皰疹病毒

herpesviruses,HV

第24章第24章皰疹病毒案例掌握皰疹病毒的致病性熟悉皰疹病毒的生物學性狀了解皰疹病毒的檢查方法和防治原則教學目的第24章皰疹病毒案例皰疹病毒(Herpesvirus)是一類中等大小、結構相似、有包膜的DNA病毒。現已發現114種，分3個亞科已知的人類皰疹病毒有：單純皰疹病毒1型和2型 （HSV1&2）水痘—帶狀皰疹病毒 （VZV）巨細胞病毒 （CMV）EB病毒 （EBV）人類皰疹病毒6型、7型、8型（HHV6,7,8）第24章皰疹病毒案例正式命名常用名病毒亞科重要生物學性狀所致疾病人類皰疹病毒1型（HHV-1）單純皰疹病毒1型（HSV-1）

繁殖快、殺細胞性感染感覺神經節中潛伏唇皰疹、齦口炎、角膜結膜炎、腦炎等人類皰疹病毒2型（HHV-2）單純皰疹病毒2型（HSV-2）

同上生殖器皰疹、新生兒皰疹人類皰疹病毒3型（HHV-3）水痘-帶狀皰疹病毒（VZV）

同上水痘、帶狀皰疹、腦炎人類皰疹病毒4型（HHV-4）Epstein-Barr病毒（EBV）

淋巴細胞中繁殖與潛伏傳染性單核細胞增多癥、Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌（?）等人類皰疹病毒5型（HHV-5）人類巨細胞病毒

常在淋巴細胞、腎臟及分泌腺體中潛伏先天性巨細胞包涵體病、單核細胞增多癥、間質性肺炎、先天性畸形、肝炎人類皰疹病毒6型（HHV-6）人類皰疹病毒6型

同人巨細胞病毒嬰兒急疹、間質性肺炎、骨髓抑制人類皰疹病毒7型（HHV-7）人類皰疹病毒7型

同人巨細胞病毒未明確人類皰疹病毒8型（HHV-8）人類皰疹病毒8型

同EB病毒Kaposi肉瘤彌猴皰疹病毒1猿猴B病毒

同HSV脊髓炎、出血性腦炎第24章皰疹病毒案例皰疹病毒的共同特征病毒顆粒呈球形，120～300nm。核衣殼約100nm。20面體立體對稱，有包膜雙鏈線形DNA第24章皰疹病毒案例除EB病毒及HHV-6、HHV-7和HHV8外，均能在人二倍體細胞內復制，產生明顯CPE，并有核內嗜酸性包涵體，形成多核巨細胞多種感染類型:顯性感染潛伏感染整合感染先天性感染第24章皰疹病毒案例Herpessimplexvirus,HSV第一節單純皰疹病毒第24章皰疹病毒案例單純皰疹病毒案例

患者，女，20歲。因經常出現口唇黏膜處水皰而就診，患者發熱時口唇周圍常起針頭大小的小皰，常為一群，也有兩三群，自覺有輕度燒灼感，歷時1周左右可自愈，反復發作多次，并伴有口腔潰瘍、咽炎、舌炎等現象。第24章皰疹病毒案例思考題：1該患為何種病原體感染？病原體存在于何處？2潛伏感染的定義是什么？第24章皰疹病毒案例單純皰疹病毒單純皰疹病毒，由于在感染急性期發生水皰性皮疹即所謂單純皰疹而得名包括兩個血清型HSV-1HSV-2第24章皰疹病毒案例一、生物學性狀第24章皰疹病毒案例生物學性狀典型的皰疹病毒科病毒特征HSV有兩個血清型，即HSV-1和HSV-2。兩者DNA的同源性約為50%病毒體有六個包膜相關糖蛋白：gpB、gpC、gpD、gpE、gpG和gpH。gpC是型特異抗原，只有HSV-1有。gpD是病毒中和抗原，是亞單位疫苗的備選蛋白第24章皰疹病毒案例在多種細胞增殖，病毒復制快（48h），出現細胞腫脹變圓和核內嗜酸性包涵體CPE第24章皰疹病毒案例二、致病性與免疫性第24章皰疹病毒案例性接觸垂直傳播傳播途徑密切接觸傳播：唾液、陰道分泌物、皰疹液，接吻，共用杯子，牙刷等。第24章皰疹病毒案例HSV感染較普遍

