抗生素效價測定技術：抗生素效價檢定概述：抗生素效價微生物檢定法知識點1：抗生素效價的概念及檢定用標準品一、抗生素效價定義抗菌活性是指抗菌藥物抑制或殺死病原微生物的能力。抗生素的抗菌活性通常用效價單位來表示，即抗菌效價指抗生素藥物的作用強度。在臨床應用中，抗生素的效價可準確地反映抗生素的醫療價值，以“單位（U/IU）”表示。硫酸鏈霉素798單位/毫克青霉素G鈉1670單位/毫克桿菌肽

74單位/毫克知識點1：抗生素效價的概念及檢定用標準品二、抗生素效價單位抗生素效價的標示量，原則上應按所含特定的抗菌活性部分的重量來計算。在應用中，抗生素類藥物有效成分的表示方法，是按照各種抗生素的特點及使用經驗，采用符合客觀實際的效價單位表示。常用的抗生素效價單位有質量單位、類似質量單位、質量折算單位、特定單位。知識點1：抗生素效價的概念及檢定用標準品抗生素效價單位的表示方法一、質量單位質量單位以抗生素中所含特定的抗菌活性部分（純游離堿或游離酸）的質量1μg作為1單位，即1mg=1000單位。堿性抗生素以純堿的量作為有效部分的量；酸性抗生素以純酸的量作為有效部分的量。知識點1：抗生素效價的概念及檢定用標準品二、類似質量單位

類似質量單位以特定的純抗生素制品鹽的質量1μg作為一個單位，即1mg＝1000單位，其中包括了無抗菌活性的酸根在內。這種類似質量單位，雖然并不合理，但在國際上已經習慣沿用。知識點1：抗生素效價的概念及檢定用標準品三、質量折算單位質量折算單位是以特定的純抗生素制品的某一質量為1單位而加以折算。

如：青霉素國際標準品

第一批青霉素國際標準品，青霉素G鈉0.6微克為1單位，即1667單位/毫克。

第二批青霉素國際標準品，青霉素G鈉0.5988微克為1單位，即1670單位/毫克。知識點1：抗生素效價的概念及檢定用標準品四、特定單位特定單位是指對于不易得到純品，組成成分較復雜的抗生素，在開始生產及臨床使用時，只能以一特定量的標準品（或對照品）作為1單位。

如：桿菌肽國際標準品

第一批桿菌肽A國際標準品為55單位/毫克；

第二批桿菌肽A國際標準品為74單位/毫克。知識點1：抗生素效價的概念及檢定用標準品五、抗生素微生物檢定用標準品標準品是指用于生物檢定、抗生素或生化藥品中含量或效價測定的標準物質，按效價單位（或μg）計，以國際標準品進行標定。標準品分為國際標準品和國家標準品。知識點1：抗生素效價的概念及檢定用標準品六、供試品供試品是供檢定其效價的樣品，它的活性組分應與標準品基本相同。需用各品種項下規定的溶劑溶解，再按估計效價或標示量稀釋至與標準品相當的濃度。

知識點3：濁度法

濁度法的測定原理

是分別加入抗生素標準品和供試品到已接種有試驗菌的培養液中，因不同濃度的抗生素對試驗菌的抑制作用不同，在一定時間內，通過測量培養基內試驗菌濃度（濁度）變化就可確定供試品的效價。知識點3：濁度法通過監測等量的試驗菌菌液在不同濃度的抗生素液體培養基中的生長情況，利用分光光度法測定含不同濃度的抗生素的液體培養基的濁度，從而衡量抗生素抑菌效力的方法。可用于抗生素藥物的含量（效價）測定。濁度法知識點3：濁度法

特點：

濁度法因在液體中進行，所以不受擴散因素的影響，不會像管碟法那樣易受如鋼圈的放置、向鋼圈內滴液的速度、液面的高低、菌層厚薄等種種因素影響抗生素在瓊脂表面擴散，而造成結果的差異或試驗的失敗。同時本法誤差較小，管碟法的可信限率為5%，最大可達7%，而本法在1%—3%；而且可進行自動化測定，易實行規范化操作。知識點3：濁度法一、菌懸液的制備：如金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌懸液二、檢查用溶液的制備（一）標準品溶液的制備（二）供試品溶液的制備三、含試驗菌液體培養基的制備知識點3：濁度法四、檢定操作方法（一）線性試驗

除另有規定外，取適宜的大小厚度均勻的已滅菌試管，在各試驗管內精密加入含試驗菌的液體培養基9.0ml，再分別精密加入各濃度的標準品溶液1.0ml，立即混勻，按隨機區組分配將各管在規定條件下培養至適宜測量的濁度值（通常約為4小時）。知識點3：濁度法（三）空白試驗

另取2支試管，各加入藥品稀釋劑1.0ml，再分別加入含試驗菌的液體培養基9.0ml。其中一支試管立即加入甲醛溶液0.5ml，混勻，作為空白對照。另一支試管同法培養，作為細菌生長對照。知識點3：濁度法（四）吸光度的測量

