標題微生物限度檢查操作規程編碼：KF-SOP-07-13-2共19頁第1頁起草人審核人批準人起草日期審核日期批準日期起草部門質量管理部頒發部門辦公室生效日期一、范圍：本標準規定了微生物限度的檢查方法和操作規定；合用于檢品需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數、控制菌的檢查。二、引用標準：《中國藥典》2023年版(通則1105-1106)三、目錄1．微生物限度標準2．設備、儀器及用品3．消毒液、稀釋劑、試液及培養基4．檢查總則（通則1105：非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法，通則1106非無菌產品微生物限度檢查：控制菌檢查法）5．微生物計數法檢查6．控制菌檢查法7．實驗技術8.附件1．微生物限度標準非無菌藥用原料及輔料的微生物限度標準需氧菌總數(cfu/g或cfu/ml)霉菌和酵母菌總數(cfu/g或cfu/ml)控制菌藥用原料及輔料103102**未做統一規定。1.1成品微生物限度標準品名法定標準內控標準需氧菌總數(cfu/g或cfu/ml)霉菌和酵母菌總數(cfu/g或cfu/ml)控制菌需氧菌總數(cfu/g或cfu/ml)霉菌和酵母菌總數(cfu/g或cfu/ml)控制菌大腸埃希菌沙門菌大腸埃希菌沙門菌乳糖≤1000≤100—無≤100≤50——無水乳糖≤100≤10—/10g—/100g≤100≤10—/10g—/100g蔗糖無無無無≤100≤50——(1)．“—”為不得檢出。(2)．目測霉變者以不合格論。(3)．“無”為標準依據或無相應規定。標題微生物限度檢查操作規程編碼：KF-SOP-07-13-2共19頁第2頁1.2工藝用水微生物限度標準品名法定標準內控標準需氧菌總數(cfu/ml)控制菌（MPN/100mL或CFU/100mL）需氧菌總數(cfu/ml)控制菌（MPN/100mL或CFU/100mL）生活飲用水≤100不得檢出≤100不得檢出純化水≤lOO不得檢出≤80不得檢出1.3內包裝材料微生物限度標準品名(單位)需氧菌總數霉菌和酵母菌總數控制菌需氧菌總數霉菌和酵母菌總數控制菌藥用聚乙烯烴塑料袋(100cm2)≤1000cfu≤100cfu—≤100cfu≤10cfu—說明： 1．“—”為每100cm2中不得檢出。2．目測霉變者以不合格論。3．“無”為標準依據或無相應規定。2．設施、儀器及用品2.1、設施：2.1.1．微生物限度檢查室及相關設施：微生物計數實驗環境應符合微生物限度檢查的規定。檢查全過程必須嚴格遵守無菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區域、工作臺面及環境應定期進行監測。2.1.2．其他設備：高壓蒸汽滅菌器；細菌培養箱（30~35℃）；霉菌培養箱（25~28℃）；電爐（或其他適宜的加熱裝置）；恒溫水浴；電熱干燥箱（250~300℃）；電冰箱。生化試劑儲存箱。2.2儀器及器皿2.2.1．菌落計數器；顯微鏡（1500X）；電子天平或藥物天平（感量0.1g）；pH系列比色計。2.2.2．玻璃器皿：錐形瓶（250~300ml，內裝玻璃珠若干）、研缽（玻璃或陶瓷制，∮10~12cm）、培養皿（∮9cm）、量筒（100ml）、試管（18×180mm）及塞、吸管（1ml分度0.01，10ml分度0.1）、載玻片、蓋玻片、玻璃消毒缸（帶蓋）。2.2.3新購的玻璃器皿的清潔：先用流水沖洗，浸泡于1%~2%鹽酸（工業用）液中約2~6小時，除去游離堿質，再用流水沖洗。用于化學分析的玻璃儀器，需用重鉻酸鉀清潔液浸泡數分鐘后，再用流水沖洗，最后以純化水涮洗2~3次，晾干備用。2.3用過的玻璃器皿：2.3.1未被病原微生物污染的器皿：可隨時洗滌。用清水沖洗（或浸泡），除容量儀器外，可用毛刷和肥皂粉，內外刷洗，再用清水涮洗干凈，晾干備用。容量儀器宜用清潔液浸泡或涮洗，再用流水沖洗，最后以純化水涮洗2~3次。標題微生物限度檢查操作規程編碼：KF-SOP-07-13-2共19頁第3頁2.3.2已被病原微生物污染的器皿：需先通過滅菌解決后再按常法洗滌。試管及培養皿：先正放或直立于高壓蒸汽滅菌器內，經121℃滅菌30分鐘。趁熱傾出培養物，再以清水或用毛刷及肥皂粉刷洗，最后以流水涮凈。吸管：所有直立浸沒于清潔液的長筒形容器中，筒底應襯有棉或橡皮墊，以防管尖損壞。24小時后，逐支用流水反復沖洗潔凈，晾干后包扎滅菌備用。載、蓋玻片：應分別浸泡于清潔液12~24小時后，取出用流水沖洗，再放入3%~5%肥皂水或5%碳酸鈉液內煮沸10~15分鐘，待自然冷卻后，再用流水沖洗。瀝干后置95%乙醇中浸泡，晾干備用。2，3，3玻璃器皿用前應洗滌干凈，無殘留抗菌物質。吸管口上端距0.5cm處塞入約2cm的適宜疏松棉花，置吸管桶內或牛皮紙袋中。錐形瓶、量筒、試管均應加棉塞或硅膠塞，若用振蕩器制備混懸液時，尚需用玻璃紙包裹瓶塞（以免振蕩時供試液污染瓶塞），再用牛皮紙包扎。玻璃器皿，均于160℃干熱滅菌2小時或高壓蒸汽121℃滅菌30分鐘，烘干備用。2.4用品2.4.1大、小橡皮乳頭（放于干凈帶蓋的容器中，并應定期用70%~75%乙醇溶液浸泡）。2.4.2無菌衣、帽、口罩、手套（洗凈后配套，用牛皮紙包嚴）滅菌，備用。也可用一次性無菌衣、帽、口罩、手套。2.4.3接種環（白銥金或鎳鉻合金，環徑4~5mm、長度6~10cm）、乙醇燈、乙醇棉球或碘伏棉球、滅菌剪刀或滅菌手術刀和滅菌鑷子、滅菌稱樣紙、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號筆、白瓷盤、洗手盆、陶瓦蓋（12cm）、實驗記錄紙等。3消毒液、稀釋劑、試液及培養基3.1消毒液、稀釋劑及試液。3.1.10.1%苯扎溴銨溶液：供洗手、擦拭操作臺面用。3.1.25%石碳酸溶液：配制后裝入玻璃消毒缸內，供消毒帶菌吸管用，抑或選用其他適宜消毒液。3.1.3．75%乙醇溶液：配好后制乙醇棉球，供擦手、擦拭操作工具用。3.1.4．0.9%無菌氯化鈉溶液：取氯化鈉9.0g，加水使溶解成1000ml，121℃滅菌20分鐘。3.1.5．司盤-80、單硬脂酸甘油酯、吐溫-80：供非水溶性供試品供試液制備用。3.1.6．無菌0.1%氯化三苯四氮唑溶液（TTC）：取氯化三苯四氮唑0.1g，加水使溶解成10ml。3.1.7．甲基紅指示液：取甲基紅0.1g，加入95%乙醇300ml，水適量，使溶解，再加水至500ml。3.1.8．V-P試液：①氫氧化鉀試液：取氫氧化鉀40.0g，加水使溶解成100ml；②α-萘酚乙醇試液：取α-萘酚6.0g，加無水乙醇使溶解成100ml。3.1.9．革蘭染色液：①沙黃染液：取沙黃0.25g，加95%的乙醇10ml，使完全溶解后，加水至100ml；②結晶紫染液：取結晶紫1.0g，加95%的乙醇20ml，使溶解，加1%的草酸銨溶液80ml，混勻。靜置48小時使用，置密閉棕色瓶中儲存；③碘試液：取碘化鉀2.0g，加水3~5ml使溶解，加入碘片1.0g，使所有溶解后，加水稀釋至300ml，置密標題微生物限度檢查操作規程編碼：KF-SOP-07-13-2共19頁第4頁閉棕色瓶中儲存。3.1.10．中性紅指示液：取中性紅1.0g，研細，加95%乙醇60ml，使溶解，再加水到100ml。變色范圍pH6.8~8.0（紅→黃）。3.1.11．