密切接觸和性接觸

經粘膜和破損皮膚上皮細胞內復制，水皰漿液充滿病毒顆粒，細胞碎片，基底部多核巨細胞；神經細胞則為潛伏感染。皮膚損傷性水皰第24章皰疹病毒案例

原發感染

表現：粘膜與皮膚的局部皰疹HSV-1：腰以上感染為主唇皰疹齦口炎角膜結膜炎等

第24章皰疹病毒案例HSV-2：腰以下及生殖器感染為主

生殖系統皰疹、新生兒皰疹等第24章皰疹病毒案例

潛伏感染

原發感染后,HSV由感覺神經

感覺神經節

HSV-1:三叉神經節和頸上神經節

HSV-2:骶神經節

潛伏的HSV不復制，對抗病毒藥物不敏感第24章皰疹病毒案例復發性感染

非特異性刺激：發熱、月經、感染等激活潛伏病毒沿感覺神經纖維下行到末梢感染粘膜或皮膚上皮細胞免疫記憶反應病程短,組織損傷輕,感染更局限

第24章皰疹病毒案例先天性感染及新生兒感染：妊娠期婦女（HSV-1）

影響胚胎細胞的有絲分裂胎兒畸形、智力低下、流產。分娩--------新生兒皰疹第24章皰疹病毒案例HSV-2可能引起宮頸癌患過生殖器皰疹的婦女，宮頸癌發病率高用免疫熒光檢查癌組織HSV-2抗原患者HSV-2抗體效價高宮頸皰疹與宮頸癌好發部位相似分子雜交試驗發現HSV-2基因片段尚不能作出結論。HSV-2可能是一種輔助致癌因子，或是一種與之無關的“過客”病毒第24章皰疹病毒案例

免疫IFN和NK細胞：限制原發感染發展中和抗體：阻斷病毒擴散及潛伏感染細胞免疫：控制和消除HSV感染第24章皰疹病毒案例三、微生物學檢查法第24章皰疹病毒案例檢測核酸

PCR或原位雜交檢測抗原

熒光素或酶標記抗體染色分離病毒

標本：水皰液、唾液細胞：BHK-21，Vero

CPE：細胞腫脹；融合細胞；包涵體第24章皰疹病毒案例防治原則預防避免同患者接觸防止醫院內感染剖腹產預防新生兒感染

HSV有致癌可能性，減毒活疫苗和死疫苗不宜用于人體包膜蛋白（提純的gG、gD）亞單位疫苗基因重組疫苗、多肽疫苗治療正研制國內用HSVgCgD單克隆抗體制成滴眼液，用于治療皰疹性角膜炎，取得顯著療效無環鳥苷（ACV）對皰疹病毒選擇性很強的藥物第24章皰疹病毒案例單純皰疹病毒案例

患者，女，20歲。因經常出現口唇黏膜處水皰而就診，患者發熱時口唇周圍常起針頭大小的小皰，常為一群，也有兩三群，自覺有輕度燒灼感，歷時1周左右可自愈，反復發作多次，并伴有口腔潰瘍、咽炎、舌炎等現象。第24章皰疹病毒案例思考題：1該患為何種病原體感染？病原體存在于何處？2潛伏感染的定義是什么？第24章皰疹病毒案例案例提示

根據臨床表現為單純皰疹病毒——1型感染。不同的皰疹病毒其體內潛伏部位不同，ＨＳＶ——1主要潛伏于三叉神經節或頸上神經節，ＨＳＶ——2潛伏于骶神經節，ＥＢＶ主要潛伏于Ｂ淋巴細胞內。第24章皰疹病毒案例

