微流控芯片核酸恒溫擴增儀技術要求2022-04-15發布2022-04-15實施國家市場監督管理總局I前言 1范圍 12規范性引用文件 l3術語和定義 14分類和命名 25要求 6試驗方法 57標志、標簽和說明書 98包裝、運輸和儲存 參考文獻 Ⅲ本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由全國生物芯片標準化技術委員會(SAC/TC421)提出并歸口。本文件起草單位：博奧生物集團有限公司、北京博奧晶典生物技術有限公司、清華大學、四川大學華西醫院、首都醫科大學附屬佑安醫院、北京大學人民醫院。1微流控芯片核酸恒溫擴增儀技術要求本文件適用于離心管式載體和微流控芯片載體的核酸恒溫擴增儀或核酸恒溫擴增分析儀的生產、本文件不適用于周期性變溫的聚合酶鏈反應(Polymerasechainreaction,PCR)類擴增儀。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T191包裝儲運圖示標志GB4793.1測量、控制和實驗室用電氣設備的安全要求第1部分：通用要求GB4793.6測量、控制和實驗室用電氣設備的安全要求第6部分：實驗室用材料加熱設備的特殊要求GB4793.9測量、控制和實驗室用電氣設備的安全要求第9部分：實驗室用分析和其他目的自動和半自動設備的特殊要求GB/T14710醫用電器環境要求及試驗方法GB/T18268.1測量、控制和實驗室用的電設備電磁兼容性要求第1部分：通用要求GB/T18268.26測量、控制和實驗室用的電設備電磁兼容性要求第26部分：特殊要求體外診斷(IVD)醫療設備YY/T0466.1醫療器械用于醫療器械標簽、標記和提供信息的符號第1部分：通用要求YY0648測量、控制和實驗室用電氣設備的安全要求第2-101部分：體外診斷(IVD)醫用設備的專用要求YY/T1173聚合酶鏈反應分析儀3術語和定義YY/T1173界定的以及下列術語和定義適用于本文件。核酸恒溫擴增nucleicacidisothermalamplification由常溫升溫至一固定的擴增高溫后，在該固定溫度下進行核酸(包括DNA和RNA)體外快速復制放大的過程。注：因使用的聚合酶和引物的不同，擴增高溫的溫度值存在一定的差異，需要根據實際試驗條件進行優化。核酸恒溫擴增儀nucleicacidisothermalamplificationanalyzer具有恒定溫度控制的功能，借助一固定的擴增高溫進行核酸序列的特異性擴增，通過光學系統接收2待測樣品中核酸序列特異性擴增產物產生的發射光(熒光或非熒光標記的濁度引起的光強變化),通過光電轉換生成模擬信號或數字信號及數據文件，進行核酸恒溫擴增過程的動態監測與實時光強變化信號分析的儀器。以硅、玻璃、金屬材料、高分子聚合物等材料為芯片基材，利用微納加工、精密注塑等加工技術加工而成的生物芯片。生化反應功能生化試驗常用圓柱形或圓錐形樣品載體，材料為高分子材料和玻璃材料等。核酸擴增檢測靈敏度nucleicacidamplificationdetectionsensitivity擴增儀對樣品載體上待測核酸樣本最低核酸分子拷貝數的發射熒光強度的識別能力。注：通常表示為在設定的檢測時間內，檢測核酸樣本能夠產生正常平臺期擴增信號的最低核酸分子拷貝數，用copies/指標(或copies/μL)表示。