亞甲藍指示液：取亞甲藍0.5g，加水使溶解成100ml。3.1.12．溴麝香草酚藍指示液：取溴麝香草酚藍0.4g，加1mol/L氫氧化鈉溶液0.64ml使溶解，再加水至100ml。變色范圍pH6.0~7.6（黃→藍）。3.1.13．酸性品紅指示液：以酸性品紅0.5g，加水100ml使溶解，再逐漸加1mol/L氫氧化鈉溶液16ml，每加1滴均應將溶液充足搖勻后再加第二滴，直至溶液呈草黃色；于沸水內保持15分鐘，再靜置2小時，濾過，即得。優點：無色，在倒管內初期發酵易觀測，不易被還原。變色范圍pH6.0~7.4（紅→黃）。3.1.14．曙紅鈉指示液：取曙紅鈉2.0g，加水使溶解成100ml。3.1.15．靛基質試液：取對二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95%乙醇95ml，充足振搖，使完全溶解后，取濃鹽酸20ml漸漸滴入，邊加邊振搖，以免驟熱導致溶液色澤變深，置冰箱保存，備用。3.2培養基3.2.1．培養基的制備及儲存3,2,1,1溶化：一般應放在玻璃器皿或搪瓷器內。加入純化水，隔水加熱以促其溶解，加熱時應經常攪拌，防止焦結，待其溶解后補足水分。3.2.1.2在使用干燥培養基時，先將純化水按定量加入容器中，然后稱取一定量培養基干粉放入水中，靜置10~15分鐘，攪拌，振蕩，或延長時間以促進溶解，一般不要加熱，必要時加熱，但時間不宜過長，溫度不宜過高，避免某些營養成分被破壞。3.2.1.3校正酸堿度：培養基必須有適當的pH值。測定pH值是培養基配制過程中的重要環節之一，干燥培養基一般已校正過pH值，用時也必須再驗證。pH值測定期，一般用指示劑滴入培養基中觀測其顏色的變化，或用pH計校正，如與所需pH值不符，可用酸或堿液加以校正。一般用氫氧化鈉校正的弱堿性培養基，高壓滅菌前培養基的pH值高0.2左右，滅菌后基本合適。調整pH值后要加熱過濾，使培養基澄清。3.2.2培養基的分裝：3.2.2.1液體、半固體培養基一般在高壓滅菌前分裝，約裝試管容積的1/3，在滅菌后還要加入成分的液體、半固體培養基，滅菌后再分裝于滅菌試管或錐形瓶中。3.2.2.2固體培養基一般分裝在250ml、500ml錐形瓶中，高壓滅菌后根據需要分裝平皿或試管。平皿：如傾注平皿，應在無菌室中放置3～4小時，如用塑料平皿須在35℃培養箱中倒置30～60分鐘。水蒸氣會自然蒸發。斜面：制備低層斜面分裝于試管，約占容積的1/5，滅菌后趁熱斜放于細玻璃棒和木桿上，使成斜度，分裝時注意管口和瓶塞上勿沾有培養基，避免污染。制備高層斜面分裝于試管，約占試管容積的1/3，滅菌后趁熱放置成高層短斜面，待其凝固后應用。3.2.3培養基的滅菌：培養基的滅菌多采用高壓蒸汽滅菌，各種培養基的滅菌時間和壓力，按其成分不同而定。普通培養基多采用121℃、103.42kPa滅菌15分鐘，但容器和裝量較大時，可延長至20分鐘。高壓滅菌應嚴格按照操作規程進行，必須逐漸加熱，徹底排除滅菌器內的冷空氣，再逐漸升壓保持預定的壓力和時間，達成全殺滅微生物的目的。標題微生物限度檢查操作規程編碼：KF-SOP-07-13-2共19頁第5頁3.2.4培養基的儲存：保存培養基的時間需視培養基中水分蒸發的限度及有無污染而定，已制備好培養基要保存于冷暗處或冰箱中，但由于各種培養基的性質不同，不也許固定一個保存期限。制備好的平板或試管培養基，為防止水分蒸發，應置于塑料袋內，4℃保存，可延長使用期限。微量生化反映管熔封于細玻管內，室溫下可保存1年左右。3.3注意事項：3.3.1采用干燥培養基時，按說明配制，應對滅菌后的培養基pH值進行校驗。若為自配培養基，原料應挑選，瓊脂凝固力應測定，以擬定配制時瓊脂的用量。試劑規格規定應為化學純（CP）以上規格，其中不能具有對細菌、霉菌、大腸桿菌生長有害的克制物。3.3.2配制的培養基不應當有沉淀，如有沉淀，應于溶化后趁熱過濾，并應于2小時內滅菌，避免細菌繁殖。3.3.3培養基的分裝量不得超過容器的2/3，以免滅菌時溢出。包裝時，塞子必須塞緊，以免松動或脫落導致染菌。3.3.4配制培養基的pH值測定期，其波動范圍應在規定的pH±0.2之內，還需注意高壓滅菌后的pH值變化。3.3.5每批培養基均應有配制記錄，涉及名稱、配制量（各種成分用量）、配制者、校對者、配制日期以及性能和無菌實驗。3.3.6每批培養基在用于樣品的分離鑒定之前均應作性能實驗，以保證微生物檢查的質量。性能實驗須用已知標準菌株進行預試，符合規定方可應用。3.3.7棉塞以普通棉花制作，棉塞松緊應適宜，過松易污染雜菌，過緊影響透氣性；每次用后需高壓滅菌并隨即烘干，要防塵、防霉；變硬無彈力時需更換。3.3.8各種試管應先配上合適的棉塞，待高壓滅菌后再分裝培養基，可防止污染。3.3.9培養基配制時，應先將有沉淀物的原料如蛋白胨、牛肉膏、鹽類和瓊脂配好，經調節pH值、加熱并煮沸溶化后再濾清；濾清時注意趁熱過濾，濾除異物、沉淀后，應將蒸發失去的溶液量按原溶液量加純化水補足。3.3.10應嚴格遵守各種培養基規定的滅菌溫度和時間，滅菌后培養基不得有混濁現象，每瓶配制并滅菌后的培養基、稀釋劑均應在外表清楚標明滅菌日期。3.3.11每批稀釋劑、培養基均應有空白實驗，合格后方能使用。3.3.12滅菌后的培養基在冷暗處保存，放置時間不能過長，一般在兩周內用完。久存培養基失水過多、固體干涸變形、液體出現沉淀、棉塞松弛或脫落者均不得使用。已熔化的培養基應一次用完，啟動后不宜再用。3.3.13勿用電爐直接熔化瓊脂培養基，以免營養成份過度受熱而破壞，應用水浴或微波爐加熱。4.檢查總則（1105非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法）4.1微生物計數法合用范圍：系用于能在有氧條件下生長的嗜溫細菌和真菌的計數。當本法用于檢查非無菌制劑及其原、輔料等是否符合相應的微生物限度標準時，應按下述規定進行檢查，涉及樣品的取樣量和結果的判斷等。除另有規定外，本法不合用于活菌制劑的檢査。如供試品有抗菌活性，應盡也許去除或中和。供試品檢査時，若使用了中和劑或滅活劑，應確認其有效性及對微生物無毒性。供試液制備時假如使用了表面活性劑，應確認其對微生物無毒性以及與所使用中和劑或滅活劑的相容性。標題微生物限度檢查操作規程編碼：KF-SOP-07-13-2共19頁第6頁4.2微生物計數法4.2.1合用性實驗用菌株(表1)實驗菌株實驗菌液的制備計數培養基合用性檢查計數方法合用性實驗需氧菌總數計數霉菌和酵母菌總數計數需氧菌總數計數霉菌和酵母菌總數計數金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CCMCC(B)26003〕胰酪大豆胨瓊脂培養基或胰酪大豆胨液體培養基，培養溫度30?35C，培養時間18?24小時胰酪大豆胨瓊脂培養基和胰酪大豆胨液體培養基，培養溫度30-35℃培養時間不超過3天，接種量不大于100cfu胰酪大豆胨瓊脂培養基或胰酪大豆胨液體培養基（MPN法），培養溫度30-35℃,培養時間不超過3天，接種量不大于100cfu銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)CCMCC(B)10104胰酪大豆胨瓊脂培養基或胰酪大豆胨液體培養基，培養溫度30-35℃，培養時間18?24小時胰酪大豆胨瓊脂培養基和胰酪大豆胨液體培養基，培養溫度30-35℃培養時間不超過3天，接種量不大于100