原發感染后少數病毒不被清除，以非活化狀態存留于機體內。病毒不增殖，也不破壞細胞，與宿主細胞處于暫時平衡狀態。一旦病毒被再激活，可轉為顯性感染，疾病復發。第24章皰疹病毒案例Varicellazostervirus（VZV）第二節水痘-帶狀皰疹病毒第24章皰疹病毒案例水痘帶狀皰疹病毒案例患者，男，58歲。因感冒發熱2天后胸部皮膚產生水皰疹，水皰逐漸增多并顯著疼痛就診。查體見患者胸部皮膚有片狀水皰，沿肋緣分布形成帶狀。第24章皰疹病毒案例思考題：1該患為何種病原體感染？2該病怎樣進行預防和治療？第24章皰疹病毒案例水痘－帶狀皰疹病毒（VZV）在兒童初次感染時引起水痘（Varicella），恢復后病毒潛伏在體內，青春期或成年以后少數人復發可引起帶狀皰疹（Zoster），故稱為水痘－帶狀皰疹病毒（Varicella-ZosterVirus）第24章皰疹病毒案例與HSV相似：

①潛伏神經細胞，引起復發感染②細胞免疫限制和防止重癥水痘③皮膚損傷以水皰為特征與HSV不同：

①呼吸道感染

②通過病毒血癥播散至皮膚一、生物學性狀第24章皰疹病毒案例水痘和帶狀皰疹二、致病性與免疫性第24章皰疹病毒案例致病性傳染源主要是患者，水痘患者急性期水皰內容物及上呼吸道分泌物、或帶狀皰疹患者水皰內容物都含有病毒病毒借飛沫經呼吸道或接觸傳播好發年齡為3～9歲，多在冬季春季流行第24章皰疹病毒案例原發感染：水痘，一般病情較輕潛伏感染：原發感染后，病毒潛伏于脊髓后根神經節或顱神經的感覺神經節。以后如機體免疫力下降，病毒被激活，病毒沿神經軸突下行到所支配的皮膚細胞內增殖，發生皰疹，排列呈帶狀，稱帶狀皰疹發生于身體的一側，以軀干中線為界，好發部位為胸、腹和面部多見于成年人，特別是40歲以上成年人第24章皰疹病毒案例水痘(ChickenPox)病毒經呼吸道、結膜、皮膚等處侵入人體先在局部淋巴結增殖進入血液散布到各個內臟繼續大量增殖2～3周潛伏期皮膚廣泛發生丘疹，水皰疹和膿皰疹第24章皰疹病毒案例帶狀皰疹（Shingles）兒童時期患過水痘愈合病毒潛伏在脊髓后根神經節或腦感染神經節中機體免疫力下降等條件刺激病毒沿感覺神經軸索下行該神經所支配的皮膚細胞內增殖在皮膚上沿著感覺神經的通路發生串聯的水皰疹，形似帶狀第24章皰疹病毒案例免疫性兒童患水痘后，機體產生持久的特異性細胞免疫和體液免疫，極少再患水痘病毒中和抗體和細胞免疫不能有效地清除潛伏于神經節中的病毒，故不能阻止病毒被激活而發生帶狀皰疹第24章皰疹病毒案例診斷：似HSV治療：①無環鳥苷②IFN：限制疾病預防：減毒活疫苗三、微生物學檢查法與防治第24章皰疹病毒案例防治原則VZV減毒活疫苗預防水痘感染和傳播有良好效果治療可用無環鳥苷、阿糖腺苷和高劑量干擾素第24章皰疹病毒案例水痘帶狀皰疹病毒案例患者，男，58歲。因感冒發熱2天后胸部皮膚產生水皰疹，水皰逐漸增多并顯著疼痛就診。查體見患者胸部皮膚有片狀水皰，沿肋緣分布形成帶狀。第24章皰疹病毒案例思考題：1該患為何種病原體感染？2該病怎樣進行預防和治療？第24章皰疹病毒案例提示根據臨床表現為單純皰疹病毒——2型感染。第24章皰疹病毒案例提示VZV減毒活疫苗預防水痘感染和傳播有良好效果，接種對象為1歲以上末患過水痘的兒童和成人。對免疫功能低下者可用高效價人免疫球蛋白進行緊急預防。治療可用無環鳥苷、阿糖腺苷和高劑量干擾素第24章皰疹病毒案例Humancytomegalovirus（HCMV）第三節人巨細胞病毒第24章皰疹病毒案例人類巨細胞病毒（HCMV）1956年Smith等首先用組織培養方法從患者腺體組織培養中分離出病毒。由于感染的細胞腫大并具有巨大的核內包涵體故得名是巨細胞包涵體病的病原體CMV多為潛伏感染，常可由懷孕、器官移植、免疫抑制、艾滋病等因素被激活第24章皰疹病毒案例形態結構：與HSV極相似宿主范圍：

較窄，不感染其它動物；僅成纖維細胞中增殖。一、生物學性狀第24章皰疹病毒案例生物學性狀典型皰疹病毒結構對宿主或培養的組織細胞感染有高度的種屬特異性：即HCMV只能感染人。只能在人成纖維細胞增殖復制周期為36～48h（增殖緩慢），其特點是細胞變圓、膨脹、核變大、形成巨大細胞，核內出現周圍繞有一輪鷹眼狀大型嗜酸性包涵體（Owl’seyeinclusionbody）第24章皰疹病毒案例致病性潛伏部位唾液腺、乳腺、腎臟、白細胞及其他腺體長期或間歇地從尿液、唾液、淚液、乳汁、精液、宮頸及陰道分泌物排出病毒第24章皰疹病毒案例傳播環節傳染源患者及無癥狀隱性感染者傳染方式胎盤產道密切接觸，通過口口或手口傳播輸血器官移植第24章皰疹病毒案例先天性感染（宮內感染）通過胎盤感染胎兒。發生率為0.5%~2.5%，CMV是能引起先天性感染的主要病毒之一只有少部分（<10%）感染者表現癥狀，主要臨床表現是巨細胞包涵體病（黃疸、肝脾腫大、溶血性貧血、紫癜等），極少數患兒表現為先天性畸形（小頭智力低下、神經肌肉運動障礙、耳聾、脈絡膜視網膜炎等）第24章皰疹病毒案例經產道感染，或出生后數周由母體的病毒（尿或乳汁中的病毒），或護理人員排出的病毒所引起的感染多數無癥狀或癥狀輕微，表現為輕聲度或明顯呼吸障礙、肝功損害通常不表現神經損傷，預后良好圍生期感染第24章皰疹病毒案例免疫功能低下的病人感染發生于長期免疫抑制劑治療、器官移植、AIDS、白血病、淋巴瘤等患者是由于體內原有的潛伏HCMV被激活癥狀主要是肺炎、視網膜炎、腦炎、腦膜炎等，預后不好第24章皰疹病毒案例輸血感染輸入大量含有CMV的新鮮血液，可發生輸血后的單核細胞增多癥和肝炎等HCMV導致的單核細胞增多癥檢測不到嗜異性抗體和EBV相關抗體，可籍此區別與EBV所致的單核細胞增多癥預后良好第24章皰疹病毒案例接觸感染唾液、乳汁、尿、精液、宮頸分泌物存在HCMV，通過接吻、性接觸、哺乳等方式傳染。第24章皰疹病毒案例細胞轉化與致癌潛能HCMV基因組的DNA片段，體外可轉化地鼠胚和人胚成纖維細胞。接種乳鼠可形成腫瘤。宮頸癌、前列腺癌、結腸癌和Kaposi肉瘤組織檢出HCMV的DNA序列。第24章皰疹病毒案例細胞培養：成纖維細胞中增殖，生長慢，CPE需2～6周。ELISA：HCMV-IgM；近期感染；胎兒感染HCMVCPE

包涵體三、微生物學檢查法第24章皰疹病毒案例防治原則丙氧鳥苷（ganciclovirDHPG）有防止CMV擴散作用耐丙氧鳥苷的CMV感染可選用磷甲酸鈉，但效果比前者差CMV病毒活疫苗致癌潛能的問題有待解決CMV包膜糖蛋白的亞單位疫苗是研究的方向第24章皰疹病毒案例第四節EB病毒Epstein-Barrvirus，EBV第24章皰疹病毒案例EB病毒（Epetein-Barrvirus）Burkkit先生在研究非洲中部的一種發生于兒童的惡性淋巴瘤時曾預測該病是一種病毒感染性疾病。1964年加拿大學者Epstein和Barr從這種惡性淋巴瘤體外培養的淋巴瘤細系中，用電鏡觀察到一種新的人類皰疹病毒，后被命名為EB病毒第24章皰疹病毒案例形態結構類似HSV一、生物學性狀第24章皰疹病毒案例生物學性狀典型皰疹病毒，但抗原結構與其他皰疹病毒不同常規方法不能培養。僅能在CD21+的B淋巴細胞中增殖，轉化為可長期傳代的類淋巴母細胞株。是一種嗜B細胞的皰疹病毒CD21分子是該病毒的受體，故含CD21的粘膜上皮細胞和B淋巴細胞是該病毒的宿主第24章皰疹病毒案例增殖性感染產生的抗原：早期抗原（earlyantigen，EA）：