光強度檢測線性度linearityoflightintensitydetection擴增儀在達到許可的動態范圍條件下，對標準熒光(或濁度)物質的系列濃度梯度樣本進行發射熒光強度(或濁度引起的光強變化)檢測，并與樣本濃度進行線性擬合分析，所獲得熒光信號強度(或濁度引起的光強變化)與樣本濃度的線性回歸系數r?。指數級擴增拐點時間timeofexponentamplificationcrossingpoint在實時監測核酸樣本擴增過程中，擴增產物產生的熒光信號(或濁度引起的光強變化)到達可檢測閾值經歷的時間。注：通常計算從核酸擴增恒溫階段的起始點到擴增曲線二階導數的極大值位置點(指數級擴增拐點)的時間。對多份相同種類、體積、目標核酸濃度及基質的標準核酸樣本進行核酸擴增檢測，所獲得核酸指數級擴增拐點時間T。值的一致性。樣本檢測線性度linearityofsampledetection在達到許可的動態范圍條件下，擴增儀檢測系列濃度梯度的標準樣品的發射熒光強度(或濁度引起的光強變化),并與樣本濃度的對數值(或樣本濃度)等進行線性擬合分析，所獲得各濃度核酸指數級擴增拐點時間T。值與樣本濃度對數值的線性回歸系數r?。4分類和命名4.1分類擴增儀電氣分類為Ⅱ類，污染等級為2級。3擴增儀可根據控溫方式、載體、載體運動狀態、熒光通道和體積等不同的方面分類，具體如下：——根據控溫方式可分為空氣浴加熱擴增儀、水浴加熱擴增儀、金屬或陶瓷接觸加熱擴增儀。——根據樣品載體可分為離心管式擴增儀、孔板式擴增儀和微流控芯片擴增儀。——根據樣品載體運動狀態可分為靜態擴增儀和旋轉掃描式擴增儀。——根據采用熒光通道的多少可分為單通道熒光擴增儀和多通道熒光擴增儀。——根據體積可分為臺式擴增儀、便攜式擴增儀和工作站型擴增儀。擴增儀組成包括擴增儀主機、連接線、說明書和軟件安裝光盤。擴增儀主機主要由控制系統、電源系統、溫控系統、檢測系統和外殼部件組成。擴增儀可根據分類不同命名為核酸恒溫擴增實時熒光檢測系統、核酸恒溫擴增分析儀、恒溫擴增分析儀等，其中“恒溫”也可用“等溫”替代。命名還可增加載體內容，如微流控芯片核酸恒溫擴增分析儀、管式核酸恒溫擴增分析儀、孔板式核酸恒溫擴增分析儀。5要求5.1溫度控制5.1.1平均升溫速率儀器從37℃升溫至65℃過程中，平均升溫速率不應小于10.0℃/min。儀器從65℃降溫至37℃過程中，平均降溫速率不應小于5.0℃/min。恒溫計時開始10s內到計時結束之間溫度測量數據的最高值與最低值之差的一半，不應大于0.5℃。恒溫計時開始10s內到計時結束之間溫度測量數據的平均值與模塊設置溫度差值的絕對值，不應大于0.5℃。5.1.5溫度持續時間準確度設定恒溫的時間與溫度測量數據采集到恒定溫度的持續時間的偏差，應在±5%范圍內。溫度有效使用區不同位置之間溫度測量數據大值減小值的差值不應大于1.0℃。5.2標準物質檢測5.2.1光強度檢測重復性對激發光激發標準熒光(或濁度)物質的同一份樣本進行連續重復檢測，熒光(或濁度引起的光強變化)信號測量值的變異系數(CoefficientofVariation,CV)不應大于5%。45.2.2光強度檢測精密度對同一種激發光激發標準熒光(或濁度)物質相同質量或體積的多份樣本進行連續重復檢測，熒光(或濁度引起的光強變化)信號測量值的變異系數CV不應大于15%。5.2.3光強度檢測線性度對系列標準熒光(或濁度)物質的濃度梯度樣本進行檢測，計算各濃度熒光信號(或濁度引起的光強變化)測定值與稀釋濃度比例的線性回歸系數r?,不應低于0.990。