醫學實驗動物學實驗動物質量控制 微生物的標準化

實驗動物微生物質量控制的目的，是要求生產的實驗動物達到預定的微生物質量標準，而且動物實驗過程也要執行同樣的微生物質量標準。東北農業大學28名師生感染布魯氏菌病2010年12月19日下午，“羊活體解剖學實驗”；2011年1月，王永杰連續高燒很多天了。由于是冬天，感冒發燒也屬正常，所以他沒有警覺。經過吃藥、打針等治療后，他終于有些好轉，卻總覺得不是那么舒服。2011年3月開學，發現癥狀一樣的同學有好幾個。“開學時，一位姓王的同學被其母親背到了學校，他因為關節疼痛已無法行走。”最終查出，共5個班級28人被感染布魯氏菌病，其中包括27名學生、1名老師。“布魯氏菌病還屬于《職業病范圍和職業病患者處理辦法》規定的乙類職業病。我們查過法律法規，許多行業對布魯氏菌病患者都有著嚴格的限制。原因：1、使用未經檢疫的動物；2、未切實按照標準的實驗規范執行。一、實驗動物微生物質量控制的原因引起實驗動物的疾病和死亡干擾實驗結果如：仙臺病毒感染 B、T淋巴細胞對抗原反應減弱，增加干擾素產量，減少血清第三補體因子（C3）水平；小鼠肝炎病毒感染 網狀內皮系統的吞噬細胞活性、淋巴細胞的細胞毒活性被抑制，誘導血清天冬氨酸轉氨酶AST、丙氨酸轉氨酶ALT等肝酶 。人獸共患病既能感染動物、也能感染人類引起疾病影響生物制品的質量二、污染源和傳播途徑1、實驗動物2、材料和設備3、寵物4、工作人員人是兩組動物間傳播污染源最重要的因素。人能成為在接觸被污染動物后的媒介和病原微生物的臨時宿主。1、普通動物2、清潔動物3、無特定病原體動物4、悉生動物5、無菌動物三、按微生物學控制的動物分類普通級動物

conventionalanimal,CV定義：不攜帶規定的人獸共患疾病原和動物烈性傳染病病原的實驗動物。常用普通級動物：豚鼠、地鼠、兔、犬、豬、猴清潔級動物

clean

animal,CL定義：除普通級動物應排除的病原外，不攜帶對動物危害大和對科學研究干擾大的病原的實驗動物。根據我國國情自行設定的等級動物。必須來源于SPF動物或無菌動物，飼養在半屏障系統中。一般針對小動物而言，如大鼠、小鼠、地鼠、豚鼠、兔等。無特定病原體級動物,SPFspecificpathogenfree

animal定義：除清潔級動物應排除的病原外，不攜帶主要潛在感染或條件致病和對科學實驗干擾大的病原的實驗動物。標準的實驗動物必須來源無菌動物或悉生動物常用SPF級動物：大鼠、小鼠無菌級動物

germ

free

animal,GF定義：無可檢出的一切生命體的實驗動物。同屬四級動物的還有：悉生動物，將無菌動物體內植入已知微生物的實驗動物；根據植入的菌種數，可將其分為單菌、雙菌、三菌和多菌動物。通過子宮切術術、剖腹產術、胚胎移植等方式獲得。但偶爾會發現有微生物存在，為經過胎盤傳播或通過其他途徑（垂直感染）在妊娠中傳給子代。原籍菌群丟失，表現出多樣的形態學和生理學“異常”。如盲腸明顯增大，腸壁更薄弱。健康動物處死浸在37℃滅菌液中送進無菌隔離器剖腹手術切除子宮將子宮浸消毒液即送到另一只隔離器中切開子宮取胎用滅菌紗布揩拭仔體并電刀斷臍放入隔離器內人工喂乳或保姆代養國際分級法等級種類飼養條件控制程度備注三級無菌動物Germfree

animal隔離系統Isolationsystem以封閉的無菌技術獲得,用現有方法不能檢出任何微生物和寄生蟲的動物。三級悉生動物Gnotobioticsanimal隔離系統Isolationsystem確知已帶的微生物，經無菌條件飼養的動物。明確所帶的微生物。二級無特定病原體動物Specific

pathogenfree

animal屏障系統Barriersystem不帶有指定的致病性微生物和寄生蟲的動物。帶有非特定的微生物和寄生蟲一級普通動物Conventionalanimal開放系統Open

system不攜帶所規定的人獸共患病病原和動物烈性傳染病的病原。對微生物攜帶狀況不明確等級種類飼養條件四級無菌動物Germfreeanimal

GF隔離系統Isolation

system四級悉生動物Gnotobioticsanimal

GN隔離系統Isolation

system三級無特定病原體動物SpecificpathogenfreeanimalSPF屏障系統Barrier

system二級清潔動物Cleananimal

CL屏障系統Barrier

system一級普通動物Conventionalanimal

CV開放系統Opensystem國家標準分級潔凈度

（

cleanliness

）：潔凈環境內單位體積空氣中含大于或等于某一粒徑的懸浮粒子的允許統計數空氣潔凈度等級(N)大于或等于表中粒徑的最大濃度限值(pc/m3)0.5μm1μm5μm12433584（十級）352835（百級）3520832296（千級）3520083202937（萬級）3520008320029308（十萬級）3520000832000293009（百萬級）352000008320000293000國家標準GB50073-2001實驗動物微生物等級與飼養設施要求隔離器屏障系統四、主要動物特點及應用1、清潔動物與SPF動物的應用CL動物國際上認為僅適合短期或部分科研實驗；我國認為適用于大多數科研實驗，可用于生物醫學研究的各領域。SPF動物適用于所有科研實驗，是目前國際標準級別的實驗動物。2、無菌動物的特點形態學改變消化系統:

盲腸膨大，易發生盲腸扭轉，導致破裂。循環系統：心臟變小。免疫系統：胸腺上皮細胞變大，胞漿泡狀結構和溶酶體變小。生理學改變免疫功能：免疫應答慢，過敏反應、對異體移植物的排斥反應以及自身免疫現象消失或減弱。對微生物感染非常敏感。生長率：豚鼠、兔生長率降低，大、小鼠改變不大。代謝：水分代謝周期延長，腸管對水的吸收率低。營養：體內不能合成VitB、VitK。抗輻射能力：增強。壽命：長于普通動物。3、悉生生物學(gnotobiology)：1885年pasteur認為宿主動物沒有腸道菌群參與，生命難以維持。無菌動物的問世，證明腸道菌群的存在，并非完全是哺乳動物生存所必需。悉生生物學是以無菌隔離技術提供的各種動物為實驗對象，研究實驗動物本身以及各種動物與微生物之間相互依存和制約關系的一門綜合科學。4、無菌動物的應用微生物研究GF是研究微生物與宿主相互作用，即微生生物與宏生生物相互關系，微生物與微生物的共生與拮抗關系的最佳動物；口服霍亂弧菌使幼齡GF豚鼠死亡，口服前感染梭狀芽胞桿菌，動物不發生死亡；口服福氏痢疾桿菌使幼齡GF豚鼠死亡，口服前接種大腸桿菌，動物不發生死亡；炎癥涉及細菌感染的多因素作用，GF可把多因素變成單因素，整體反應變成局部反應。老年學研究GF大鼠壽命比CV大鼠延長1/3；雌性GF壽命比雄性動物短，雌性CV動物比雄性長；2-3年的GF大鼠臟器均未呈現同齡CV大鼠所具有的各種衰老變化腫瘤學研究在致癌因素中，微生物引起癌變的比重較大。GF大鼠比CV大鼠易發生激素依賴性腫瘤。GF動物口服蘇鐵素不出現腫瘤，但CV動物口服蘇鐵素出現腫瘤。五、實驗動物常見感染性疾病★

重要的人獸共患病★

主要的烈性傳染病★

常見的微生物和寄生蟲感染1、重要的人獸共患病流行性出血熱弓形蟲病淋巴細胞脈絡從腦膜炎沙門菌病狂犬病猴B病毒感染猴結核病疾病病原媒介動物人類臨床癥狀傳染途徑猴皰疹病毒感染(B-Virusinfection)cercopithecineHerpesvirusType

1獼猴類肌痛、發熱、頭痛；迅速發展的上行性麻痹；感覺異常、復視、運動失調、潴尿、抽搐、吞咽困難，直至死亡唾液(咬傷)、抓傷出血熱(Koreanhemorrhagic

fever)HantaanVirus大鼠、小鼠肌痛、咳嗽，發熱、腹瀉、出血、蛋白尿、腎臟損害，嚴重致死吸入感染、嚙齒類動物咬傷、傷口污染淋巴細胞脈絡叢

腦膜炎病毒感染癥(LCM)小鼠、倉鼠肌痛、發熱、惡心、嘔吐、喉痛、畏光。類似流行性感冒的癥狀，頭痛、接觸感染(接觸小鼠糞便和尿液)；吸入；咬傷，或由節肢動物如蚊子、蟑螂傳播狂犬病(Rabies)Lyphocyticchoriomeningitis virusRhabdovirus所有哺乳類頭痛、肌痛、發熱、恐水、狂妄、抽搐、昏厥、死亡咬傷、皮膚傷口或黏膜感染含狂犬病毒的唾液結核病(Tuberculosis)Mycobacterium tu-berculosis犬、貓、猴咳嗽、生痰、咳血、體重減輕、吸入傳染，或經口腔、無力疲倦、發熱、發冷、惡病 傷口及消化道感染質弓形蟲病toxoplasmosis狗、鼠等貓、豬、羊、導致自然流產、死胎、早產和新生兒嚴重感染

