ICSCCSB41GB/T42117—2022DiagnostictechniquesforovineTheileriainfection2022-12-30發布國家標準化管理委員會國家市場監督管理總局發布國家標準化管理委員會IGB/T42117—2022本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由中華人民共和國農業農村部提出。本文件由全國動物衛生標準化技術委員會(SAC/TC181)歸口。本文件起草單位：中國農業科學院蘭州獸醫研究所。1GB/T42117—2022羊泰勒蟲病診斷技術本文件規定了羊泰勒蟲病的臨床診斷和綜合判定的技術要求，描述了羊泰勒蟲病病原(呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲)血涂片顯微鏡檢測和聚合酶鏈式反應檢測方法。本文件適用于羊泰勒蟲病病原檢測、泰勒蟲隱性感染及臨床病例的診斷。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款，其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析試驗用水規格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求3術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。4縮略語下列縮略語適用于本文件。DNA:脫氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcid)PBS:磷酸鹽緩沖液(PhosphateBufferedSaline)PCR:聚合酶鏈式反應(PolymeraseChainReaction)TAE:核酸電泳緩沖液(Tris-Aceticacid-EDTA)5生物安全要求樣品采集、處理及檢測過程中涉及的實驗操作，應符合GB19489的相關規定。6臨床診斷6.1典型臨床癥狀6.1.1動物精神沉郁，體溫升高至40℃~42℃,呈稽留熱。6.1.2眼結膜充血腫脹，貧血或可視黏膜黃染。2GB/T42117—20226.3.1多發于4月～9月，流行于青海血蜱和長角血蜱(見附錄B)分布區域。6.3.2患病動物體表可見蜱或有蜱叮咬史。病畜出現典型臨床癥狀(6.1)和典型病理變化(6.2),并符合流行特點(6.3),可判為疑似羊泰勒蟲病。7血涂片顯微鏡檢測7.1.4香柏油。7.2.2載玻片。并迅速晾干。7.5血涂片固定將姬姆薩染色液工作液滴加到甲醇固定好的血涂片上，室溫染色30min后，用自來水充分沖洗掉3血涂片上接近末梢位置滴加一滴香柏油，在1000倍(10×100)光學顯微鏡下觀察100個視野。8.1.8DNA分子量標準品。8.1.13陰性對照：篩選泰勒蟲陰性羊，采集頸靜脈血，提取全血總DNA,稀釋至1ng/μL作為陰性48.2.5電泳儀。8.2.6水平電泳槽。8.2.7凝膠成像儀。8.3樣品采集采集待檢羊頸靜脈血液至含抗凝劑的采血管中，樣品采集后可立即用全血基因組提取試劑盒提取DNA,或保存于2℃~8℃,但不應超過48h。如需長期保存，可將血液樣品分裝后-20℃保存，避免反復凍融。在樣本制備區提取基因組DNA。采用商品化的全血基因組提取試劑盒提取DNA,提取步驟按照說明書進行。提取好的DNA立即進行PCR擴增或—20℃保存。8.5PCR反應體系及條件8.5.1基本要求PCR反應體系應在潔凈區配制后，在樣本處理區加入待檢DNA樣本，并設置陰陽性對照。8.5.2呂氏泰勒蟲PCR檢測反應體系及條件PCR反應體系如下：——12.5μL的2×PremixTaq;瞬時離心后，置PCR擴增儀內進行擴增。擴增程序為：95℃預變性3min;94℃變性30s,55℃退火1min,72℃延伸1min,共35個循環；72℃延伸7min。8.5.3尤氏泰勒蟲PCR檢測反應體系及條件瞬時離心后，置PCR擴增儀內進行擴增。擴增程序為：95℃預變性3min;94℃變性30s,58℃退火1min,72℃延伸1min,共35個循環；72℃延伸10min。8.6PCR產物瓊脂糖凝膠電泳及成像中進行電泳，凝膠成像分析系統觀察結果并拍照。5GB/T42117—2022呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲標準陽性樣品均擴增出380bp大小的特異性條帶，標準陰性對照無擴增泰勒蟲核酸陽性；待檢樣品在尤氏泰勒蟲檢測體系中擴增出380bp大小的條帶，可判定為尤氏泰勒蟲核酸陽性。按照附錄F給出的PCR檢測結果判定標準圖進行判定。