注：如標準熒光染料FAM溶液，稀釋成5個梯度，如10μmol/L、5μmol/L、2.5μmol/L、1.25gmol/L和5.3樣本檢測5.3.1樣本檢測重復性對標準核酸樣本高中低濃度樣本進行等溫擴增檢測，相同濃度檢測的指數級擴增拐點時間的變異系數CV,不應大于10%。注：如金黃色釀膿葡萄球菌(Staphylococcusaureus,Sau)或結核分枝桿菌(Mycobacterium酸樣本的10?copies/μL、10*copies/μL、10°copies/μL。Tuberculosis,Mtb)的核5.3.2樣本檢測線性度對標準核酸樣本稀釋的系列梯度濃度樣本進行擴增檢測，各濃度的指數級擴增拐點時間與濃度對數值的線性回歸系數r?,不應低于0.980。5.4核酸擴增檢測靈敏度應在60min內，對標準核酸樣本進行正常核酸擴增，并獲得完整指數級擴增熒光信號(或濁度引起的光強變化)檢測曲線的最低核酸模板濃度，且不應大于102copies/指標。5.5不同通道熒光干擾對于多色熒光標記測量，其他通道熒光檢測強度，不應高于目標通道熒光閾值。外觀應滿足以下要求：a)面板上的圖形符號和文字準確b)緊固件連接牢固可靠，無松動；c)運動部件平穩，無卡住、突跳及顯著空轉，摩擦阻力均勻，鍵組回調靈活。電氣安全應符合GB4793.1和YY0648的規定。加熱裝置的電氣安全應符合GB4793.6的規定。設備安裝、操作和維護中的電氣安全還應符合GB4793.9的規定。55.8電磁兼容性應符合GB/T18268.1和GB/T18268.26的要求。5.9環境試驗應符合GB/T14710中機械I組和環境I組的要求。5.10多加熱模塊多加熱通道設備每個加熱模塊和加熱通道均應滿足5.1～5.9的要求。6試驗方法6.1正常工作條件6.1.2環境溫度：15℃~30℃。6.1.3相對濕度：20%～85%。6.1.5擴增儀開機后預熱時間不少于10min。6.1.6擴增儀使用前應按照儀器生產廠家的說明書操作或校準。6.1.7擴增儀測量時采用標準熒光物質材料和標準核酸樣本或標準核酸試劑盒。6.1.8擴增儀測溫工具的精度不低于0.01℃,并且在校驗的有效期內。6.1.9溫度控制測試標定方法采用水浴或其他方法作為恒溫單元，用設備內部溫度控制器和標準溫度測量指示表同時測量溫度，各連續記錄5次取平均值，比較二者的溫度測量數據，評價溫度測量的準確度。6.1.10正常工作溫度控制流程通過軟件設置：—第1步，從常溫(15℃~30℃)升溫至37℃,時間3min——第2步，從37℃升溫至65℃,保持65℃恒溫，時間45min,其中從37℃到65℃的升溫時間不大于3min;——第3步，從65℃降溫到37℃以下，降溫時間不大于5min。使用專用軟件或測溫工具獲得動態測量腔體加熱或冷卻的溫度變化實時測量讀數值，用計算機時鐘(或秒表)計時。注1:6.1.1～6.1.10中的要求與生產企業標稱的產品規格不一致時，以產品規格為準。注2:標準核酸樣本如Sau或Mtb。6.2溫度控制6.2.1平均升溫速率從溫度控制流程中，獲取從37℃到65℃升溫過程的溫度實時測量數據，恒溫37.0℃±0.5℃最后一個溫度點，溫度記為TA,恒溫65.0℃±0.5℃的第二個溫度點，溫度記為Tg,從TA到達TB的時間記為t?,按照公式(1)計算平均升溫速率Vrp。連續記錄3次取平均值，檢查結果是否符合5.1.1的規定。