在線測定各管的吸光度。或取出，立即加入%甲醛溶液(1_：3)0.5ml以終止微生物生長，在530或580nm波長處測定各管的吸光度。（五）記錄與計算1．試驗記錄要求應包括抗生素的品種、劑型、標示量、生產廠、批號、檢查目的、檢驗依據、檢驗日期、溫度、濕度、標準品與供試品的稱量、稀釋步驟與核對人、抑菌圈測量結果。知識點3：濁度法2．標準曲線的計算標準品的各濃度對數值及相對應的吸光度列成表。3．回歸系數的顯著性測驗判斷回歸得到的方程是否成立，即x、y是否有直線關系，可采用t檢驗。4．測定結果的計算及可信限率估計。5．實驗計算所得效價低于估計效價的90%或高于估計效價的110%，則檢驗結果僅作為初試，應調整供試品估計效價，予以重試。

知識點3：濁度法6．原料藥效價測定一般需雙份樣品，平行實驗以便核對。對不符合規定的樣品應至少有2次符合規定的結果，才能發出報告。7．效價結果的有效數字按《中國藥典》的規定取舍小數位。知識點3：濁度法五、二劑量法或三劑量法除另有規定外，取大小一致的已滅菌的試管，在各品種項下規定的劑量反應線性范圍內選擇適宜的高、（中）、低濃度，分別精密加入各濃度的標準品和供試品溶液各1.0ml，二劑量的劑距為2：1或4：1，三劑量的劑距為1:0.8。比濁法劑量間的比例通常為1：1.25或更小。同標準曲線法操作，每一濃度組不少于4個試管，按隨機區組分配將各試管在規定條件下培養。照生物檢定統計法的規定進行可靠性測驗及效價計算。知識點3：濁度法六、供試品供試品是供檢定其效價的樣品，它的活性組分應與標準品基本相同。需用各品種項下規定的溶劑溶解，再按估計效價或標示量稀釋至與標準品相當的濃度。知識點：管碟法一、檢定原理管碟法，又稱杯碟法，是通過將不銹鋼小管（俗稱為牛津杯）放置在含敏感試驗菌的瓊脂培養基上，將抗生素溶液注入小鋼管中，抗生素分子隨溶劑向培養基內呈球面狀放射狀擴散。同時將培養基置入適宜試驗菌生長的培養箱內，使試驗菌開始生長。抗生素分子在瓊脂培養基中的濃度隨與小鋼管間距離的增大而降低，離小鋼管越遠，培養基中的抗生素分子越少，相應的抗生素濃度越低。當抗生素分子擴散達到一定時間，可在小鋼管周圍形成一個抑菌圈。知識點：管碟法知識點：管碟法知識點：管碟法從圖11-1和式(11-2)可以看出，抑菌圈的半徑大小與最小抑菌濃度c、瓊脂層厚度H、抗生素在瓊脂內擴散系數D、抗生素在小鋼管中的量M以及抗生素的擴散時間T有關。這些因素的改變會影響抑菌圈的大小和清晰度。故在抗生素效價測定時，為消除各種因素的干擾，采用標準品和供試品在相同試驗條件下進行，測得相對效價的比率，再由已知標準品效價計算供試品效價。管碟法的優點是樣品用量少、靈敏度高，但同時專屬性較差、操作煩瑣、影響因素多。知識點：管碟法知識鏈接

量反應平行線原理抗生素微生物檢定法是基于量反應平行線原理，即“在量反應指標中，當抗生素濃度的對數劑量與反應呈直線關系，且供試品與標準品的作用性質相同時，供試品與標準品的兩條量反應關系曲線相互平行”。

管碟法試驗中，在一定劑量范圍內，抗生素的對數劑量與其抑菌圈大小呈直線關系，抗生素標準品和供試品在產生的兩條量反應直線平行，符合量反應平行線原理。知識點：管碟法圖11-2抗生素量-反應直線知識點：管碟法二、檢定方法（一）操作流程1.試驗用菌液、緩沖液、培養基的配制2.標準品與供試品溶液的3.雙碟的4.滴加藥液到小鋼管5.培養6.抑菌圈測量7.計算結果知識點：管碟法知識點：管碟法管碟法根據試驗設計不同，可分為：1.一劑量法(標準曲線法)常用于原料生產的過程監控、中間體或半成品檢驗

2.二劑量法(2.2法)是抗生素質量檢驗的常規方法3.三劑量法(3.3法)

主要用于標準品的標定

日常使用多采用二劑量法，對于有爭議結果，必須使用三劑量法測定的結果仲裁。知識點：管碟法（二）操作注意事項1.試驗環境實驗室應防止抗生素及微生物的污染。2.儀器用具

玻璃容器應清洗、滅菌；校正后方可使用。雙碟的規格應符合藥典規定。3.試驗菌應具備如下特點：對抗生素成分敏感，對雜質、降壓物質及毒性物質無作用或作用很低；靈敏、穩定、抑菌圈邊緣清晰、測定誤差小；易于培養、保存，無致病性；與同品種國際通用藥典所用試驗菌一致，以便效價單位的統一。知識點：管碟法4.操作次序上的誤差要求滴加迅速。在操作很多檢品時，以分批操作為好。5.抑菌圈的測量