cfu胰酪大豆胨瓊脂培養基或胰酪大豆胨液體培養基（MPN法），培養溫度30-35℃，培養時間不超過3天，接種量不大于100cfu枯草芽孢桿菌{.Bacillussubtilis)〔CMCC(B)63501〕胰酪大豆胨瓊脂培養基或胰酪大豆胨液體培養基，培養溫度30-35℃培養時間18-24小時胰酪大豆胨瓊脂培養基和胰酪大豆胨液體培養基，培養溫度30-35℃培養時間不超過3天，接種量不大于lOOcfu胰酪大豆胨瓊脂培養基或胰酪大豆胨液體培養基（MPN法），培養溫度30-35℃，培養時間不超過3天，接種量不大于lOOcfu白色念珠菌(Candidaalbicans)CCMCC(F)98001〕沙氏葡萄糖瓊脂培養基或沙氏葡萄糖液體培養基，培養溫度20-25℃培養時間2-3天胰酪大豆胨瓊脂培養基，培養溫度30-35℃培養時間不超過5天，接種量不大于lOOcfu沙氏葡萄糖瓊脂培養基，培養溫度20-25℃培養時間不超過5天，接種量不大于lOOcfu胰酪大豆胨瓊脂培養基（MPN法不合用）培養溫度30?35°C，培養時間不超過5天，接種量不大于lOOcfu沙氏葡萄糖瓊脂培養基，培養溫度20-25℃培養時間不超過5天，接種量不大于lOOcfu標題微生物限度檢查操作規程編碼：KF-SOP-07-13-2共19頁第7頁黑曲霉（Asper君山wsniger)CCMCC(F)98003〕沙氏葡萄糖瓊脂培養基或馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基，培養溫度20-25℃培養時間5?7天，或直到獲得豐富的孢子胰酪大豆胨瓊脂培養基，培養溫度30-35℃培養時間不超過5天，接種量不大于lOOcfu沙氏葡萄糖瓊脂培養基，培養溫度20-25℃培養時間不超過5天，接種量不大于lOOcfu胰酪大豆胨瓊脂培養基（MPN法不合用）培養溫度30-35℃培養時間不超過5天，接種量不大于lOOcfu沙氏葡萄糖瓊脂培養基，培養溫度20-25℃培養時間不超過5天，接種量不大于lOOcfu注：當需用玫瑰紅鈉瓊脂培養基測定霉菌和酵母菌總數時，應進行培養基合用性檢查，檢査方法同沙氏葡萄糖瓊脂培養基。4.2.2計數方法：涉及平皿法、薄膜過濾法和最也許數法（Most-Probable-NumberMethod,簡稱MPN法）。MPN法用于微生物計數時精確度較差，但對于某些微生物污染量很小的供試品，MPN法也許是更適合的方法。供試品檢查時，應根據供試品理化特性和微生物限度標準等因素選擇計數方法，檢測的樣品量應能保證所獲得的實驗結果可以判斷供試品是否符合規定。所選方法的合用性須經確認。計數培養基合用性檢査和供試品計數方法合用性實驗供試品微生物計數中所使用的培養基應進行合用性檢查。供試品的微生物計數方法應進行方法合用性實驗，以確認所采用的方法適合于該產品的微生物計數。若檢查程序或產品發生變化也許影響檢查結果時，計數方法應重新進行合用性實驗。4.2.3菌種及菌液制備4.2.3.1菌種實驗用菌株的傳代次數不得超過5代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術進行保存，以保證實驗菌株的生物學特性。4.2.3.2計數培養基合用性檢查和計數方法合用性實驗用菌株見（表1）。菌液制備按(表1)規定程序培養各實驗菌株。取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的新鮮培養物，用PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液；取黑曲霉的新鮮培養物加人3?5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7_0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的黑曲霉孢子懸液。菌液制備后若在室溫下放置，應在2小時內使用；若保存在2?8℃，可在24小時內使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2?8℃,在驗證過的貯存期內使用。4.2.4陰性對照為確認實驗條件是否符合規定，應進行陰性對照實驗，陰性對照實驗應無菌生長。如陰性對照有菌生長，應進行偏差調查。4.2.5培養基合用性檢査微生物計數用的成品培養基、由脫水培養基或按處方配制的培養基均應進行培養基合用性檢查。按(表1)規定，接種不大于lOOcfu的菌液至胰酪大豆胨液體培養基管或胰酪大豆胨瓊脂培養基平板或沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板，置表1規定條件下培養。每一實驗標題微生物限度檢查操作規程編碼：KF-SOP-07-13-2共19頁第8頁菌株平行制備2管或2個平皿。同時，用相應的對照培養基替代被檢培養基進行上述實驗。被檢固體培養基上的菌落平均數與對照培養基上的菌落平均數的比值應在0.5?2范圍內，且菌落形態大小應與對照培養基上的菌落一致；被檢液體培養基管與對照培養基管比較，實驗菌應生長良好。4.3計數方法合用性實驗4.3.1供試液制備根據供試品的理化特性與生物學特性，采用適宜的方法制備供試液。供試液制備若需加溫時，應均勻加熱，且溫度不應超過45℃。供試液從制備至加入檢查用培養基，不得超過1小時。常用的供試液制備方法如下（假如下列供試液制備方法經確認均不合用，應建立其他適宜的方法）4.3.1.1水溶性供試品取供試品，用PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或PH7.2磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養基溶解或稀釋制成1:10供試液。若需要，調節供試液pH值至6?8。必要時，用同一稀釋液將供試液進一步10倍系列稀釋。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。4.3.1.2水不溶性非油脂類供試品取供試品，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或PH7.2磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養基制備成1:10供試液。分散力較差的供試品，可在稀釋液中加人表面活性劑如0.1%的聚山梨酯80,使供試品分散均勻。若需要，調節供試液pH值至6?8。必要時，用同一稀釋液將供試液進一步10倍系列稀釋。4.3.1.3油脂類供試品取供試品，加人無菌十四烷酸異丙酯使溶解，或與最少量并能使供試品乳化的無菌聚山梨酯80或其他無抑菌性的無菌表面活性劑充足混勻。表面活性劑的溫度一般不超過40t：(特殊情況下，最多不超過45°C)，小心混合，若需要可在水浴中進行，然后加人預熱的稀釋液使成1:10供試液，保溫，混合，并在最短時間內形成乳狀液。必要時，用稀釋液或含上述表面活性劑的稀釋液進一步10倍系列稀釋。4.3.1.4需用特殊方法制備供試液的供試品膜劑供試品取供試品，剪碎，加PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或PH7.2磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養基，浸泡，振搖，制成1:10的供試液。