Vrup=(Tg-TA)/t?6式中：Vrup——從37℃到65℃的平均升溫速率；TA——溫度控制流程中，恒溫37.0℃±0.5℃最后一個溫度點；Tg——溫度控制流程中，恒溫65.0℃±0.5℃的第二個溫度點；t?—-從TA到達T;的時間。6.2.2平均降溫速率從溫度控制流程中，獲取從65℃到37℃降溫過程的溫度實時測量數據，恒溫65.0℃±0.5℃最后一個溫度點，溫度記為Tc,恒溫37.0℃±0.5℃的第一個溫度點，溫度記為Tp,從Tc到達Tp的時間記為t?,按照公式(2)計算平均降溫速率Vraown。連續記錄3次取平均值，檢查結果是否符合5.1.2的規定。式中：Vrawn——從65℃到37℃的平均降溫速率；Tc——溫度控制流程中，恒溫65.0℃±0.5℃最后一個溫度點；T,——溫度控制流程中，恒溫37.0℃±0.5℃的第一個溫度點；6.2.3控溫精度按6.1.10第2步操作，從37℃升溫到65℃,當溫度達到恒溫65.0℃±0.5℃第10s開始記錄溫度實時測量數據，連續記錄30次，每次記錄的時間間隔不大于0.1s,從該數據找出溫度的最高值Tmx和最低值Tmin,按照公式(3)計算控溫精度偏差△T?,連續實驗5次取最大值，檢查結果是否符合5.1.3的規定。式中：△T?——恒溫65.0℃±0.5℃控溫精度偏差；Tmx——恒溫65.0℃±0.5℃溫度最高值；Tmin——恒溫65.0℃士0.5℃溫度最低值。6.2.4溫度準確度在20℃~80℃范圍內改變設置溫度，設置2個溫度測量點37℃和65℃,在每個溫度測量點恒溫計時第10s開始記錄擴增儀溫度控制器的實際測量溫度T,每次記錄的時間間隔不大于0.1s,每個溫度點連續測量記錄30次取平均值T平均，與模塊設置溫度T設比較，按照公式(4)計算溫度偏差的絕對值△T2,檢查結果是否符合5.1.4的規定。式中：△T2——與模塊設置溫度相比溫度偏差的絕對值；T平均——每個溫度點連續測量記錄30次取溫度平均值；6.2.5溫度持續時間準確度在65℃恒溫擴增階段，設定持續時間t。為60min,當溫度達到設定值恒溫65℃±0.5℃第10s開始計時，每隔30s記錄一次溫度實時測量數據T;,直到恒溫擴增階段結束后停止計時，觀測實際測量7GB/T41407—2022溫度T;在65℃±0.5℃的持續時間t,按照公式(5)計算與設定時間t。的相對偏差△t。檢查結果是否符合5.1.5的規定。△t=(t-t?)/t?×100%式中：△t——與設定時間的相對偏差；t——實際測量溫度在恒溫65℃±0.5℃的持續時間；t。——在65℃恒溫擴增階段，設定的持續時間。6.2.6溫度均勻性在65℃恒溫擴增階段，從恒溫擴增腔體的溫度有效使用區中選擇2個(或以上)不同位置的測溫點，用校正的溫度測量傳感器對這些測溫點進行實時溫度測量，獲得溫度測量值，計算不同位置之間溫度測量數據的差值，檢查結果是否符合5.1.6的規定。6.3標準物質檢測6.3.1光強度檢測重復性在常溫條件下，用激發光對標準熒光(或濁度)物質材料的3個濃度進行檢測，檢測時間10min,使用離心管載體每種濃度配制相同的樣本量m(m≥5),每一份各重復測量10次記錄熒光(或濁度)信號測量數據I;,或選擇微流控芯片上相同的獨立通道樣本量m(m≥5)連續重復測量，每個通道選擇最后的10次連續重復記錄的熒光(或濁度)信號測量數據I;,分別計算每份樣本或每個通道的平均值I平均和標準差SD,然后按照公式(6)計算得到熒光(或濁度)信號測量值的變異系數CV,檢查結果是否符合CV——熒光(或濁度)信號測量值的變異系數；SD——每種濃度樣本(每個通道)的熒光(或濁度)信號測量值的標準差；I平均——每種濃度樣本(每個通道)的熒光(或濁度)信號測量值的平均值。