DNA聚合酶活性,表示EBV增殖

EA抗體：早期抗體,持續幾個月，表示近期感染。

第24章皰疹病毒案例衣殼抗原（VCA）：

結構蛋白，存在細胞質和細胞核VCA-IgM出現早，消失快

VCA-IgG出現晚，持續幾年EBV膜抗原（MA）：

在細胞表面，屬包膜糖蛋白

MA-IgM表示近期感染

MA-IgG可持續存在第24章皰疹病毒案例

潛伏感染

EBV感染B細胞或上皮細胞

潛伏感染細胞含EBV基因組(游離或整合)選擇性表達潛伏期抗原，刺激B細胞增生或永生化

第24章皰疹病毒案例

EBV潛伏期抗原核抗原（EBNA）

B細胞核內，為DNA結合蛋白

感染細胞逃避CTL殺傷

與細胞永生化有關

EBNA抗體：感染晚期持續存在潛伏膜蛋白（LMP）

在B細胞表面,致癌蛋白

改變細胞功能,抑制細胞凋亡

阻止潛伏病毒激活功能第24章皰疹病毒案例二、致病性與免疫性EB病毒在人群中廣泛感染我國3～5歲兒童感染率達90%以上主要通過唾液傳播，也可經輸血傳染EB病毒在口咽部上皮細胞內增殖，然后感染B淋巴細胞感染B細胞進入血循環可造成全身性感染病毒可長期潛伏第24章皰疹病毒案例傳染性單核細胞增多癥初次感染大劑量病毒，多見青少年，是一種急性全身淋巴細胞增生性疾病癥狀為發熱、咽炎、頸淋巴腺炎、肝脾腫大、血液中大量異形淋巴細胞持續數月后自愈，預后良好致病性第24章皰疹病毒案例非洲兒童淋巴瘤（即Burkitt淋巴瘤）于中非、新幾內亞和美洲溫熱帶地區呈地方性流行多見于5～12歲兒童好發部位為顏面、腭部所有BL病人血清均含EBV抗體，其中80%以上滴度高于正常人在腫瘤組織中發現EBV基因組100%死亡率第24章皰疹病毒案例鼻咽癌（NasopharyngealCarcinoma，NPC）地區性分部，主要東南亞和華南廣東省40歲以上的中老年人從鼻咽癌活檢組織中找到EBV鼻咽癌患者血清EBV相關抗原的抗體效價高于正常人NPC患者EBV潛伏感染時間通常很長，在30年左右還不能認為EBV是鼻咽癌唯一致病因素，可能是多種綜合因素中的一種第24章皰疹病毒案例免疫性EBV在人群中廣泛存在，成人抗體的陽性率達90%以上出現中和抗體，能阻止外源性病毒再感染細胞和體液免疫不能清除體內已經潛伏的EBV第24章皰疹病毒案例異嗜性抗體的檢測EBV特異性抗體檢測

三、微生物學檢查法第24章皰疹病毒案例微生物學檢查EBV分離培養困難可用核酸雜交和PCR等方法檢測細胞內EBV基因組及其表達產物血清學診斷

EBV特異性抗體的檢測檢測病毒VCA－IgA或EA－IgA抗體，滴度≥1：5～1：10有診斷意義異嗜性抗體凝集試驗用于傳染性單核白細胞增多癥的輔助診斷第24章皰疹病毒案例防治原則我國用基因工程方法構建的同時表達EBVgp320和HBsAg的疫苗，重點使用在鼻咽癌高發區gp320膜蛋白疫苗，正在英國大學生患者中作小規模接種，以期觀察該疫苗是否能降低傳染性單核細胞增多癥的發病率第24章皰疹病毒案例臨床病原教研室：孫艷EB病毒感染與多發性硬化癥的關系研究第24章皰疹病毒案例

