DB32/T××××—2019PAGE4豬鏈球菌9型PCR檢測技術規程范圍本標準規定了豬鏈球菌9型PCR檢測技術所用的儀器設備和主要試劑、引物、方法步驟、結果判定、廢棄物處理和防止污染的措施等要求。本標準適用于豬鏈球菌9型的PCR檢測。規范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T

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分析實驗室用水規格和試驗方法NY/T541獸醫診斷樣品采集、保存與運輸技術規范《病死及病害動物無害化處理技術規范》（農醫發〔2017〕25號）術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1豬鏈球菌9型Streptococcussuisserotype9屬于鏈球菌屬的一種細菌，根據其莢膜多糖抗原的差異，可分為1-31、33及1/2共33個血清型。豬鏈球菌9型是豬鏈球菌的一個血清型，不僅對豬致病性很強，而且可以感染特定的人群，是一種人獸共患病病原菌。4儀器設備和主要試劑4.1儀器設備高速離心機、水浴鍋、PCR儀、核酸電泳儀、凝膠成像系統。4.2主要試劑生理鹽水、超純水、蛋白酶K、2×PCRMix、瓊脂糖（電泳級）、DNA分子量標準（DL2000Marker）。5引物5.1上游引物：5′-GGCTACATATAATGGAAGCCC-3′。5.2下游引物：5′-CCGAAGTATCTGGGCTACTG-3′。6方法步驟6.1樣品處理6.1.1病料樣品處理采用差速離心法，取約5g病料（肝或肺或腦組織），剪碎研磨，用5mL生理鹽水混懸，先2000r/min離心2min，去除大組織塊，取上清液，后10000r/min離心5min，棄上清液，沉淀以200μL超純水重懸，備用。6.1.2待檢培養物樣品處理取待檢液體培養物（純培養物或混合培養物）1mL10000r/min離心5min，棄上清，沉淀以200μL超純水重懸，備用。陰性對照：THB培養基。陽性對照：豬鏈球菌9型標準菌株（22083）的THB培養物。陰性、陽性對照也同樣處理，對每個樣品進行編號標記。6.2DNA提取取6.1獲得的樣品及對照，每200μL加入3μL蛋白酶K（20mg/mL），42℃作用1h，煮沸5min，10000r／min離心5min，上清作為模板DNA。6.3PCR擴增6.3.1反應條件按25μL體系進行，2×PCRMix12.5μL，上游引物（10pmol/μL）1.0μL，下游引物（10pmol/μL）1.0μL，模板DNA2.0μL，超純水8.5μL。按如下條件進行PCR反應。95℃5min，然后進入循環94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，35個循環，于72℃延伸10min，4℃保存。6.3.2電泳將PCR反應產物于1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳，電壓為120V，時間30min。6.3.3結果觀察用凝膠成像系統觀察結果，并進行拍照。7結果判定7.1檢測結果成立條件陽性對照的PCR產物電泳后在389bp的位置上出現一條特異性條帶，陰性對照PCR產物電泳后沒有條帶（見附錄A），檢測結果成立；否則，結果不成立。7.2結果判定7.2.1在檢測結果成立的前提下，如果檢測樣品中PCR產物電泳后在389bp的位置上出現一條特異性條帶，判為陽性，即該樣品為豬鏈球菌9型核酸陽性。7.2.2在檢測結果成立的前提下，如果檢測樣品中PCR產物電泳后在389bp的位置上未出現一條特異性條帶，判為陰性，即該樣品為豬鏈球菌9型核酸陰性。7.2.3如果陽性對照無相應的目的條帶，可能是存在操作失誤，該檢測需要重復進行；如果陰性對照有相應的目的條帶，可能是陰性對照存在污染或是操作失誤，該檢測需要重復進行。8廢棄物處理和防止污染的措施檢測過程中的廢棄物，應做好無害化處理。檢測過程中防止交叉污染的措施見附錄B。附錄A(資料性附錄)豬鏈球菌9型PCR產物電泳圖M12M122000bp——1000bp2000bp——1000bp——750bp——500bp——250bp——100bp————389bpM——DNA分子量標準（DL2000Marker）；1——陽性對照；2——陰性對照。圖A.1豬鏈球菌9型PCR產物電泳圖

附錄B(規范性附錄)檢測過程中防止交叉污染的措施B.1抽樣和制樣過程抽樣和制樣工具，應清洗干凈，121℃，15min～20min滅菌，一套清潔工具限于一個樣品使用。存放樣品的容器應該經過清洗、滅菌，或為一次性滅菌容器。B.2檢測過程B.2.1PCR實驗室應分為樣品制備區、前PCR區、PCR區、后PCR區。將模板提取、PCR反應液配制、PCR循環擴增及PCR產物的鑒定等步驟分區或分室進行。實驗室的運作應從“凈區”到“臟區”單方向進行。B.2.2實驗過程中，應穿實驗服和戴手套，手套要經常更換。各區要有專用實驗服，經常清洗。B.2.3各區所有的試劑、器材(尤其是移液器)、儀器都應專用，不得帶出該區。B.2.4所有溶液、水、耗材和器具要121℃，15min～20min滅菌，避免核酸和(或)核酸酶污染。每種溶液應使用高質量的成分和超純水。所有試劑應該以大體積配制，然后分裝成僅夠一次使用的量進行貯存。B.2.5裝有DNA模板或