若需要，調節供試液pH值至6?8。必要時，用同一稀釋液將供試液進一步10倍系列稀釋。腸溶及結腸溶制劑供試品取供試品，加人PH6.8無菌磷酸鹽緩沖液（用于腸溶制劑）或PH7.6無菌磷酸鹽緩沖液(用于結腸溶制劑），置45℃水浴中，振搖，使溶解，制成1:10的供試液。必要時，用同一稀釋液將供試液進一步10倍系列稀釋。4.3.1.5氣霧劑、噴霧劑供試品取供試品，置一20°C或其他適宜溫度冷凍約1小時，取出，迅速消毒供試品啟動部位，用無菌鋼錐在該部位鉆一小孔，放至室溫，并輕輕轉動容器，使拋射劑緩緩所有釋出。供試品亦可采用其他適宜的方法取出。用無菌注射器從每一容器中吸出藥液于無菌容器中混合，然后取樣檢査。4.3.1.6貼劑供試品取供試品，去掉防粘層，將粘貼面朝上放置在無菌玻璃或塑料器皿上，在粘貼面上覆蓋一層適宜的無菌多孔材料(如無菌紗布），避免貼膏劑粘貼在一起。將解決后的貼膏劑放入盛有適宜體積并具有表面活性劑（如聚山梨酯80或卵磷脂）稀釋液的容器中，振蕩至少30分鐘。必要時，用同一稀釋液將供試液進一步10倍系列稀釋。標題微生物限度檢查操作規程編碼：KF-SOP-07-13-2共19頁第9頁4.3.2.接種和稀釋按下列規定進行供試液的接種和稀釋，制備微生物回收實驗用供試液。所加菌液的體積應不超過供試液體積的1%。為確認供試品中的微生物能被充足檢出，一方面應選擇最低稀釋級的供試液進行計數方法合用性實驗。4.3.2.1實驗組取上述制備好的供試液，加入實驗菌液，混勻，使每lml供試液或每張濾膜所濾過的供試液中含菌量不大于lOOcfu。4.3.2.2供試品對照組取制備好的供試液，以稀釋液代替菌液同實驗組操作。4.3.2.3菌液對照組取不含中和劑及滅活劑的相應稀釋液替代供試液，按實驗組操作加人實驗菌液并進行微生物回收實驗。4.3.2.4若因供試品抗菌活性或溶解性較差的因素導致無法選擇最低稀釋級的供試液進行方法合用性實驗時，應采用適宜的方法對供試液進行進一步的解決。假如供試品對微生物生長的克制作用無法以其他方法消除，供試液可通過中和、稀釋或薄膜過濾解決后再加人實驗菌懸液進行方法合用性實驗。4.4抗菌活性的去除或滅活供試液接種后，按下列“微生物回收”規定的方法進行微生物計數。若實驗組菌落數減去供試品對照組菌落數的值小于菌液對照組菌落數值的50%,可采用下述方法消除供試品的抑菌活性。4.4.1增長稀釋液或培養基體積。4.4.2加入適宜的中和劑或滅活劑。中和劑或滅活劑（表2)可用于消除干擾物的抑菌活性，最佳在稀釋液或培養基滅菌前加入。若使用中和劑或滅活劑，實驗中應設中和劑或滅活劑對照組，即取相應量稀釋液替代供試品同實驗組操作，以確認其有效性和對微生物無毒性。中和劑或滅活劑對照組的菌落數與菌液對照組的菌落數的比值應在0.5?2范圍內。表2常見干擾物的中和劑或滅活方法干擾物可選用的中和劑或滅活方法戊二醛、汞制劑酚類、乙醇、醛類、醛類季銨化合物、對羥基苯甲酸、雙胍類化合物季銨化合物、碘、對羥基苯甲酸水銀水銀、汞化物、醛類EDTA、唆喏酮類抗生素磺胺類β內酰胺類抗生素亞硫酸氫鈉吸附物稀釋法甘氨酸卵磷脂聚山梨酯巰基醋酸鹽硫代硫酸鹽鎂或鈣離子對氨基苯甲酸β內酰胺酶4.4.3采用薄膜過濾法^4.4.4上述幾種方法的聯合使用。若沒有適宜消除供試品抑菌活性的方法，對特定實驗菌回收的失敗，表白供試品對該實驗菌具有較強抗菌活性，同時也表白供試品不易被該類微生物污染。但是，供試品也也許僅對特定實驗菌株具有克制作用，而對其他菌株沒標題微生物限度檢查操作規程編碼：KF-SOP-07-13-2共19頁第10頁有克制作用。因此，根據供試品須符合的微生物限度標準和菌數報告規則，在不影響檢查結果判斷的前提下，應采用能使微生物生長的更高稀釋級的供試液進行計數方法合用性實驗。若方法合用性實驗符合規定，應以該稀釋級供試液作為最低稀釋級的供試液進行供試品檢査。4.5供試品中微生物的回收表1所列的計數方法合用性實驗用的各實驗菌應逐個進行微生物回收實驗。微生物的回收可采用平皿法、薄膜過濾法或MPN法。4.5.1平皿法平皿法涉及傾注法和涂布法。表1中每株實驗菌每種培養基至少制備2個平皿，以算術均值作為計數結果。傾注法：取照上述“供試液的制備”“接種和稀釋”和“抗菌活性的去除或滅活”制備的供試液lml，置直徑90mm的無菌平皿中，注入15?20ml溫度不超過45℃熔化的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養基，混勻，凝固，倒置培養。若使用直徑較大的平皿，培養基的用量應相應增長。按表1規定條件培養、計數。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數。計算各實驗組的平均菌落數。涂布法：取15?20ml溫度不超過45℃的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養基，注人直徑90mm的無菌平皿，凝固，制成平板，采用適宜的方法使培養基表面干燥。若使用直徑較大的平皿，培養基用量也應相應增長。每一平板表面接種上述照“供試液的制備”“接種和稀釋”和“抗菌活性的去除或滅活”制備的供試液不少于0.1ml。按表1規定條件培養、計數。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數。計算各實驗組的平均菌落數。4.5.2薄膜過濾法薄膜過濾法所采用的濾膜孔徑應不大于0.45pm，直徑一般為50mm，若采用其他直徑的濾膜，沖洗量應進行相應的調整。供試品及其溶劑應不影響濾膜材質對微生物的截留。濾器及濾膜使用前應采用適宜的方法滅菌。使用時，應保證濾膜在過濾前后的完整性。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和濾器在使用前應充足干燥。為發揮濾膜的最大過濾效率，應注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試液經薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量一般為100ml。總沖洗量不得超過1000ml，以避免濾膜上的微生物受損傷。取照上述“供試液的制備”“接種和稀釋”和“抗菌活性的去除或滅活”制備的供試液適量（一般取相稱于lg、lml或10cm2的供試品，若供試品中所含的菌數較多時，供試液可酌情減量），加至適量的稀釋液中，混勻，過濾。用適量的沖洗液沖洗濾膜。若測定需氧菌總數，轉移濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養基平板上；若測定霉菌和酵母總數，轉移濾膜菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板上。按表1規定條件培養、計數。每株實驗菌每種培養基至少制備一張濾膜。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數。4.5.3MPN法MPN法的精密度和準確度不及薄膜過濾法和平皿計數法，僅在供試品需氧菌總數沒有適宜計數方法的情況下使用，本法不合用于霉菌計數。若使用MPN法，按下列環節進行。