，后天：局限性感染以淋巴結炎最為多見

；全身性感染多見于免疫缺損者（愛滋病、惡性腫瘤）①先天性弓形蟲病系通過胎盤傳染

，②后天獲得性弓形蟲病主要經口感染沙 門 氏 菌 病(Salmonellosis)Salmonellatyphimu-riumS．

enteritidis鼠類、犬、貓、靈長類急性腸胃炎，腹痛、腹瀉、惡心、發熱、厭食經由食物、飲水感染疾病病原癥狀傳播方式控制小鼠脫腳病

(ectromelia)Mousepoxvirus小

鼠脫腳病毒腳、尾、鼻出現皮疹和潰瘍，嚴重出現尾壞死脫落。急性發作可引起大批小鼠死亡。皮膚傷口、呼吸道消化道兔出血

癥Rabbithemorrhagic

diseaseRabbithemorrhagicdiseasevirus病兔精神沉郁，食欲不振或廢絕，飲欲增加，被毛零亂、無光澤，兔耳耷拉。幼兔多呈急性型，通常看不到臨床癥狀，突然死亡。病兔的排泄物及污染物等，空氣傳播是主要傳播方式。2、主要的烈性傳染病鼠痘兔出血癥（兔瘟）3、常見的微生物和寄生蟲感染鼠肝炎病毒感染仙臺病毒感染鼠肺支原體病嗜肺巴斯德桿菌病小鼠呼腸孤3型病毒感染球蟲病犬細小病毒感染犬瘟熱六、實驗動物的微生物學和寄生蟲學質量監測1、監測的意義實施微生物學與寄生蟲學監測，是保證實驗動物質量及標準化的必要手段。通過監測可掌握動物群中病毒、細菌、寄生蟲的流行情況，及時診斷感染性疾病，發現并控制其傳播，以保證實驗動物的健康。2、監測的內容不同級別實驗動物的微生物和寄生蟲監測內容不同。國家技術監督局制定了標準(GBl4922.1—2011和GBl4922.2—2011)

。3、檢驗方法目前國標推薦使用的方法學和詳細檢驗程序。病原菌以分離培養鑒定為主，病毒以檢測抗體為主，寄生蟲以鏡檢為主。七、實驗動物的微生物和寄生蟲控制國家標準不同等級嚙齒類、兔、犬和猴等實驗動物要求排除的細菌、病毒應根據國家技術監督局制定的有關實驗動物微生物學等級及監測標準(GB14922.2—2011)。有關實驗動物寄生蟲學等級及監測標準是(GB14922.1—2011)

。大小鼠—清潔級、SPF級、無菌級豚鼠、地鼠、兔–

普通級、清潔級、SPF級、無菌級犬、猴—普通、SPF群體規模取樣數量<100>5100—500>10500>20每一隔離器2只1、取樣原則：

隨機抽樣

依群體大小取樣：

檢查抗體選擇成年淘汰動物，而病原體選幼年動物2、檢測時間與頻率：3、檢測步驟動物編號外觀檢查麻醉（體外寄生蟲檢查）

皮膚取樣（真菌的檢查）取血（血清檢查病毒或其它病原微生物抗體）無菌解剖（臟器、腸內容物、糞便、體內寄生蟲檢查）（氣管分泌物、腸內容物、臟器分離細菌）檢測檢測報告檢測項目的分類國標對必須檢測和必要時檢測作了限定性說明：“必須檢測項目：是指在進行實驗動物質量評價時必須檢測的項目。必要時檢測項目：是指從國外引進實驗動物時、懷疑有本病流行時、申請實驗動物生產許可證和實驗動物質量合格證時必須檢測的項目”。監測方法：1.

實驗動物病毒檢測：血清學診斷：血凝抑制試驗（HI）；酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。病原學檢查：接種細胞培養物觀察CPE出現（鼠痘、鼠肝炎）；血吸附試驗（仙臺病毒）；免疫酶試驗（LCM病毒）。連續三次傳代未有病毒跡象為陰性。接種敏感動物，觀察發病、抗體產生、病理改變、接種動物病毒再分離。動物組織細胞傳代培養。3）病毒顆粒、抗原和核酸的檢出光鏡檢查病理改變或包涵體的存在；電鏡檢查組織內或排泄物中的病毒顆粒；