關于遺傳代謝性疾病的基因診斷

主要內容前言一、基因診斷技術二、遺傳代謝性疾病的基因診斷第2頁,共77頁，星期六，2024年，5月細胞、組織、器官和機體的生存與功能維持都必須依賴不斷進行的物質代謝過程。物質代謝包括合成代謝及分解代謝兩個過程。代謝性疾病是物質代謝過程的紊亂，多為酶或蛋白異常所致。根據代謝性疾病的病因，可將其分為原發性和繼發性。

前言

返回章二、代謝性疾病的診斷手段一、代謝性疾病的分類第3頁,共77頁，星期六，2024年，5月一、代謝性疾病的分類原發性代謝性疾病：又叫先天性代謝性疾病。是指當編碼物質代謝所需酶或蛋白的基因發生突變、不能合成或合成了無活性的產物時，就會導致有關代謝途徑不能正常運轉，造成具有不同臨床表型的各種代謝缺陷病。繼發性代謝性疾病：繼發性代謝性疾病是由其它原發性疾病導致的代謝性疾病，如糖尿病導致的繼發性高脂血癥。

返回節第4頁,共77頁，星期六，2024年，5月二、代謝性疾病的診斷手段過去：主要依靠與物質代謝相關的各種酶的生物化學方面的診斷現在：生化診斷+基因診斷

返回節第5頁,共77頁，星期六，2024年，5月基因診斷的概念

基因診斷就是利用現代分子生物學和分子遺傳學的技術方法,直接檢測基因結構及其表達水平是否正常,從而對疾病作出診斷的方法。

返回節第6頁,共77頁，星期六，2024年，5月基因診斷的特點針對性強特異性高靈敏度高適用性強診斷范圍廣

返回節第7頁,共77頁，星期六，2024年，5月

第一節基因診斷技術二.聚合酶鏈反應技術三.毛細管電泳技術四.基因芯片技術一.DNA測序技術

返回章第8頁,共77頁，星期六，2024年，5月一、DNA測序技術

所有生物基因組序列的數據均來自DNA測序特點:穩定簡便自動化程度高數據準確可靠公認為國際金標準

返回節第9頁,共77頁，星期六，2024年，5月雙脫氧鏈終止法原理:測序基礎是以ddNTP為測序反應的鏈終止劑摻入到延伸鏈中的ddNTP可阻止后續ddNTP或dNTP的摻入

返回節第10頁,共77頁，星期六，2024年，5月

返回節第11頁,共77頁，星期六，2024年，5月示例：BigDye?Terminators循環測序反應擴增到未端為BigDye?Terminators的一系列的核苷酸鏈。循環測序反應產物經沉淀、洗滌和純化，從而去除多余的未反應的BigDye?Terminators。電泳與結果分析。

返回節第12頁,共77頁，星期六，2024年，5月

返回節第13頁,共77頁，星期六，2024年，5月焦磷酸測序技術原理:

引物與模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶等4種酶的協同作用下，將每一個dNTP的聚合與一次熒光信號的釋放偶聯起來，通過檢測熒光的釋放和強度，以熒光信號的形式實時記錄模板DNA的核苷酸序列。

返回節第14頁,共77頁，星期六，2024年，5月

返回節ABDNAPolymeraseACCTTGAATTCGTCCTAGGA……GGATCTT……dNTPApyrase(d)NMPPPiATPATP-sulphurylaseLuciferaseLightCTGCTTAAAGTCAGTCAGTCAGTC第15頁,共77頁，星期六，2024年，5月基本流程：第1步一個特異性的測序引物和單鏈DNA模板結合，然后加入酶混合物(包括DNAPolymerase、ATPSulfurylase、Luciferase和三磷酸腺苷雙磷酸酶Apyrase)和底物混合物(包括腺苷酰硫酸APS和Luciferin)。

返回節第16頁,共77頁，星期六，2024年，5月基本流程：第2步向反應體系中加入1種dNTP，如果它剛好能和DNA模板的下一個堿基配對，則會在DNA聚合酶的作用下，添加到測序引物的3’末端，同時釋放出一個分子的焦磷酸(PPi)。

返回節(DNA)n+dNTP(DNA)n+1+PPi聚合酶第17頁,共77頁，星期六，2024年，5月基本流程：第3步在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS結合形成ATP；在熒光素酶的催化下，生成的ATP又可以和熒光素結合形成氧化熒光素，同時產生可見光。通過CCD光學系統即可獲得一個特異的檢測峰，峰值高低則和相匹配的堿基數成正比。