取照上述“供試液的制備”“接種和稀釋”和“抗菌活性的去除或滅活”制備的供試液至少3個連續稀釋級，每一稀釋級取3份lml分別接種至3管裝有9?10ml胰酪大豆胨液體培養基中，同法測定菌液對照組菌數。必要時可在培養基中加入表面活性劑、中和劑或滅活劑。接種管置30?35°C培養3天，逐日觀測各管微生物生長情況。假如由于供試品的因素使得結果難以判斷，可將該管培養物轉種至胰標題微生物限度檢查操作規程編碼：KF-SOP-07-13-2共19頁第11頁酪大豆胨液體培養基或胰酪大豆胨瓊脂培養基，在相同條件下培養1?2天，觀測是否有微生物生長。根據微生物生長的管數從表3查被測供試品每lg或每lml中需氧菌總數的最也許數。表3微生物最也許數檢索表生長管數需氧菌總數最也許數95%置信限每管含樣品的g或ml數MPN/g或ml下限上限0.10.010.001000<309.4001309.501030.1100116.11.2170206.21.2170309.43.5351003.60.2171017.21.217102114351107.41.320111114351201143512115538130165382009.21.535201144352022053821015438211205382122799422021540221289942223599423029994231369943002359430138910430264161813104391813117517190標題微生物限度檢查操作規程編碼：KF-SOP-07-13-2共19頁第12頁312120303603131603038032093183603211503038032221030400323290909903302409099033146090198033211002004000333>1100注：表內所列檢查量如改用lg(或ml)、0.lg(或ml)和O.Olg(或ml)時，表內數字應相應減少10倍；如改用O.Olg(或ml)、O.OOlg(或ml)和O.OOOlg(或ml)時，表內數字應相應增長10倍，其余類推。5.微生物計數法檢查5.1計數方法合用性實驗中，采用平皿法或薄膜過濾法時，實驗組菌落數減去供試品對照組菌落數的值與菌液對照組菌落數的比值應在0.5?2范圍內；采用MPN法時，實驗組菌數應在菌液對照組菌數的95%置信限內。若各實驗菌的回收實驗均符合規定，照所用的供試液制備方法及計數方法進行該供試品的需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數計數。方法合用性確認時，若采用上述方法還存在一株或多株實驗菌的回收達不到規定，那么選擇回收最接近規定的方法和實驗條件進行供試品的檢査。5.2供試品檢查5.2.1檢查量：檢查量即一次實驗所用的供試品量(g、ml或cm2)。一般應隨機抽取不少于2個最小包裝的供試品，混合，取規定量供試品進行檢查。除另有規定外，一般供試品的檢查量為10g或10ml;膜劑為100cm2;貴重藥品、微量包裝藥品的檢查量可以酌減。檢查時，應從2個以上最小包裝單位中抽取供試品，大蜜丸還不得少于4丸，膜劑還不得少于4片。5.2.2供試品的檢査按計數方法合用性實驗確認的計數方法進行供試品中需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數的測定。胰酪大豆胨瓊脂培養基或胰酪大豆胨液體培養基用于測定需氧菌總數；沙氏葡萄糖瓊脂培養基用于測定霉菌和酵母菌總數陰性對照實驗以稀釋液代替供試液進行陰性對照實驗，陰性對照實驗應無菌生長，假如陰性對照有菌生長，應進行偏差調査。5.3平皿法平皿法涉及傾注法和涂布法。除另有規定外，取規定量供試品，按方法合用性實驗確認的方法進行供試液制備和菌數測定，每稀釋級每種培養基至少制備2個平板。培養和計數除另有規定外，胰酪大豆胨瓊脂培養基平板在30?35°C培養3?5天，沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板在20?25°C培養5?7天，觀測菌落生長情況，點計平板上生長的所有菌落數，計數并報告。菌落蔓延生長成片的平板不宜計數。點計菌落數后，計算各稀釋級供試液的平均菌落數，按菌數報告規則報告菌數。若同稀釋級兩個平板的菌落數平均值不小于15，則兩個平板的菌落數不能相差1倍或以上。菌數報告規則需氧菌總數標題微生物限度檢查操作規程編碼：KF-SOP-07-13-2共19頁第13頁測定宜選取平均菌落數小于300cfu的稀釋級、霉菌和酵母菌總數測定宜選取平均菌落數小于lOOcfu的稀釋級，作為菌數報告的依據。取最髙的平均菌落數，算lg、lml或10cm2供試品中所含的微生物數，取兩位4效數字報告。如各稀釋級的平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級的平板有菌落生長，但平均菌落數小于1時，以<1乘以最低稀釋倍數的值報告菌數。5.4薄膜過濾法除另有規定外，按計數方法合用性實驗確認的方法進行供試液制備。取相稱于lg、lml或10cm2供試品的供試液，若供試品所含的菌數較多時，可取適宜稀釋級的供試液，照方法合用性實驗確認的方法加至適量稀釋液中，立即過濾，沖洗，沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養基或沙氏葡萄糖瓊脂培養基上培養。培養和計數培養條件和計數方法同平皿法，每張濾膜上的菌落數應不超過lOOcfu菌數報告規則以相稱于lg、lml或10cm2供試品的菌落數報告菌數；若濾膜上無菌落生長，以<1報告菌數（每張濾膜過濾lg、lml或10cm2供試品），或<1乘以最低稀釋倍數的值報告菌數。5.5MPN法取規定量供試品，按方法合用性實驗確認的方法進行供試液制備和供試品接種，所有實驗管在30?35X：培養3?5天，假如需要確認是否有微生物生長，按方法合用性實驗擬定的方法進行。記錄每一稀釋級微生物生長的管數，從表3査每lg或lml供試品中需氧菌總數的最也許數。5.6結果判斷需氧菌總數是指胰酪大豆胨瓊脂培養基上生長的總菌落數(涉及真菌菌落數霉菌和酵母菌總數是指沙氏葡萄糖瓊脂培養基上生長的總菌落數(涉及細菌菌落數）。若因沙氏葡萄糖瓊脂培養基上生長的細菌使霉菌和酵母菌的計數結果不符合微生物限度規定，可使用含抗生素（如氯霉素、慶大霉素）的沙氏葡萄糖瓊脂培養基或其他選擇性培養基（如玫瑰紅鈉瓊脂培養基)進行霉菌和酵母菌總數測定。使用選擇性培養基時，應進行培養基合用性檢查。若采用MPN法，測定結果為需氧菌總數。各品種項下規定的微生物限度標準解釋如下：lOcfu：可接受的最大菌數為20;102cfu：可接受的最大菌數為200;103cfu：可接受的最大菌數為2023，依此類推。若供試品的需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數的檢査結果均符合該品種項下的規定，判供試品符合規定；若其中任何一項不符合該品種項下的規定，判供試品不符合規定。6．控制菌檢查法（非無菌產品微生物限度：控制菌檢查法）6.1控制菌檢查法系用于在規定的實驗條件下，檢査供試品中是否存在特定的微生物。當本法用于檢查非無菌制劑及其原、輔料等是否符合相應的微生物限度標準時，應按下列規定進行檢查，涉及樣品取樣量和結果判斷等^6.1.1供試品檢出控制菌或其他致病菌時，按一次檢出結果為準，不再復試。6.1.2供試液制備及實驗環境規定同“非無菌產品微生物限度6.1.3檢查：微生物計數法(通則1105)”。標題微生物限度檢查操作規程編碼：KF-SOP-07-13-2共19頁第14頁6.1.4假如供試品具有抗菌活性，應盡也許去除或中和。供試品檢查時，若使用了中和劑或滅活劑，應確認有效性及對微生物無毒性。供試液制備時假如使用了表面活性劑，應確認其對微生物無毒性以及與所使用中和劑或滅活劑的相容性。6.2培養基合用性檢查和控制菌檢查方法6.2.1合用性實驗6.2.1.1供試品控制菌檢查中所使用的培養基應進行合用性檢査。6.2.1.2供試品的控制菌檢查方法應進行方法合用性實驗，以確認所采用的方法適合于該產品的控制菌檢查。6.2.1.3若檢查程序或產品發生變化也許影響檢查結果時，控制菌檢查方法應重新進行合用性實驗。6.2.2菌種及菌液制備菌種實驗用菌株的傳代次數不得超過5代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術進行保存，以保證實驗菌株的生物學特性。金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus)CCMCC(B)26003〕銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa)￡CMCC(B)10104〕大腸埃希菌(EsdieWchacoa)CCMCC(B)44102〕乙型副傷寒沙門菌（SalmonellaparatyphiB)CCMCC(B)50094〕白色念珠菌（canidiaAlbicans)CCMCC(F)98001〕生孢梭菌（Clostridiumsporogenes）CCMCC(B)64941〕菌液制備將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、沙門菌分別接種于胰酪大豆胨液體培養基中或在胰酪大豆胨瓊脂培養基上，30?35°C培養18?24小時；將白色念珠菌接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養基上或沙氏葡萄糖液體培養基中，20?25°C培養2?3天；將生孢梭菌接種于梭菌增菌培養基中置厭氧條件下30?35°C培養24?48小時或接種于硫乙醇酸鹽流體培養基中30?35°C培養18?24小時。上述培養物用PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液。菌液制備后若在室溫下放置，應在2小時內使用；若保存在2?8°C，可在24小時內使用。生孢梭菌孢子懸液可替代新鮮的菌懸液，孢子懸液可保存在2?8*C，在驗證過的貯存期內使用。6.2.3陰性對照為確認實驗條件是否符合規定，應進行陰性對照實驗，陰性對照實驗應無菌生長。如陰性對照有菌生長，應進行偏差調查。6.2.4培養基合用性檢查6.2.4.1控制菌檢查用的成品培養基、由脫水培養基或按處方配制的培養基均應進行培養基的合用性檢查。控制菌檢査用培養基的合用性檢查項目涉及促生長能力、克制能力及指示特性的檢查。各培養基的檢查項目及所用的菌株見表1。6.2.4.2液體培養基促生長能力檢査分別接種不大于lOOcfu的實驗菌(表1)于被檢培養基和對照培養基中，在相應控制菌檢查規定的培養溫度及不大于規定的最短培養時間下培養，與對照培養基管比較，被檢培養基管實驗菌應生長良好。6.2.4.3固體培養基促生長能力檢査用涂布法分別接種不大于lOOcfu的實驗菌（表1)于被檢培養基和對照培養基平板上，在相應控制菌檢査規定的培養溫度及不大于規定的最短培養時間下培養，被檢培養基與對照培養基上生長的菌落大小、形態特性應一致。標題微生物限度檢查操作規程編碼：KF-SOP-07-13-2共19頁第15頁表1控制菌檢査用培養基的促生長能力、克制能力和指示特性控制菌檢査培養基特性實驗菌株耐膽鹽革蘭陰性菌腸道菌增菌液體培養基紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基促生長能力克制能力促生長能力+指示特性大腸埃希菌、銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌大腸埃希菌、銅綠假單胞菌大腸埃希菌麥康凱液體培養基麥康凱瓊脂培養基促生長能力克制能力促生長能力+指樂特性大腸埃希菌金黃色葡萄球菌大腸埃希菌沙門菌RV沙門菌增菌液體培養基木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基三糖鐵瓊脂培養基促生長能力克制能力促生長能力+指示特性指示能力乙型副傷寒沙門菌金黃色葡萄球菌乙型副傷寒沙門菌乙型副傷寒沙門菌銅綠假單胞菌溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基促生長能力克制能力銅綠假單胞菌大腸埃希菌金黃色葡萄球菌甘露醇氯化鈉瓊脂培養基促生長能力+指示特性克制能力金黃色葡萄球菌大腸埃希菌梭菌梭菌增菌培養基哥倫比亞瓊脂培養基促生長能力促生長能力生孢梭菌生孢梭菌白色念珠菌沙氏葡萄糖液體培養基沙氏葡萄糖瓊脂培養基念珠菌顯色培養基促生長能力促生長能力+指示特性促生長能力+指示能力克制能力白色念珠菌白色念珠菌白色念珠菌大腸埃希菌培養基克制能力檢査接種不少于lOOcfu的實驗菌（表1)于被檢培養基和對照培養基中，在相應控制菌檢査規定的培養溫度及不小于規定的最長培養時間下培養，實驗菌應不得生長。培養基指示特性檢査用涂布法分別接種不大于lOOcfu的實驗菌（表1)于被檢培養基和對照培養基平板上，在相應控制菌檢查規定的培養溫度及不大于規定的最短培養時間下培養，被檢培養基上實驗菌生長的菌落大小、形態特性、指示劑反映情況等應與對照培養基一致。6.3控制菌檢壷方法合用性實驗6.3.1供試液制備按下列“供試品檢査”中的規定制備供試液。實驗菌根據各品種項下標題微生物限度檢查操作規程編碼：KF-SOP-07-13-2共19頁第16頁微生物限度標準中規定檢查的控制菌選擇相應實驗菌株，確認耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法時，采用大腸埃希菌和銅綠假單胞菌為實驗菌。合用性試狳按控制菌檢査法取規定量供試液及不大于lOOcfu的實驗菌接人規定的培養基中；采用薄膜過濾法時，取規定量供試液，過濾，沖洗，在最后一次沖洗液中加人實驗菌，過濾后，注人規定的培養基或取出濾膜接人規定的培養基中。依相應的控制菌檢査方法，在規定的溫度和最短時間下培養，應能檢出所加實驗菌相應的反映特性。結果判斷上述實驗若檢出實驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢查方法進行供試品檢查；若未檢出實驗菌，應消除供試品的抑菌活性[見非無菌產品微生物檢査：微生物計數法(通則1105)中的“抗菌活性的去除或滅活”]，并重新進行方法合用性實驗。6.3.2假如通過實驗確證供試品對實驗菌的抗菌作用無法消除，可認為受克制的微生物不易存在于該供試品中，選擇抑菌成分消除相對徹底的方法進行供試品的檢查。6.4供試品檢査：供試品的控制菌檢查應按經方法合用性實驗確認的方法進行。6.5陽性對照實驗陽性對照實驗：方法同供試品的控制菌檢查，對照菌的加量應不大于lOOcfu。陽性對照實驗應檢出相應的控制菌。6.6陰性對照實驗：以稀釋劑代替供試液照相應控制菌檢查法檢查，陰性對照實驗應無菌生長。假如陰性對照有菌生:長，應進行偏差調查。7．實驗技術7.1耐膽鹽革蘭陰性菌(Bile~TolerantGram-NegativeBacteria)7.1.1供試液制備和預培養取供試品，用胰酪大豆胨液體培養基作為稀釋劑照“非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法(通則1105)”制成1:10供試液，混勻，在20?25C培養，培養時間應使供試品中的細菌充足恢復但不增殖(約2小時)。7.1.2定性實驗除另有規定外，取相稱于lg或lml供試品的上述預培養物接種至適宜體積(經方法合用性實驗擬定）腸道菌增菌液體培養基中，30?35°C培養24?48小時后，劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基平板上，30?35°C培養18?24小時。假如平板上無菌落生長，判供試品未檢出耐膽鹽革蘭陰性菌。7.1.3定最實驗選擇和分離培養取相稱于o.lg、O.Olg和O.OOlg(或0.1ml、0.01ml和0.OOltnl)供試品的預培養物或其稀釋液分別接種至適宜體積(經方法合用性實驗擬定）腸道菌增菌液體培養基中，30?35℃培養24?48小時。上述每一培養物分別劃線接種于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基平板上，30?35℃培養18?24小時。結果判斷若紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基平板上有菌落生長，則相應培養管為陽性，否則為陰性。根據各培養管檢查結果，從表2查lg或lml供試品中具有耐膽鹽革蘭陰性菌的也許菌數。標題微生物限度檢查操作規程編碼：KF-SOP-07-13-2共19頁第17頁表2耐膽鹽革蘭陰性菌的也許菌數(N)各供試品量的檢査結果每lg(或lml)供試品中也許的菌數cfu0.lg或0.lml0.01g或0.01ml0.001g或0.001ml+++—++—-+---N>103102<N<10310<N<102N<10注：（1)+代表紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上有菌落生長；一代表紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上無菌落生長。(2)若供試品量減少10倍（如O.Olg或0_01ml，0.OOlg或0.001ml，0，0001g或0.0001ml)，則每lg(或lml)供試品中也許的菌數(N)應相應增長10倍.7.2大腸埃希菌(Escherichiacoli)7.2.1供試液制備和增菌培養：取供試品:照“非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法（通則1105)”制成1:10供試液。取相稱于lg或lml供試品的供試液，接種至適宜體積(經方法合用性實驗擬定）的胰酪大豆胨液體培養基中，混勻，30?35°C培養18?24小時。7.2.2選擇和分離培養：取上述培養物lml接種至100ml麥康凱液體培養基中，42?44℃培養24?48小時。取麥康凱液體培養物劃線接種于麥康凱瓊脂培養基平板上，30?35°C培養18?72小時。7.2.3結果判斷若麥康凱瓊脂培養基平板上有菌落生長，應進行分離、純化及適宜的鑒定實驗，確證是否為大腸埃希菌；若麥康凱瓊脂培養基平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結果為陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。7.3沙門菌(Salmonella)7.3.1供試液制備和增菌培養：取10g或10ml供試品直接或:解決后接種至適宜體積（經方法合用性實驗擬定）的胰酪大豆胨液體培養基中，混勻，30?35C培養18?24小時。選擇和分離培養取上述培養物0.1ml接種至10mlRV沙門增菌液體培養基中，30?35°C培養18?24小時。7.3.2取少量RV沙門菌增菌液體培養物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基平板上，30?35℃：培養18?48小時。沙門菌在木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基平板上生長良好，菌落為淡紅色或無色、透明或半透明、中心有或無黑色。用接種針挑選疑似菌落于三糖鐵瓊脂培養基高層斜面上進行斜面和高層穿刺接種，培養18?24小時，或采用其他適宜方法進一步鑒定。7.3.3結果判斷：若木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基平板上有疑似菌落生長，且三糖鐵瓊脂培養基的斜面為紅色、底層為黃色，或斜面黃色、底層黃色或黑色，應進一步進行適宜的鑒定實驗，確證是否為沙門菌。假如平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結果為陰性，或三糖鐵瓊脂培養基的斜面未見紅色、底層未見黃色（或斜面黃色、底層未見黃色或黑色，判供試品未檢出沙門菌。標題微生物限度檢查操作規程編碼：KF-SOP-07-13-2共19頁第18頁7.4銅綠假單胞藺{Pseudomonasaeruginosa)7.4.1供試液制備和壜菌培養：取供試品，照“非無菌產品微:生物限度檢查：微生物計數法（通則1105)”制成1:10供試液。取相稱于lg或lml供試品的供試液，接種至適宜體積（經方法合用性實驗擬定的）的胰酪大豆胨液體培養基中，混勻。30?35T：培養18?24小時。7.4.2選擇和分離培養取上述培養物劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基平板上，30?35℃培養18?72小時。取上述平板上生長的菌落進行氧化酶實驗，或采用其他適宜方法進一步鑒定，氯化酶實驗將潔凈濾紙片置于平皿內，用無菌玻棒取上述平板上生長的菌落涂于濾紙片上，滴加新配制的1%二鹽酸N，iV-二甲基對苯二胺試液，在30秒內若培養物呈粉紅色并逐漸變為紫紅色為氧化酶實驗陽性，否則為陰性。7.4.3結果判斷：若溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基平板上有:菌落生長，且氧化酶實驗陽性，應進一步進行適宜的鑒定實驗，確證是否為銅綠假單胞菌。假如平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結果為陰性，或氧化酶實驗陰性，判供試品未檢出銅綠假單胞菌。7.5金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus)7.5.1供試液制備和增藺培養：取供試品，照“非無菌產品微:生物限度檢査：微生物計數法（通則1105)”制成1:10供試液。取相稱于lg或lml供試品的供試液，接種至適宜體積(經方法合用性實驗擬定）的胰酪大豆胨液體培養基中，混勻。30?35°C培養18?24小時。