9綜合判定符合6.4,并符合7.8.1或者8.7.2判定為羊泰勒蟲病陽性。不符合6.4,但符合7.8.1或者8.7.2判定為羊泰勒蟲隱性感染。6泰勒蟲病典型病理圖片A.1感染泰勒蟲后腸道病理變化泰勒蟲感染會導致宿主腸系膜黃染、腸道出血，病理變化如圖A.1所示。圖A.1泰勒蟲感染羊腸道病理圖A.2感染泰勒蟲后胃部病理變化泰勒蟲感染會導致胃漿膜、黏膜出血及潰瘍，病理變化如圖A.2所示。a)胃黏膜出血及潰瘍b)胃漿膜表面出血圖A.2泰勒蟲感染胃部病理圖GB/T42117—2022(資料性)B.1青海血蜱形態如圖B.1所示。a)青海血蜱背面b)青海血蜱腹面圖B.1青海血蜱形態圖B.2長角血蜱形態如圖B.2所示。a)長角血蜱背面b)長角血蜱腹面圖B.2長角血蜱形態圖8GB/T42117—2022(規范性)試劑配制方法C.1姬姆薩染色液儲存液全部甘油，55℃~60℃水浴加熱1h～2h,期間不斷搖動混勻。冷卻至室溫后加入甲醇，混勻儲存在棕色瓶中室溫靜置6個月，三層濾紙過濾備用。C.2姬姆薩染色液工作液按每毫升無離子水加200μL姬姆薩染色液儲存液進行配制，現配現用。C.3TAE電泳緩沖液的配制溶解，充分混勻后加雙蒸水補齊至1000mL。1×TAE緩沖液：取10mL貯存液加490mL雙蒸水即為1×TAE緩沖液。C.410mg/mL溴化乙錠稱取溴化乙錠1g,加蒸餾水定容至100mL,磁力攪拌充分溶解后，棕色瓶內室溫保存。C.51.5%瓊脂糖凝膠與凝膠塊制備將瓊脂糖1.5g放入100mL1×TAE緩沖液中，加熱融化，溫度降至60℃左右時，加入溴化乙錠9(規范性)D.1呂氏泰勒蟲典型蟲體形態紅細胞內呂氏泰勒蟲典型形態如圖D.1所示。圖D.1紅細胞內呂氏泰勒蟲典型形態圖(箭頭所示)D.2尤氏泰勒蟲典型蟲體形態紅細胞內尤氏泰勒蟲典型形態如圖D.2所示。圖D.2紅細胞內尤氏泰勒蟲典型形態圖(箭頭所示)GB/T42117—2022(規范性)呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲陽性質粒制備E.1呂氏泰勒蟲18SrRNA基因片段(389bp)GGTAGGGTATTGGCCTACTGAGGCAACGACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGACACAGGGAGGTAGTGACAAGAAATAACAATACGGGGCTTAATGTCTTGTAATTGGAATGATGGGAATTTAAACCTCTTCCAGAGTATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAATTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAATTTCTGCTGCATTGCATCTTCTTTTTGATGAGTTGGTGTATTGTGGCTTATTTCGGATGATACTTGTATTATCCGGATGAE.2尤氏泰勒蟲18SrRNA基因片段(388bp)GGTAGGGTATTGGCCTACCGGGGCAACGACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCTAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGACACAGGGAGGTAGTGACAAGAAATAACAATACGGGGCTTAACGTCTTGTAATTGGAATGATGGGAATCTAAACCTCTTCCAGAGTATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAATTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAATTTCTGCCGCCCCGCCTCTGCCCCTCGACGGGCGTTTGCGCCGCGGCTTTTTCGGATTATGCTTGCATTTTCCGAGTGTE.3制備呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲陽性質粒按照E.1和E.2提供的序列合成基因片段，將合成的基因片段與克隆載體pGEM-Teasy質粒4℃過夜連接(按照相應的說明書操作);重組后的質粒轉化至JM109或Trans5α感受態細胞中，LB固體培養基中37℃過夜培養后挑取單克隆菌，在LB液體培養基中37℃過夜培養后取部分菌液提取質粒進行測序驗證，剩余菌液4℃保存。將測序結果正確的克隆菌在100mLLB培養基中37℃過夜培養后提取質粒并測定濃度，將相應的質粒稀釋至質量濃度1ngμL,分裝后-20℃保存，作為陽性對照。GB/T4