課題來源該課題分別列為黑龍江省教育廳一般科研項目和齊齊哈爾市科技局指令項目，獲項目經費1.5萬元，學院配備1.5萬元。第24章皰疹病毒案例

研究工作概述

該課題于2006年9月啟動2008年12月完成全部實驗第24章皰疹病毒案例研究工作概述1.MS患者CSF中EB病毒（EBV）相關抗體的檢測及EBV核酸的PCR檢測2.小鼠MS動物模型制備及EB病毒感染導致的神經系統病理變化的研究第24章皰疹病毒案例研究背景多發性硬化癥（MultipleSclerosis，MS）是一種中樞神經系統的脫髓鞘性疾病，病變累及的部位為腦和脊髓。特點為病灶多發，常有緩解和復發，病殘性大。表現為多種神經系統的癥狀和體征。有復發緩解型、繼發進展型、原發進展型、復發進展型和良性MS等數種類型，多見于歐洲及北美國家，在西方社會MS是造成青壯年神經性殘疾中僅次于外傷的第二大因素。第24章皰疹病毒案例

過去認為此病在我國較罕見，但近年來隨著診斷手段和醫療水平的不斷提高，陸續有此類病例報道，并且發病率呈上升趨勢，尤其是在我國高緯度地區，如黑龍江發病率較高。盡管目前對MS的病因及病理機制尚未完全明了，但認為MS的發病與遺傳、病毒、免疫、環境地理等因素有關，是多因素共同作用的結果。第24章皰疹病毒案例關于EB病毒感染與多發性硬化癥的關系研究，國外研究只證明，EBV感染與MS發病高度相關，而國內目前尚屬空白，至今沒有直接的實驗證據證明EBV感染可以導致MS二者研究的報道，如果我們能開展此項研究將能填補國內研究領域的空白。第24章皰疹病毒案例

EB病毒(EpsteinBarrvirus,EBV)EB病毒是一種嗜淋巴細胞的DNA病毒,主要侵犯B細胞。EB病毒基因組編碼6個抗原蛋白,膜殼抗原(VCA)、膜抗原(MA)、早期抗原(EA,可分為彌散成分D和局限成分R)、補體結合抗原(即可溶性抗原S)、EB病毒核抗原(EBNA,分EBNA1和EBNA2)和淋巴細胞檢測的膜抗原(LYDMA)。第24章皰疹病毒案例

EBV與人類許多疾病密切相關，如：傳染性單核細胞增多癥，EBV相關嗜血細胞綜合癥，鼻咽癌，淋巴瘤等。目前國外研究只證明EBV感染與MS發病高度相關，國內目前尚屬空白，至今沒有直接的實驗證據證明EBV感染可以導致MS的研究。第24章皰疹病毒案例

本課題將從臨床抗體檢測、病毒核酸檢測、MS小鼠神經系統病理變化等方面研究EBV感染與MS發病間的關系，將為探討MS致病機制和治療提供理論基礎。第24章皰疹病毒案例

ELISA法EBVIgG檢測試劑盒（上海生物制品研究所）、多功能酶標儀（奧地利迪肯公司產品）、EBV-DNA-PCR試劑盒(EBV-DNA：269bp,華美生物工程公司)、PCR儀(美國MJ公司產品)、凝膠成像系統、垂直電泳儀豚鼠由哈爾濱獸醫研究所提供。

主要試劑和主要儀器第24章皰疹病毒案例1.通過酶免疫法檢測對臨床MS患者的CSF中EBV特異的IgG水平，對MS患者CSF中EBV核酸的檢測。2.構建動物模型，將滅活EBV和EBV提取蛋白接種小鼠足墊，觀查神經系統病理變化。實驗方法第24章皰疹病毒案例1.MS患者CSF中EB病毒（EBV）相關抗體的檢測及EBV核酸的PCR檢測1.1研究對象

MS組：選擇臨床確診為MS的患者26例，符合Poster等制定的MS診斷標準，男10例，女16例，年齡12~72歲，平均40.1±13.6歲。對照組：4例為緊張性頭痛及5例神經衰弱患者，17例為腰麻的痔瘡或肛瘺手術患者，男11例，女15例，年齡19~71歲，平均43.2±13.5歲。

MS組與正常對照組兩組間患者的年齡、性別間具有均衡性。實驗方法第24章皰疹病毒案例1.2實驗方法

收集MS組和對照組CSF標本，均在采集30分鐘內放入-70℃冰箱中保存備用。1.2.1ELISA法檢測腦脊液（CSF）中IgG

嚴格按照ELISA法EBVIgG檢測試劑盒說明書的流程操作，用兔抗人IgG（1mg/ml）包被ELISA板后，加入待測腦脊液（CSF）和HRP標記的羊抗人IgG（1：5000），用DAB顯色。用酶標儀于波長490nm測定光吸收值（A490）,IgG濃度與A490值成正比。檢測結果采用SSPSforwindows軟件包對數據結果進行統計分析，兩組間的比較采用t檢驗，以P＜0.05表示有顯著差異。實驗方法第24章皰疹病毒案例1.2.2PCR技術檢測MS患者腦脊液（CSF）中EBV-DNA

腦脊液（CSF）模板處理方法：取腦脊液（CSF）2ml,用PBS液按等倍稀釋為1：4，稀釋過程需搖勻，用A法[17]提取模板DNA。取5ul用于常規PCR擴增。PCR擴增參數為：94℃，2min；93℃，30s；55℃,45s;72℃,45s；35個循環后，72℃延伸10min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴增結果。每批實驗均設EBV—DNA陽性質粒對照和無模板的陰性對照。

實驗方法第24章皰疹病毒案例

2.小鼠MS動物模型制備及EB病毒感染導致的神經系統病理變化的研究

將滅活的EBV和EBV的提取蛋白分別接種小鼠足墊。病理和免疫組化觀察小鼠是否因此導致神經系統發生MS病理變化，從而找到MS患者與EB病毒感染關系的依據。

2.1動物

豚鼠由哈爾濱獸醫研究所提供30只，2.5月齡,雌雄各半,體重350g左右。實驗方法第24章皰疹病毒案例

2.2EBV的制備

EBV的制備及滅活將B95－8細胞株用RPMI1640(含10%胎牛血清和2mmol/L谷氨酰胺)調整細胞密度至1×109個細胞/L,接種于培養瓶中，隔日半量換液,并適時進行傳代培養。將培養的細胞饑餓14天后,收集培養上清500ml,于4℃以

22000r/min離心1小時。棄上清,用10mlIMDM培養基重懸沉淀,并濃集50倍,0.45μm濾膜過濾。

實驗方法第24章皰疹病毒案例

2.3MS動物模型的制備

實驗分兩組:(1)實驗組,21只，取EBV懸液,加福(氏)完全佐劑(CFA),乳化后按體重注入豚鼠后足掌,抗原量約為按體重0.66μg/g。免疫后約8～9天發病,發病動物出現不同程度肢體無力,體重減輕,繼之癱瘓,伴有尿便障礙,有的抽搐死亡。

(2)對照組，9只，取EBV懸液5ml56℃加熱滅活60分鐘，加CFA注入,此組動物不發病。實驗方法第24章皰疹病毒案例

2.4取材

動物處死后立即將腦和脊髓取出,除留少量組織置于3%(體積分數)戊二醛中,其余均置于40g/L的多聚甲醛中固定,固定后2周取材,取腦室周圍的腦實質,脊髓分頸、胸、腰3段。

2.5組織病理

HE染色及Weil鐵礬蘇木素染色。

2.6半薄切片及超薄切片

哈爾濱醫科大學電鏡室制備。

實驗方法第24章皰疹病毒案例

1.腦脊液（CSF）中IgG的檢測

ELISA法檢測MS組和正常對照組腦脊液（CSF）中IgG含量，MS組腦脊液（CSF）中IgG含量平均為（x±s）：0.026±0.002，（26例臨床確診為MS患者CSF中IgG含量在0.016~0.047ng/ml之間）；正常對照組腦脊液（CSF）中IgG含量平均為（x±s）：0.005±0.002（26例正常對照組CSF中IgG含量在0.002~0.008ng/ml之間）。以EBVIgG4倍升高作為診斷依據。

結果：MS組CSF中IgG含量異常的百分率為76.93%（20/26）；對照組CSF中IgG含量異常的百分率為0。

實驗結果第24章皰疹病毒案例

2.PCR法檢測腦脊液（CSF）中EBV-DNA

PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并以PCRMarker(x174)為分子標準參照物，以PCR擴增產物在269bp處有擴增條帶者為EBV-DNA陽性，反之為陰性，電泳結果見圖1-4。MS組EBV-DNA陽性率為94.6%（24/26），正常對照組EBV-DNA陽性率為0。

T檢驗結果證實：MS組與正常對照組EBV-DNA陽性率有顯著性差異（P＜0.01）。實驗結果第24章皰疹病毒案例PCR法檢測腦脊液（CSF）中EBV-DNA圖1MS組EBV-DNAPCR擴增結果Fig1AgarosegelelectrophoresisofPCRproductofEBV-DNAP.positivecontrol;N.negativecontrol；Line1-9.PCRproductsofMSgroup(9,negative)PN123456789第24章皰疹病毒案例圖2MS組EBV-DNAPCR擴增結果Fig2AgarosegelelectrophoresisofPCRproductofEBV-DNA10-15.PCRproductsofMSgroup;M.DNAMarkerΦX174101112131415MPCR法檢測腦脊液（CSF）中EBV-DNA第24章皰疹病毒案例圖3MS組EBV-DNAPCR擴增結果Fig3AgarosegelelectrophoresisofPCRproductofEBV-DNA16-21.PCRproductsofMSgroup;M.DNAMarkerΦX174161718192021MPCR法檢測腦脊液（CSF）中EBV-DNA第24章皰疹病毒案例圖4MS組EBV-DNAPCR擴增結果Fig4AgarosegelelectrophoresisofPCRproductofEBV-DNA22-26.PCRproductsofMSgroup;M.DNAMarkerΦX174（25：negative）2223242526MPCR法檢測腦脊液（CSF）中EBV-DNA第24章皰疹病毒案例圖1MS組EBV-DNAPCR擴增結果Fig1AgarosegelelectrophoresisofPCRproductofEBV-DNAP.positivecontrol;N.negativecontrol；Line1-9.PCRproductsofMSgroup(9,negative)PN123456789PCR法檢測腦脊液（CSF）中EBV-DNA第24章皰疹病毒案例

3.光鏡結果

對照組的神經組織病理檢查未見異常,這與此組未出現臨床癥狀吻合。實驗組動物大體腦組織可見腦膜血管充血,珠網膜下腔輕度混濁,腦橫切面可見呈針尖狀的小血管充血,彌漫分布。MS動物的組織病理學變化主要表現為急性血管炎伴周圍髓鞘脫失,脊髓實質內、珠網膜下腔及側腦室脈絡叢小血管充血,管周有大量炎細胞浸潤,形成“袖套”(cuffing)狀改變(圖1),發病初期主要為中性粒細胞浸潤,繼之以淋巴細胞浸潤為主并有少量單核細胞。實驗結果第24章皰疹病毒案例

Knobler等原位組織化學檢測顯示:

病變部位浸潤的淋巴細胞以輔助T淋巴細胞和巨噬細胞/小膠質細胞為主,而細胞毒性T淋巴細胞/抑制T淋巴細胞和B淋巴細胞罕見,小血管管壁增厚,管周間隙有漿液滲出。病灶播散在CNS白質內,病灶均累及小靜脈,有的小靜脈破裂,周圍少量出血,可見白細胞附壁或正通過管壁,或進而游出血管向炎性區移動。腦膜和脊髓膜亦有炎細胞浸潤。側腦室旁白質尤其側腦室角周圍白質及脊髓后聯合、側角髓鞘腫脹,崩解消失,軸突腫脹,偶有軸突消失(圖2),并可見大量格子細胞存在。神經元細胞無明顯改變,有的出現衛星現象。以上病理改變符合文獻報道。第24章皰疹病毒案例

圖1血管周圍炎性浸潤

Fig1

Inflammatoryinfiltrationaroundbloodvessels×10×15×20×40第24章皰疹病毒案例圖2白質脫髓鞘

Fig2

Demyelinationinwhitematter第24章皰疹病毒案例

4.電鏡結果

電鏡下觀察MS發病動物,病變分布不規則,脫髓鞘改變以血管周圍明顯,大部分髓鞘環形結構呈松散狀