǔ)堿基形成突出單鏈，其性狀發(fā)生改變。例如質(zhì)粒pBR322所含BamHI識(shí)別位點(diǎn)是在其抗四環(huán)素基因上，如果使用被核酸外切酶污染的樣品BamHI過量長(zhǎng)時(shí)程切割pBR322,然后再連接閉環(huán)后重新轉(zhuǎn)化受體菌，該菌在含四環(huán)素培養(yǎng)基上無法生長(zhǎng)，而沒有這樣酶切的pBR322轉(zhuǎn)化菌能夠生長(zhǎng)。又如質(zhì)粒pUC19所含BamHI位點(diǎn)居于編碼LacZ的α互補(bǔ)肽上，若發(fā)生前述狀況，就會(huì)導(dǎo)致該肽鏈的氨基酸序列變化，最終在含IPTG和X-gal的LB培養(yǎng)基上由原本是藍(lán)斑變成白斑。如果白斑數(shù)目占到總菌斑數(shù)的10%以上，就判5試劑或材料2GB/T41799—20225.4共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒pUC19DNA(cccpUC19DNA)。5.5T4噬菌體DNA連接酶(T4DNA連接酶)。15g,加入純化水至1L,用1mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至7.0,121℃高壓滅菌20min,待冷卻至50℃~取4只1.5mLEP管，管1#、管2#、管3#、管4#;管1#和管2#各加入1μgλDNA,管3#和管4#各加入1μgφX174DNA;每管加入5μL10×反應(yīng)緩沖液，管1#、管2#、管3#加入10U(1pL)BamHI,管4#不加BamHI,均加入純化水至50pL,混勻，37℃酶切，1h后取出管1#,置冰箱待電泳檢測(cè)；10h后取出管2#、管3#、管4#,置冰箱待電泳檢測(cè)。在1%～1.5%瓊脂糖凝膠、電泳電壓為5V/cm～10V/cm的條件下，當(dāng)溴酚藍(lán)線到達(dá)凝膠板2/3在電泳板上，肉眼觀察。若管1#和管2#的譜帶一致，管3#和管4#的譜帶一致，則判定樣品中不含其他核酸內(nèi)切酶；若管1#和管2#的譜帶不一致或(和)管3#和管4#的譜帶不一致，則判定樣品20μL(管1#)待電泳檢測(cè)，另20μL(管2#)待連接及藍(lán)白斑計(jì)數(shù)；所剩60μL繼續(xù)酶切達(dá)10h以3GB/T41799—20227.2.2.1取出管1#和管3#,加入載樣緩沖液，準(zhǔn)備電泳檢測(cè)。7.2.2.2在1.5%瓊脂糖，電泳電壓5V/cm～10V/cm的條件下，當(dāng)溴酚藍(lán)線到達(dá)凝膠板2/3位置時(shí)停止電泳，取出凝膠板置于紫外透光分析儀觀察和拍照。按附錄A的方法進(jìn)行電泳檢測(cè)。取出管2#、管4#、管5#,各加入20μL三氯甲烷-異戊醇先脫去雜蛋白，再沉淀出DNA,并真空后置于15℃水浴槽水浴8h。7.2.3.3.1將感受態(tài)菌液加入含連接處理過的DNA的EP管內(nèi)，輕混，置于4℃冰浴槽水浴0.5h7.2.3.3.2將上述三只EP管移到42℃水浴中熱擊2min,迅即取出再置于4℃冰浴槽水浴0.5h7.2.3.3.3向上述三只EP管各加入1mLLB培養(yǎng)液，輕混，置于37℃水浴槽水浴1h。7.2.3.3.4將15塊固態(tài)LB板，分別標(biāo)上管2#、管4#、管5#,每號(hào)均有5塊板；在超凈工作臺(tái)鋪板，每7.2.4.1在電泳板上，管1#和管3#的譜帶沒有明顯差異，說明長(zhǎng)時(shí)程過量酶處理對(duì)DNA沒有造成額7.2.4.2管2#、管4#、管5#的白斑總數(shù)與其藍(lán)斑總數(shù)相比。若比值小于1/9,則判定樣品不含外切4GB/T41799—2022(規(guī)范性)瓊脂糖凝膠電泳A.1原理瓊脂糖凝膠電泳，是以瓊脂糖為介質(zhì)，對(duì)不同大小的DNA電泳后的DNA分子通過染料嵌合和紫外線照射而顯示出在凝膠電泳中不同的位置。A.2試劑或材料A.2.1瓊脂糖。A.2.46×載樣緩沖液：0.25%嗅酚藍(lán)、0.25%二甲苯青、30%甘油水溶液。A.3儀器設(shè)備A.4實(shí)驗(yàn)步驟A.4.1將制膠模具組裝并根據(jù)樣本數(shù)量選擇合適的梳子插入后置于水平臺(tái)面待用。A.4.2根據(jù)欲分離DNA片段大小用1×TAE緩沖液配制適宜濃度的瓊脂糖溶液，應(yīng)準(zhǔn)確稱量瓊脂糖干粉加到盛有定好量的1