返回節第18頁,共77頁，星期六，2024年，5月基本流程：第4步反應體系中剩余的dNTP和殘留的少量ATP在Apyrase的作用下發生降解。

返回節dNTPdNDP+dNMP+PiATPADP+AMP+PiATP雙磷酸酶ATP雙磷酸酶第19頁,共77頁，星期六，2024年，5月基本流程：第5步加入另一種dNTP，使第2－4步反應重復進行，根據獲得的峰值圖即可讀取準確的DNA

序列信息

返回節DNA序列GGCC-TAAGGGCCCTT核苷酸遞增第20頁,共77頁，星期六，2024年，5月

返回節焦磷酸鹽測序法步驟第21頁,共77頁，星期六，2024年，5月二、聚合酶鏈反應技術PCR是體外酶促合成特異DNA片段的方法。四種主要成分：

DNA模板、引物、DNA聚合酶和dNTP。三個反復步驟：

高溫變性、低溫退火和適溫延伸。

返回節第22頁,共77頁，星期六，2024年，5月三、毛細管電泳技術毛細管電泳統指以高壓電場為驅動力，以毛細管為分離通道，依據試樣中各組分間淌度和分配行為上的差異來實現分離的一類分離技術。基本原理是根據在電場作用下離子遷移的速度不同而對組分進行分離和分析。

返回節第23頁,共77頁，星期六，2024年，5月

返回節變性高效液相色譜(DHPLC)是一種新的高通量篩選DNA序列變異的技術，其原理是利用離子對反向高效液相色譜原理,通過一個DNA分離柱，進行核苷酸片段的分離和分析。第24頁,共77頁，星期六，2024年，5月四、基因芯片技術

基因芯片技術就是指將大量特定的靶基因片段或寡核苷酸片段作為探針有序和高密度地排列固定于玻璃和硅等固相載體上，然后檢測與待測的不同熒光標記樣品基因按堿基配對的原理進行雜交，通過激光共聚焦系統檢測探針分子的雜交信號強度，經計算機分析處理數據資料，獲取不同樣品分子的數量和大量生物信息，從而可對基因序列及功能進行大規模和高通量的研究。

返回節第25頁,共77頁，星期六，2024年，5月

第二節遺傳代謝性疾病的基因診斷

遺傳代謝性疾病是指由于基因突變導致酶的質和量的改變，從而所催化的酶促反應發生變化而引起的一系列疾病。一、代謝性疾病的特征及基因診斷策略二、苯丙酮酸尿癥（PKU)三、同型胱氨酸尿癥(HCU)四、酪氨酸血癥五、半乳糖血癥六、糖原累積癥七、果糖不耐癥八、家族性高脂蛋白血癥九、肝豆狀核變性十、先天性甲狀腺功能低下十一、溶酶體病十二、線粒體病

返回章第26頁,共77頁，星期六，2024年，5月遺傳代謝性疾病的病理生理改變特征代謝途徑的某些終末產物缺乏受累代謝途徑中間和或旁路代謝產物大量蓄積由于代謝連徑受阻而導致對肝、腦、肌肉等蛆織能量供應不足一、代謝性疾病的特征及基因診斷策略

返回節第27頁,共77頁，星期六，2024年，5月遺傳代謝性疾病的發病特點父母雙方或者某一方攜帶著致病基因。多在新生兒期、幼兒或兒童期發病，有些雖然在成人期發病，但在兒童期已有潛在病變。臨床表現無特異性，多為胃腸道、呼吸系統、神經系統癥狀、代謝性酸中毒。家族史中往往有同樣病情的先證者存在，而且往往因為飲食和應激等因素而發病。

返回節第28頁,共77頁，星期六，2024年，5月代謝性疾病的基因診斷策略檢測已知的能產生某種特定功能蛋白的基因檢測與某種遺傳標志連鎖的致病基因檢測表型克隆基因

返回節第29頁,共77頁，星期六，2024年，5月二、苯丙酮酸尿癥(PKU)氨基酸代謝障礙屬常染色體隱性遺傳我國發病率約為1/16,500

返回節第30頁,共77頁，星期六，2024年，5月病因是由于人類肝細胞內苯丙氨酸羥化酶(PAH)缺乏或活性降低所致。上述酶的缺乏或活性降低直接導致體內來源于食物的苯丙氨酸不能正常轉化為酪氨酸，從而使苯丙氨酸在體內異常蓄積，并打破大腦氨基酸的平衡而導致PKU。

返回節第31頁,共77頁，星期六，2024年，5月臨床表現神經系統癥狀：以智力發育落后為主的障礙。外貌：患兒在出生數月后因黑色素合成不足，毛發、皮膚和虹膜色澤變淺。其他：嘔吐和皮膚濕疹常見；尿和汗液有鼠尿臭味。

返回節第32頁,共77頁，星期六，2024年，5月

基因診斷PAH基因定位于12號染色體的長臂上，即12q24.1，包括13個外顯子和12個內含子，編碼451個氨基酸的酶單體。PAH基因除了缺失突變外，大多是點突變。由于PKU是第一個可以用飲食控制治療的遺傳病，因此，對PKU產前診斷的研究是非常有意義的。

返回節第33頁,共77頁，星期六，2024年，5月第34頁,共77頁，星期六，2024年，5月三、同型胱氨酸尿癥(HCU)是蛋氨酸先天代謝障礙所致的氨基酸代謝缺陷性疾病。常染色體隱性遺傳病。基本病因是胱硫醚合成酶(CBS)缺乏或活性降低導致尿中的同型胱氨酸和蛋氨酸增高。

返回節第35頁,共77頁，星期六，2024年，5月病因胱硫醚合成酶缺乏型(簡稱“合成酶型”)，是由同型胱氨酸變為胱硫醚的代謝途徑發生阻滯,本型最為多見。甲基四氨葉酸-同型半胱氨酸甲基轉移酶缺乏型(簡稱“甲基轉移酶型”)，是同型半胱氨酸變為蛋氨酸的代謝途徑發生紊亂。5,10-N-甲烯四氫葉酸還原酶缺乏型(簡稱“還原酶型”)。

返回節第36頁,共77頁，星期六，2024年，5月臨床表現典型的癥狀見于胱硫醚合成酶缺乏型的病例,患兒初生時正常，5～9個月間起病,主要癥狀是骨骼異常、晶體脫位、血栓形成、智力發育落后、驚厥等。“甲基轉移酶缺乏型”癥狀較輕，可有骨骼畸形，體格和智力發育遲緩。“還原酶缺乏型”以神經系統狀為主，如驚厥、智力低下、精神分裂癥狀、肌病等。

返回節第37頁,共77頁，星期六，2024年，5月基因診斷目前的基因診斷主要集中于分析胱硫醚合成酶的基因型。可通過絨毛膜絨毛取樣(CVS)和羊水診斷來對已有HCU患兒的家庭中的其他成員進行產前診斷。

返回節第38頁,共77頁，星期六，2024年，5月

返回節第39頁,共77頁，星期六，2024年，5月四、酪氨酸血癥芳香族氨基酸代謝缺陷病常染色體隱性遺傳發病率約為1/10,000特征是血液中的酪氨酸水平增高

返回節第40頁,共77頁，星期六，2024年，5月病因酪氨酸在其分解代謝途徑中需要一系列酶的參與，當這些酶缺乏時會導致酪氨酸在組織和器官的堆積，從而使血液的酷氨酸水平增高，并最終導致一系列的臨床癥狀。

返回節第41頁,共77頁，星期六，2024年，5月分型酪氨酸血癥I型:延胡索酸酰乙酰乙酸水解酶缺乏酪氨酸血癥II型:酪氨酸轉氨酶缺乏酪氨酸血癥III型:對羥苯基丙酮酸雙氧化酶缺乏

返回節第42頁,共77頁，星期六，2024年，5月基因診斷酪氨酸血癥的基因診斷主要依靠對FAH、HPD和TAT基因的突變篩選。研究者已經確認了可導致酪氨酸血癥I型的40種FAH突變，這些突變可導致該酶的不穩定或失活，從而導致使該酶的活性降低或缺失。研究者已經確認了10種以上的TAT基因突變，而且，幾乎所有的TAT基因突變可導致酪氨酸血癥II型。研究者已確認HPD基因的一些突變可導致酪氨酸血癥III型，其中一些突變影響該酶的正確組裝。

返回節第43頁,共77頁，星期六，2024年，5月五、半乳糖血癥是一種糖代謝紊亂性疾病。常染色體隱性遺傳。發病率大約為1/60,000。機體無法處理半乳糖而導致1-磷酸半乳糖的沉積而致病。

返回節第44頁,共77頁，星期六，2024年，5月病因

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半乳糖代謝途徑中酶的遺傳性缺陷所造成的代謝性疾病。半乳糖半乳糖-1-磷酸GAKL1(2)UDP-葡萄糖UDP-半乳糖葡萄糖-1-磷酸GALE(3)GALT(1)第45頁,共77頁，星期六，2024年，5月臨床表現半乳糖-l-磷酸尿苷酰轉移酶(GALT)缺乏型(最常見，病情最重)。半乳糖激酶(GALK1)缺乏型。尿苷二磷酸半乳糖-4-表異構酶(GALE)缺乏型半乳糖血癥。

返回節第46頁,共77頁，星期六，2024年，5月基因診斷GALT位于9p13,GALT基因的大部分突變可導致GALT酶活性急劇降低或完全缺失。GALK1位于17q24，GALK1基因的大部分突變可導致半乳糖激酶氨基酸序列的改變。GALE位于人類染色體的1p36～p35，GALE基因突變可導致兩種亞型的尿苷二磷酸半乳糖-4-表異構酶缺乏型半乳糖血癥，分別是良性和惡性。

返回節第47頁,共77頁，星期六，2024年，5月六、糖原累積癥是一組較少見的嬰幼兒先天性隱性遺傳性糖原代謝紊亂性疾病。常染色體隱性遺傳。常見于男性，多在嬰兒期發病，兒童期死亡，少數可活到成年。尚無特效療法，主要是對癥處理。

返回節第48頁,共77頁，星期六，2024年，5月病因與臨床表現GSD多數是由于糖原代謝酶的缺陷而導致糖原分解或合成障礙，從而產生不同組織器官中糖原或異型糖原的過多累積。主要受累的臟器有肝、腎、肌肉、腦和小腸等。

返回節第49頁,共77頁，星期六，2024年，5月

返回節第50頁,共77頁，星期六，2024年，5月分型GSD依其所缺陷的酶可分為11種亞型。又可根據糖原貯積的主要器官分為肝型、心型、肌型。其中以肝型較多見，肝型包括I型、III型、IV型、VI型、VIII型；心型為II型；肌型為V型及VII型。

返回節第51頁,共77頁，星期六，2024年，5月基因診斷可通過各型缺陷酶編碼基因的突變來分析和預測是否存在糖原累積病。如對GSDII型，α-1,4-葡萄糖苷酶的已知的100多個突變位點與GSDII型的發病有關。

返回節第52頁,共77頁，星期六，2024年，5月七、果糖不耐癥糖代謝紊亂疾病常染色體隱性遺傳

返回節第53頁,共77頁，星期六，2024年，5月病因果糖不耐癥是由于果糖二磷酸醛縮酶缺陷所致。由于缺乏果糖二磷酸醛縮酶，使機體不能使用果糖的一種疾病，其結果是果糖的副產品——果糖1-磷酸半乳糖在體內累積，而妨礙了糖原的形成和糖原轉化成葡萄糖作為能量使用。

返回節第54頁,共77頁，星期六，2024年，5月

基因診斷果糖二磷酸醛縮酶的分子量為160000，由4個亞單位組成。根據其催化活性、免疫特征和在不同組織中的分布情況，又可分為A、B、C三型同功酶。肝、腎和小腸中以B型果糖二磷酸醛縮酶為主。歐洲資料表明：A149p、174D和N334k三種點突變是導致果糖不耐癥的最主要原因。

返回節第55頁,共77頁，星期六，2024年，5月八、家族性高脂蛋白血癥高脂蛋白血癥指的是血清脂蛋白濃度升高。高脂蛋白血癥分類方法很多，按病因清楚與否分為原發性和繼發性兩類。繼發性高脂蛋白血癥是指由其他已知疾病引起的高脂蛋白血癥。原發性高脂蛋白血癥又分為家族性高脂蛋白血癥和散發性，前者的家族成員可出現本病；后者無遺傳因素，也無繼發因素。

