ICSCCS65.020.20苜蓿黃萎病菌溯源檢測方法國家標準化管理委員會國家市場監督管理總局發布國家標準化管理委員會IGB/T43163—2023本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由全國植物檢疫標準化技術委員會(SAC/TC271)提出并歸口。本文件起草單位：中華人民共和國深圳海關、深圳市檢驗檢疫科學研究院。1GB/T43163—2023苜蓿黃萎病菌溯源檢測方法1范圍本文件描述了應用基因片段和生物信息學分析方法對苜蓿黃萎病菌進行溯源檢測的方法。本文件適用于苜蓿黃萎病菌相關寄主植物材料中攜帶的苜蓿黃萎病菌的溯源檢測。2規范性引用文件本文件沒有規范性引用文件。3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1鄰接法neighbor-joining基于最小演化準則的迭代聚類方法。4方法原理苜蓿黃萎病菌，拉丁名Verticilliumalbo-atrumReinkeetBerthold,基本信息見附錄A。溯源是利用對物種有進化和溯源價值的基因片段將核酸序列信息與來源地、寄主等來源信息進行相關性歸類。檢測過程是應用生物信息學的分析手段篩選有效區分種內差異并且有效歸類的基因片段或分子標記，獲得這些基因片段或分子標記的核酸序列，應用統計學手段完成核酸序列與來源地、寄主信息的主成分分析，完成不同來源地、寄主個體的群體分子系統進化關系和群體結構分析，基于基因序列的相似5儀器和試劑5.1儀器與試驗用具5.2試劑馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA):200g去皮土豆切成小方塊，加入1000mL無菌水，煮沸15min,四層紗布過濾得到濾液，濾液中加入18g葡萄糖、18g瓊脂粉，加熱溶解后將溶液定容至2GB/T43163—20236溯源檢測方法6.1DNA提取與純化對真菌進行液體培養或平板培養，按附錄B中CTAB法對基因組DNA進行提取，溶解于無菌超純水中，測定DNA濃度及純度后，保存于—20℃6.2基因片段或分子標記的擴增與測序內部轉錄間隔區(ITS片段)作為溯源分析的基因片段進行PCR擴增(具體步驟見附錄C),測序。測序結果利用通用序列編輯軟件進行剪接編輯，比對峰圖和正反向測序結果是否有誤，去掉兩端引物部分序列。6.3分子系統進化分析將拼接的序列導入通用分子系統進化分析軟件，同時導入苜蓿黃萎病菌溯源序列排列文件mas格式或meg格式，對全部序列進行排列，排列結果見附錄D。對排列后的mas格式文件，基于鄰接法構建分子系統進化樹(見附錄E)。選擇Bootstrap檢驗1000次重復，其他參數選擇默認參數。7結果判定根據待分析序列在系統進化樹上與已溯源苜蓿黃萎病菌的分支聚集結果進行判定。——如果序列與已溯源菌株序列聚為一支，且自展值為100%,即可判定該物種序列與已知溯源信息序列具有相同的來源地、寄主信息。——如果序列與已溯源菌株序列未與任一物種序列聚為一支，需結合網絡進化圖做出判定。在構建的網絡進化圖中尋找待分析序列的進化分支起源點和方向，確認突變衍化歷史。——如同一分支起源點的其他方向分支信息具有相關性，則可判定待分析個體與同一起源點不同個體的來源地和寄主信息具有相關性。——如果同一分支起源點無其他方向分支，則無法判定待分析個體的來源地和寄主信息。8樣品與原始數據集保存8.1樣品保存分離得到的菌種轉移至馬鈴薯葡萄糖斜面培養基，置于4℃黑暗條件下保存至少6個月，以備復8.2結果記錄與資料保存和審核人員簽字。PCR凝膠電泳檢測需有電泳結果照片，序列需要保存電子文件。3GB/T43163—2023(資料性)A.1基本信息分類地位：Fungi,Plectosphaerellaceae,Glomerellales,Hypocreomycetidae,Sordariomycetes,As-comycota。A.2寄主范圍narium、栽培向日葵Helianthusannuusvar.marcocarpus、律草屬Humulus、啤酒花HumulusA.3地理分布A.4癥狀4GB/T43163—2023(規范性)基因組DNA制備B.1.1試驗器皿于121℃、30min濕熱滅菌或180℃干熱滅菌1h。B.1.2從培養基上刮取100mg左右的菌絲體至研缽內，加入液氮充分研磨，加入4mL預熱的CTAB抽提液。B.1.3將離心管放入水浴鍋前先振蕩1min,然后放入65℃水浴鍋水浴15min,每隔3min～5min振B.1.4加入等體積三氯甲烷，用移液器混勻1min,水浴10min;4℃,12000g離心15min,取上清液加等體積異丙醇，輕輕搖勻，然后—20℃靜置15min。B.1.54℃,12000g離心15min,小心去除上清液，留沉淀；加70%預冷酒精，洗滌3次，放于通風處干燥；加入50μL～100μL滅菌的去離子水溶解DNA。B.2DNA濃度及純度測定用核酸蛋白分析儀測定DNA的純度與濃度，分別取得260nm和280nm處的吸收值，計算核酸的純度和濃度，按照公式(B.1)計算DNA純度，按照公式(B.2)計算DNA濃度：…………(B.1)p=50×OD?60…………(B.2)式中：Conc.DNA純度；p---—DNA質量濃度，單位為微克每毫升(μg/mL);OD?60——260nm處吸光光度值，核酸的吸光度；計算結果保留一位小數。PCR級DNA溶液的OD?60/OD?8o比值為1.7～1.9。5GB/T43163—2023(資料性)C.1.1反應條件94℃預變性4min;94℃變性30s,56℃復性20s,72℃延伸30s,40個循環；72℃延伸7min。C.1.3擴增體系及條件擴增反應的組成成分見表C.1。組分加樣量10×PCR緩沖液2.5mmol/LdNTPs前向引物(10μmol/L)后向引物(10μmol/L)5U/μLTaq酶補無菌水至反應用雙蒸水作空白對照，陽性對照采用含有苜蓿黃萎病菌的DNA作為模板，每個樣品重復2次。C.2測序與序列處理擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離，使用DNA標記參照，經DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化，采用核酸蛋白分析儀對DNA進行定量檢測。測序引6>AB353342.1Japan-Potato/SolanumtuberosumCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGCGCCGCCGGTACTCAGTCTCTTTATTCATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAACAGGATCTCTTGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTGGGATCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGCATCGGAGTCCC>DQ266223.1England-Hop/HumuluslupulusCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGCGCCGCCGGTACTCAGTCTCTTTATTCATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAACAGGATCTCTTGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTGGGATCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGCATCGGAGTCCC>GQ495790.1Canada-Alfalfa/MedicagosativaCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGCGCCGCCGGTACTCAGTCTCTTTATTTATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAACAGGATCTCTTGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTGGGATCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGCATCGGAGTCCCGC>AF108476.1Canada-Alfalfa/MedicagosativaCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGCGCCGCCGGTACTCAGTCTCTTTATTTATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAACAGGATCTCTTGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTGGGATCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGCATCGGAGTCC>★AB458830.1Xinjiang,China-Alfalfa/MedicagosativaCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGCGCCGCCGGTACTCAGTCTCTTTATT7GB/T43163—2023CATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAACAGGATCTCTTGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTGGGATCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGCATCGGAGTCC>JQ629956.1Slovenia-Hop/HumuluslupulusCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGCGCCGCCGGTACTCAGTCTCTTTATTCATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAACAGGATCTCTTGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTGGGATCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGCATCGGAGTCC>DQ825977.1USA-ApiumgraveolensCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGCGCCGCCGGTACTCAGTCTCTTTATTCATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAACAGGATCTCTTGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTGGGATCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGCATCGGAGTCCCGC>AF364015.1Belgium-Hop/HumuluslupulusCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGCGCCGCCGGTACTCAGTCTCTTTATTCATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAACAGGATCTCTTGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTGGGATCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGCATCGGAGTCCCGC>AY555954.1MiddleAsia-Cotton/Gossypiumspp.CCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGCGCCGCCGGTACTCAGTCTCTTTATTCATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAACAGGATCTCTTGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTGGGATCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGCATCGGAGTCCCGC8GB/T43163—2023>AF364014.1Netherlands-Tomato/LycopersiconesculentumCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGCGCCGCCGGTACTCAGTCTCTTTATTCATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAACAGGATCTCTTGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTGGGATCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGCATCGGAGTCCCGC>AY555953.1UK-Hop/HumuluslupulusCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGCGCCGCCGGTACTCAGTCTCTTTATTCATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAACAGGATCTCTTGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTGGGATCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGCATCGGAGTCCC>★FJ900212.1USA-Alfalfa/MedicagosativaCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGCGCCGCCGGTACTCAGTCTCTTTATTTATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAACAGGATCTCTTGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTGGGATCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGCATCGGAGTCCC>★GQ336791.1USA-Alfalfa/MedicagosativaCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGCGCCGCCGGTACTCAGTCTCTTTATTTATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAACAGGATCTCTTGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTGGGATCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGCATCGGAGTCCC>★GQ336790.1USA-Alfalfa/MedicagosativaCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGCGCCGCCGGTACTCAGTCTCTTTATTTATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAACAGGATCTCTTGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTGGGATCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGCATCGGAGTCCC9GB/T43163—2023>★GU291258.1USA-Alfalfa/MedicagosativaCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGCGCCGCCGGTACTCAGTCTCTTTATTTATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAACAGGATCTCTTGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTGGGATCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGCATCGGAGTCCC>★AF364013.1USA-Alfalfa/MedicagosativaCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGCGCCGCCGGTACTCAGTCTCTTTATTTATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAACAGGATCTCTTGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTGGGATCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGCATCGGAGTCCC>AF364010.1Canada-Alfalfa/MedicagosativaCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGCGCCGCCGGTACTCAGTCTCTTTATTTATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAACAGGATCTCTTGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTGGGATCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGCATCGGAGTCCC>AY536046.1Iran-Alfalfa/MedicagosativaCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGCGCCGCCGGTACTCAGTCTCTTTATTTATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAACAGGATCTCTTGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTGGGATCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGCATCGGAGTCCC>AF364011.1Canada-Alfalfa/MedicagosativaCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGCGCCGCCGGTACTCAGTCTCTTTATTTATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAACAGGATCTCTTGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTGGGATCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGCATCGGAGTCCC>★AY555955.1USA-Alfalfa/MedicagosativaCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGCGCCGCCGGTACTCAGTCTCTTTATTTATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAACAGGATCTCTTGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTGGGATCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGCATCGGAGTCCC>★JQ629951.1Xinjiang,China-Alfalfa/MedicagosativaCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGCGCCGCCGGTACTCAGTCTCTTTATTTATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAACAGGATCTCTTGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTGGGATCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGCATCGGAGTCCC>AY536045.1Iran-Alfalfa/MedicagosativaCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGCGCCGCCGGTACTCAGTCTCTTTATTTATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAACAGGATCTCTTGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTGGGATCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGCATCGGAGTCCC>KC592083.1Australia-Potato/SolanumtuberosumCCCTTTGTGACCAAATTGTTGCTTGGGCTCGTCCGCGCCGCCGGTACTCAGTCTCTATATTTTTACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAACAGGATCTCTTGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCTAGTGGCCGGTGTTGGGATCTACTTCTGTAGGCCCTTAAAATCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTTTCGCTCGCATCGGAGTCCCGTAGCACCAGCCTCTAAACCCCTCAAGCCCGTCTCGTACGCAAC>DQ825978.1Netherlands-butterbur/PetasiteshybridusCCCTTTGTGACCAAATTGTTGCTTGGGCTCGTCCGCGCCGCCGGTACTCAGTCTCTATATTTTTACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAACAGGATCTCTTGCGB/T43163—2023TCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCTAGTGGCCGGTGTTGGGATCTACTTCTGTAGGCCCTTAAAATCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTTTCGCTCGCATCGGAGTCCCGTAGCACCAGCCTCTAAACCCCTCAAGCCCGTCTCGTACG>JQ629954.1MiddleAsia-Cotton/Gossypiumspp.CCCTTTGTGACCAAATTGTTGCTTGGGCTCGTCCGCGCCGCCGGTACTCAGTCTCTATATTTTTACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAACAGGATCTCTTGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTGGGATCTACTTCTGTAGGCCCTTAAAATCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTTTCGCTCGCATCGGAGTCCCGTAGCACCAGCCTCTAAACCCCTCAAGCCCGTCTCGTACG>FJ424082.1USA-AilanthustreeCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGCGCCGCCGGTACTCAGTCTCTTTATTCATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAACAGGATCTCTTGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTGGGATCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGCATCGGAGTCCC>★JN187990.1USA-Potato/SolanumtuberosumCCCTTTGTGACCAAATTGTTGCTTGGGCTCGTCCGCGCCGCCGGTACTCAGTCTCTATATTTTTACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAACAGGATCTCTTGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCTAGTGGCCGGTGTTGGGATCTACTTCTGTAGGCCCTTAAAATCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTTTCGCTCGCATCGGAGTCCCGTAGCACCAGCCTCTAAACCCCTCAAGCCCGTCTCGTACG>HE972035.1Netherlands-Tomato/LycopersiconesculentumCCCTTTGTGACCATATTGTTGCTTGGGCTCGTTCGCGCCGCCGGTACTCAGTCTCTTTATTCATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAATTTTAACAGGATCTCTTGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAGCGATTGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCGGTGTTGGGATCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGCATCGGAGTCCC>JN187994.1UK-Potato/SolGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCACTTTGTGAACCAAATTGTTGCTTCGGCGGCTCGTCCATATTTTTACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTACGAACTATTAAAAATCTCTTGGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATATGTAAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCCAGTATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCTAGTGGCCCGGTGCTGTAGGCCCTTAAAATCAGTGGCGGACCCGCGTGG>JQ629955.1Netherlands-TomatoTCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTATCATATTGTTGCTTCGGCGGCTCGTTCTGCGAGCCCGCCGGTACATCAGCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTAGCGAACTATTAAATCTAGCACCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATATGTAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCCAGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCCGGTTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCCTTGCGTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTA>HE972034.1Belgium-Hop/HumuluslupulusCCCTTTGTGAACCATATTGTT-GCTTCGGCGGCTCGCTCTTTATTCATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCAACGGATCTCTTGGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATGAGGCATGCCTGTCCGAGCGT>HE972033.1UK-Alfalfa/MedicagosaCCCTTTGTGAACCATATTGTT-GCTTCGGCGGCTCGCTCTTTATTCATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCAACGGATCTCTTGGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGGB/T43163—2023>HE972032.1USA-Potato/SolanumtuberosumCCCTTTGTGAACCATATTGTT-GCTTCGGCGGCTCGTTCTGCGAGCCCGCCGGTACATCAGTCTCTTTATTCATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTAGCGAACTATTAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATATGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCCGGTGTTGGGGATCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCCTTGCGTAGTAATTAGCAAC>JQ629953.1Belgium-Hop/HumuluslupulusTCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTATCTACTCATAACCCTTTGTGAACCATATTGTTGCTTCGGCGGCTCGTTCTGCGAGCCCGCCGGTACATCAGTCTCTTTATTCATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTAGCGAACTATTAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATATGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCCGGTGTTGGGGATCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGCATCCCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA>JQ629952.1UK-Potato/SolanumtuberosumTCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTATCTACTCATAACCCTTTGTGAACCATATTGTTGCTTCGGCGGCTCGTTCTGCGAGCCCGCCGGTACATCAGTCTCTTTATTCATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTAGCGAACTATTAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATATGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCCGGTGTTGGGGATCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCCTTGCGTAGTAATTACAGCTCGCATCGGAGTCCCGCAGGCACTTGCCTCTAAACCCCCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA>AY536044.1Iran-Alfalfa/MedicagosativaCCCTTTGTGAACCATATTGTT-GCTTCGGCGGCTCGTTCTGCGAGCCCGCCGGTACATCAGTCTCTTTATTTATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTAGCGAACTATTAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATATGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCCGGTGTTGGGGATCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCCTTGCGTAGTAATT>AF364008.1Canada-AlCCCTTTGTGAACCATATTGTT-GCTTCGGCGGCTCGCTCTTTATTTATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCAACGGATCTCTTGGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCC>JQ629950.1Xingjiang,China-Alfalfa/MedicagosativaTCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTATCATATTGTTGCTTCGGCGGCTCGTTCTGCGAGCCCGCCGGTACATCACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTAGCGAACTATTAGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATATGGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCCCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCCCCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTACCCTTTGTGAACCATATTGTT-GCTTCGGCGGCTCGCTCTTTATTTATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCAACGGATCTCTTGGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCTTTGTGAACCATATTGTT-GCTTCGGCGGCTCGCTCTTTATTTATACCAACGATACTTCTGAGTGTTCAACGGATCTCTTGGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCTACGTCTGTAGGCCCTTAAAAGCAGTGGCGGACCCGB/T43163—2023>DQ825979.1UK-UrticadioicaCCCTTTGTGAACCAAATTGTTTGCTTCGGCGGCTCGTCC-GCGAGCCCGCCGGTACATCAGTCTCTATATTTTTACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTA-CGAACTATTAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATATGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCAGTGGCCCGGTGTTGGGGATCTACTTCTGTAGGCCCTTAAAATCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCCTTGCGTAGTAATTTTCGCTCGCATCGGAGTCCCGTAGGCACCAGCCTCTAAACCCCCTACAAGCCCGTCTCG>AF364016.1Netherlands-S.tuberosumCCCTTTGTGAACCAAATTGTT-GCTTCGGCGGCTCGTCC-GCGAGCCCGCCGGTACATCAGTCTCTATATTTTTACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTA-CGAACTATTAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATATGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCTAGTGGCCCGGTGTTGGGGATCTACTTCTGTAGGCCCTTAAAATCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCCTTGCGTAGTAATTTTCAAC>JN188015.1UK-Potato/SolanumtuberosumCCCTTTGTGAACCAAATTGTT-GCTTCGGCGGCTCGTCC-GCGAGCCCGCCGGTACATCAGTCTCTATATTTTTACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTA-CGAACTATTAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATATGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCTAGTGGCCCGGTGTTGGGGATCTACTTCTGTAGGCCCTTAAAATCAGTGGCGGACCCGCGTGGCCCTTCCTTGCGTAGTAATTTTCAAC>JN188016.1UK-Potato/SolanumtuberosumCCCTTTGTGAACCAAATTGTT-GCTTCGGCGGCTCGTCC-GCGAGCCCGCCGGTACATCAGTCTCTATATTTTTACCAACGATACTTCTGAGTGTTCTTA-CGAACTATTAAAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATATGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATGGCGCCTTCCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCA