正文抗生素抗性基因（ARG）是廣泛存在的污染物，對環境和公眾健康構成嚴重威脅，尤其是廢水中的ARG是環境中ARG的重要來源。因此，監測和評估廢水中的ARG豐度對于環境管理具有重要意義。這里，將LAMP與CRISPR/Cas12a結合，建立了用于檢測大環內酯類抗性基因ermB的便攜式視覺平臺，首先設計了LAMP的6個引物和CRISPR/Cas12a的crRNA，用LAMP進行預擴增，并通過堿基配對引導Cas12a識別ermB。由于CRISPR/Cas12a在擴增子識別后具有反式切割活性，使用報告分子修飾的ssDNA探針通過側流試紙條和熒光進行可視化檢測。經過磁珠簡單的核酸提取后，所構建的生物傳感器具有優異的靈敏度和選擇性，使用熒光和廢水中的流條可以低至2.75×103

copies/μL，實現了快速、靈敏的可視化現場檢測。如Fig.1a所示，該生物傳感器的檢測過程包括以下步驟：過濾和裂解預處理、磁珠提取、LAMP預擴增、CRISPR/Cas12a系統識別和轉導、熒光和橫向檢測。作者首先設計了針對

ermB

基因的LAMP引物，接下來，設計了Cas12crRNA來特異性識別和檢測LAMP預擴增的ermB基因。以一段crRNA為指導RNA，Cas12a可以識別與crRNA識別片段互補的ermB片段。目標序列被識別后，其對ssDNA探針進行非特異性切割的反式切割活性被激活。之后，設計了用熒光和相應的猝滅劑修飾的單鏈DNA探針(5′?6-FAM-TTATT-BHQ1–3′)和用熒光和生物素分子修飾的單鏈DNA探針(5′?6-FAM-TTATTATT-Biotin-3′)分別用于熒光和側流裝置中的可視化檢測。在熒光檢測中，在Cas12a反式切割存在的情況下，ssDNA熒光探針解離，釋放猝滅劑以恢復熒光信號。結果可以通過熒光讀數裝置或特定光源激發來直觀地讀取（Fig.1b）。相反，在沒有靶標的情況下，由于缺少激活的Cas12a，ssDNA探針不會被切割,因此，沒有產生熒光信號。在可視化的側流檢測中，側流探針的每一側都用FAM和生物素進行了預修飾。比色側流試紙條通常由帶有gt抗FAM抗體修飾的金納米顆粒(AuNP)的樣品墊、一條用鏈霉親和素標記以捕獲生物素的對照線和一條帶有標記的抗gt抗體以捕獲gt抗體的測試線組成。如果沒有特異性的LAMP產物，ssDNA探針保持完整，并且由于生物素和鏈霉親和素的結合，AuNP可以固定到對照線上，導致紅色沉積。相反，AuNPs復合物通過AuNPs和生物素的分離以及gt抗體與抗gt抗體的結合而固定在測試線上，形成紅色條帶。為了評估LAMP在檢測ermB基因時的靈敏度，將PCR擴增產生的目標DNA片段以10倍梯度稀釋。結果Fig.2所示，熒光LAMP成功檢測到ARG

ermB，LOD為2.75×10

3

copies/μL。DNA濃度與循環閾值時間（CT）之間存在良好的線性關系，線性范圍跨越8個數量級，最高可達2.75×10

10

copies/μL。為了進一步提高分析方法的特異性，研究人員將CRISPR/Cas12a系統引入檢測中，以解決潛在的假陽性問題并提高靈敏度（Fig

3.a,b）。接著，為了滿足復雜現場條件下可視化的各種可能要求，使用熒光和側流試紙進行可視化檢測分析(Fig

3.c,d)。之后，為了驗證構建的基于CRISPR/Cas12a的視覺平臺的準確性和可靠性，對原廢水進行了現場檢測（Fig.4）。結果表明，構建的CRISPR/Cas12a可視化平臺能夠實現廢水中ARGs的快速現場檢測。總結：開發了一種基于CRISPR/Cas12a的便攜式可視化生物傳感器，用于快速現場檢測和評估廢水中的ARG。從取樣到出結果的檢測過程在2小時內完成，不需要復雜的儀