7.5.2選擇和分離培養取上述培養物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養基平板上，30?35*C培養18?72小時。7.5.3結果判斷若甘露醇氯化鈉瓊脂培養基平板上有黃色菌落或外周有黃色環的白色菌落生長，應進行分離、純化及適宜的鑒定實驗，確證是否為金黃色葡萄球菌；若平板上沒有與上述形態特性相符或疑似的菌落生長，或雖有相符或疑似的菌落生長但鑒定結果為陰性，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。7.6梭菌（Clostridium）7.6.1供試液制備和熱解決：取供試品，照“非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法（通則1105)”制成1:10供試液。取相稱于lg或lml供試品的供試液2份，其中1份置80℃保溫10分鐘后迅速冷卻。7.6.2增菌、選擇和分離培養：將上述2份供試液分別接種至適宜體積(經方法合用性實驗擬定）的梭菌增菌培養基中，置厭氧條件下30?35°C培養48小時。取上述每一培養物少量，分別涂抹接種于哥倫比亞瓊脂培養基平板上，置厭氧條件下30?35°C培養48?72小時。7.6.3過氯化氫酶實驗：取上述平板上生長的菌落，置潔凈玻片上，滴加3%過氧化氫試液，若菌落表面有氣泡產生，為過氧化氫酶實驗陽性，否則為陰性。7.6.4結果判斷：若哥倫比亞瓊脂培養基平板上有厭氧桿菌生長（有或無芽孢），且過氧化氫酶反映陰性的，應進一步進行適宜的鑒定實驗，確證是否為梭菌；假如哥倫比亞瓊脂培養基平板上沒有厭氧桿菌生長，或雖有相符或疑似的菌落生長但鑒定結果為陰性，或過氧化氫酶反映陽性，判供試品未檢出梭菌。標題微生物限度檢查操作規程編碼：KF-SOP-07-13-2共19頁第19頁7.7白色念珠菌（Candidaalbicans)7.7.1供試液制備和堆菌培養：取供試品，照“非無菌產品微:生物限度檢查：微生物計數法（通則1105)”制成1:10供試液。取相稱于lg或lml供試品的供試液，接種至適宜體積(經方法合用性實驗擬定）的沙氏葡萄糖液體培養基中，混勻，30?35℃培養3?5天。7.7.2選擇和分離：取上述預培養物劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板上，30?35°C培養24?48小時。白色念珠菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養基上生長的菌落呈乳白色，偶見淡黃色，表面光滑有濃酵母氣味，培養時間稍久則菌落增大，顏色變深、質地變硬或有皺褶。挑取疑似菌落接種至念珠菌顯色培養基平板上，培養24?48小時(必要時延長至72小時），或采用其他適宜方法進一步鑒定。7.7.3結果判斷：若沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板上有疑似菌落生長，且疑似菌在念珠菌顯色培養基平板上生長的菌落呈陽性反映，應進一步進行適宜的鑒定實驗，確證是否為白色念珠菌；若沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結果為陰性，或疑似菌在念珠菌顯色培養基平板上生長的菌落呈陰性反映，判供試品未檢出白色念珠菌。7.8稀釋液：稀釋液配制后，應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。（1）PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液照無菌檢査法（通則1101)制備。（2）pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液、PH7.2無菌磷酸鹽緩沖液、pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液照緩沖液（通則8004)配制后，過濾，分裝，滅菌。如需要，可在上述稀釋液滅菌前或滅菌后加人表面活性劑或中和劑等。（3）0.9%無菌氯化鈉溶液取氯化鈉9.0g,加水溶解使成1000ml，過濾，分裝，滅菌。培養基及其制備方法7.9培養基及其制備方法培養基可按以下處方制備（見中國藥典2023年版，通則1107非無菌藥品微生物限度標準）（第148頁-149頁），也可使用按該處方生產的符合規定的脫水培養基。配制后，應按驗證過的高壓滅菌程序滅菌。8.附件附件1《微生物限度檢查記錄》（KF-SOP-07-13（J）-01）附件2《控制菌檢查記錄》（KF-SOP-07-13(J)-02）附件3《計數培養基合用性檢查記錄》（KF-SOP-07-13(J)-03）附件4《控制菌檢查培養基合用性檢查記錄》（KF-SOP-07-13(J)-04）附件5《陽性菌使用記錄》（KF-SOP-07-13(J)-05）

附件1微生物限度檢查記錄檢查編號：KF-SOP-07-13（J）-01檢品名稱檢品來源檢品批號檢查日期年月日包裝規格報告日期年月日批量kg（件）檢查依據中國藥典2023年版四部供試品制備：常規法供試品g（ml）加無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液（PH7.0）（配制批號）至ml需氧菌總數30~35℃(5)霉菌和酵母菌總數23~28℃(7)培養基配制批號：培養時間月日時～月日時培養基配制批號：培養時間月日時～月日時原液1：101：100陰性對照原液1：101：100陰性對照12121212121224h24h48h48h72h72h96h96h120h120h144h168h平均平均結果cfu/g、ml結果cfu/g、ml大腸埃希菌檢查菌種編號：實驗方法培養基配制批號培養時間h培養溫度℃結果備注供試品陽性對照陰性對照BLMUG靛基質結論本品依據中國藥典2023年版四部《通則1105》和《通則1106》進行檢查，結果。檢查人復核人附件2控制菌檢查記錄檢查編號：KF-SOP-07-13（J）-02檢品名稱檢品來源檢品批號檢查日期年月日包裝規格報告日期年月日批量kg（件）檢查依據中國藥典2023年版四部大腸埃希菌檢查供試品制備：取供試品（g/ml/cm2），加PH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至ml，混勻，作為的供試液。培養基信息：①BL配制批號：②MUG配制批號：③EMB配制批號：培養溫度：培養時間：培養箱編號：BLMUG靛基質EMB革蘭染色、鏡檢IMRV—PC乳糖發酵供試品陰性對照陽性對照結果□檢出□未檢出（規定：）大腸菌群檢查供試品制備：取供試品（g/ml），加PH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至ml，混勻，作為的供試液。培養基信息：①乳糖膽鹽發酵培養基配制批號：②EMB配制批號：③乳糖發酵培養基配制批號：培養溫度：培養時間：培養箱編號：乳糖膽鹽發酵培養基EMB乳糖發酵培養基供試品10-110-210-3陰性對照結果（規定：）沙門菌檢查供試品預增菌：取供試品（g/ml），直接接種于200ml營養肉湯培養基中，混勻，即得。培養基信息：①營養肉湯培養基配制批號：②四硫磺酸鈉亮綠培養基配制批號：③膽鹽硫乳瓊脂培養基配制批號：④EMB配制批號：培養溫度：培養時間：培養箱編號：