測量抑菌圈是管碟法的重要環節，應盡量避免主觀誤差的產生。技能點1：二劑量法操作規程四、二劑量法（一）效價計算公式

二劑量法是將抗生素的標準品、供試品各稀釋成高、低兩種劑量（4:1或2:1），在同一含試驗菌的瓊脂培養基平板上進行對比，根據兩種劑量四種溶液所產生的抑菌圈大小，計算出供試品的效價。技能點1：二劑量法操作規程（一）效價計算公式

二劑量法供試品的效價計算：式中，T2為供試品高劑量；T1為供試品低劑量；S2為標準品高劑量；Sl為標準品低劑量；R為供試品和標準品等反應劑量的比值；I為高、低劑量間濃度比的對數（常數）；Pr為供試品的測得效價；AT為供試品的標示量。技能點1：二劑量法操作規程（二）操作方法1.檢驗用溶液的制備（1）標準品溶液的制備：標準品的使用與保存，應遵循標準品使用說明書的規定。（2）供試品溶液的制備：精密稱取供試品，用各藥品項下規定的溶劑溶解后，制成濃度一般為lOOOU/ml的濃溶液，再根據要求用緩沖液稀釋至與標準品相當的滴碟所用最終高、低兩個濃度，作為供試品溶液。

技能點1：二劑量法操作規程

技能點1：二劑量法操作規程2.菌懸液的制備(1)枯草芽孢桿菌懸液：取枯草芽孢桿菌的營養瓊脂斜面培養物，接種于盛有營養瓊脂培養基的培養瓶中，在35~37℃培養7日，用革蘭染色法涂片鏡檢，應有芽孢85%以上。用滅菌水將芽孢洗下，在65℃加熱30分鐘，備用。

(2)短小芽孢桿菌懸液：取短小芽孢桿菌的營養瓊脂斜面培養物，照上述方法制備。

(3)金黃色葡萄球菌懸液：取金黃色葡萄球菌的營養瓊脂斜面培養物，接種于營養瓊脂斜面上，在35~37℃培養20~22小時。臨用時，用滅菌水或0.9%滅菌氯化鈉溶液將菌苔洗下，備用。

技能點1：二劑量法操作規程2.菌懸液的制備

(4)藤黃微球菌懸液：取藤黃微球菌的營養瓊脂斜面培養物，接種于盛有營養瓊脂培養基的培養瓶中，在26—27℃培養24小時，或采用適當方法制備的菌斜面。用培養基Ⅲ或0.9%滅菌氯化鈉溶液將菌苔洗下，備用。

(5)大腸埃希菌[EscherichiacoliCMCC(B)44103]懸液：取大腸埃希菌的營養瓊脂斜面培養物，接種于營養瓊脂斜面上，在35~37℃培養20~22小時。臨用時，用滅菌水將菌苔洗下，備用。

技能點1：二劑量法操作規程3.雙碟的制備

在半無菌室內或超凈工作臺上進行，應注意微生物及抗生素的污染，放雙碟的臺面應用水平儀調水平。玻璃/塑料平皿(d=90mmh=16-17mm)

菌層5ml含菌培養基底層20ml滅菌培養基技能點1：二劑量法操作規程制備底層制備菌層技能點1：二劑量法操作規程4.放置鋼管5.滴碟、培養毛細滴管（或滴管）滴碟滴加順序：按標準品高劑量溶液→供試品高劑量溶液→標準品低劑量溶液→供試品低劑量溶液

（即SH→TH→SL→TL）

6.測量抑菌圈

雙碟透明度好，無破損和不透明現象；抑菌圈應圓滿，無破圈或圈不完整現象，否則應棄去該雙碟。技能點1：二劑量法操作規程技能點1：二劑量法操作規程技能點1：二劑量法操作規程

在恒溫培養箱中培養至規定時間

技能點1：二劑量法操作規程測量抑制圈

技能點1：二劑量法操作規程測量儀器技能點1：二劑量法操作規程方法一方法二技能點1：二劑量法操作規程技能點1：二劑量法操作規程（三）記錄與計算1.記錄

試驗記錄應包括抗生素的品種、劑型、規格、標示量、生產廠商、批號、檢驗目的、檢驗依據、檢驗日期、溫度、濕度、標準品與供試品的稱量、稀釋步驟與核對人、抑菌圈測量結果。技能點1：二劑量法操作規程2.計算式中,PT為供試品效價相當于標示值或估計效價的百分數;S2為標準品高濃度所致抑菌圈直徑(面積)總和;S1為標準品低濃度所致抑菌圈直徑(面積)總和;T2為供試品高濃度所致抑菌圈直徑(面積)總和;T1為供試品低濃度所致抑菌圈直徑(面積)總和;I為高、低