返回節第56頁,共77頁，星期六，2024年，5月病因與臨床表現I型高脂蛋白血癥是脂蛋白脂肪酶或脂肪酶活化蛋白apoC-II缺乏所導致的一種較為少見的家族遺傳性疾病，表現為血液中的乳糜微粒和VLDL甘油三酯的清除障礙，其特征是血液中的乳糜微粒和TG水平增高，常于幼年發病。

返回節第57頁,共77頁，星期六，2024年，5月II型高脂蛋白血癥家族性高膽固醇血癥：

病因是細胞的LDL受體缺如或缺乏，導致LDL清除延遲而導致血漿LDL水平增高。家族復合性高脂血癥：

病因是肝細胞產生apo-B過多。家族性載脂蛋白B缺陷癥：

病因是apo-B基因突變導致apo-B蛋白(LDL的主要蛋白)難于或不能被LDL受體識別，其LDL水平代于家族性高膽固醇血癥。

返回節第58頁,共77頁，星期六，2024年，5月III型高脂蛋白血癥幾乎總是有載脂蛋白E的異常和血漿VLDL的轉化和清除缺陷。

返回節第59頁,共77頁，星期六，2024年，5月IV型高脂蛋白血癥是較常見的家族性疾病，常具有家族性分布，其特征是血液中富含VLDL的TG呈不同水平的增高，有易感動脈硬化癥的可能性，常于青春期或成人期早期發病。

返回節第60頁,共77頁，星期六，2024年，5月V型高脂蛋白血癥是一種較為少見的家族性疾病，其病因是內源性和外源性TG的清除功能存在缺陷，其特征是血液乳糜微粒和TG水平增高，而LDL和HDL水平降低，常于兒童或成年發病，易于發生危及生命的胰腺炎。

返回節第61頁,共77頁，星期六，2024年，5月基因診斷除III型高脂蛋白血癥是常染色體隱性遺傳外，其他型別的高脂蛋白血癥均是常染色體顯性遺傳。常規診斷主要依靠血液脂類水平確定高脂血癥的類型。對于家族性高脂蛋白血癥疑似患者，還需要對其父母、子女和兄弟姐妹在內的一級親屬進行相應的檢測。基因診斷才剛開始應用于家族性高脂蛋白血癥，如已確認了位于人類染色體11q23的APOA5的基因突變可導致V型高脂蛋白血癥。

返回節第62頁,共77頁，星期六，2024年，5月九、肝豆狀核變性是一種少見的常染色體隱性遺傳性銅代謝障礙疾病，家族性多發，患者多為兒童及青少年。特征是肝臟不能將銅排入膽汁，從而導致銅在肝臟、中樞神經系統、腎臟等臟器聚集并對其造成損傷。

返回節第63頁,共77頁，星期六，2024年，5月肝豆狀核變性的病因是位于人類染色體13q14.3～q21.1的ATP7B基因。研究者已確認了可導致肝豆狀核變性的200多個ATP7B基因突變位點，其中，約半數的突變導致ATP7B蛋白單個氨基酸的錯誤替換。

返回節第64頁,共77頁，星期六，2024年，5月十、先天性甲狀腺功能低下

甲狀腺功能低下是由于甲狀腺激素分泌減少所致的疾病先天性甲狀腺功能低下的病因是患兒的甲狀腺先天性缺陷，表現為甲狀腺發育或功能異常。DUOX2、PAX8、SLC5A5、TG、TPO、TSHB、TSHR基因的突變可導致先天性甲狀腺功能低下。

返回節第65頁,共77頁，星期六，2024年，5月十一、溶酶體病機體由于基因缺陷，可使溶酶體中缺少某種水解酶，致使相應作用物不能降解而積蓄在溶酶體中，造成細胞代謝障阻，形成溶酶體貯積病，又稱為溶酶體病。

返回節第66頁,共77頁，星期六，2024年，5月

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先天性溶酶體病是由于溶酶體酶缺陷而引起的遺傳性疾病，現已發現有四十幾種先天性溶酶體病是由于溶酶體缺乏某些酶而引起的，由于溶酶體缺乏某些酶，相應的作用底物不能被分解而積累于溶酶體內，表現為溶酶體過載現象，而導致疾病的發生。第67頁,共77頁，星期六，2024年，5月十二、線粒體病線粒體是生物體內從食物獲取能量的主要裝置

返回節第68頁,共77頁，星期六，2024年，5月氧化磷酸化是指線粒體呼吸鏈電子傳遞過程中ADP生成ATP的過程。線粒體呼吸鏈