6.3.2光強度檢測精密度在擴增儀測定范圍內，配制標準熒光(或濁度)物質溶液，選擇高、中、低3種濃度溶液樣本，使用離心管載體每種濃度配制相同的樣本量k(k≥5),各重復測量n(n≥10)次，記錄熒光(或濁度)信號測量數據I,或選擇微流控芯片上相同的獨立通道樣本量k(k≥5)連續重復測量10min,每個通道選擇最后n(n≥10)次連續重復記錄的熒光(或濁度)信號測量數據I,按照公式(7)計算每種濃度的熒光信號測量值的平均值I呼均并按照公式(8)計算標準差SD?,然后按照公式(6)計算得到CV,判定結果是否符式中：I?均——每種濃度樣本(每個通道)熒光(或濁度)信號測量值的平均值；I每種濃度樣本(每個通道)連續重復記錄的熒光(或濁度)信號測量值；8SD?——每種濃度樣本(每個通道)熒光(或濁度)信號測量值的標準差；k——每種濃度樣本(通道樣本)量；n——每種濃度樣本(每個通道)連續重復測量的次數。在擴增儀測定范圍內，配制標準熒光(或濁度)物質溶液成5個濃度梯度，使用離心管載體每個濃度配制相同的樣本量k(k≥5),各重復測量n(n≥10)次，記錄熒光(或濁度)信號測量數據I;或選擇微流控芯片上相同的獨立通道樣本量k(k≥5)連續重復測量10min,每個通道選擇最后n(n≥10)次連續重復記錄的熒光(或濁度)信號測量數據I;按照公式(7)計算平均值I評均，計算各濃度熒光(或濁度)測量值I評均與稀釋濃度的線性回歸系數r?,判定結果是否符合5.2.3的規定。6.4樣本檢測6.4.1樣本檢測重復性對標準核酸樣本稀釋的高、中、低濃度的樣本進行等溫擴增檢測，使用離心管載體每種濃度配制相同的樣本量m(m≥5)樣本，進行核酸擴增檢測獲得指數級擴增拐點時間tplm;或采用微流控芯片在同一片芯片上選擇相同的獨立通道樣本量m(m≥5),進行核酸擴增檢測獲得tolm;分別計算每種濃度檢測tplm的平均值tpl平均和標準差SD?,按照公式(9)分析計算相同濃度tpim測量值的變異系數CV,,檢查結果是否符合5.3.1的規定。CV,——指數級擴增拐點時間測量值的變異系數；SD?——每種濃度樣本指數級擴增拐點時間測量值的標準差；——每種濃度樣本指數級擴增拐點時間測量值的平均值。注：如Sau或Mtb的10?copies/μL、10'copies采用標準核酸樣本稀釋成系列梯度濃度樣本，使用離心管載體每種濃度配制相同的樣本量l(l≥5)樣本，進行核酸擴增檢測獲得指數級擴增拐點時間tzi;或采用5張微流控芯片，每種濃度一片芯片，在同一片芯片上選擇相同的獨立通道樣本量l(l≥5)進行核酸擴增檢測獲得tpzi;每種濃度按照公式(10)計算平均值tpz平均，分別取各濃度tpz平均和濃度對數值計算其線性回歸系數r?,判定結果是否符合tp2平均=2tpz/l………(10)tgz——每種濃度在同一芯片上選擇的獨立通道樣本量獲得的指數級擴增拐點時間測量值；l——在同一芯片上選擇獨立通道的樣本量；t2平均——每種濃度在同一芯片上相同樣本量獲得的指數級擴增拐點時間測量值的平均值。注：如Sau或Mtb的5個梯度，10°copies/μL、10?copies/μL、10*copies/μL、103copies/μL、102copies/μL。6.5核酸擴增檢測靈敏度采用標準核酸樣品，模板濃度不大于102copies/指標，用擴增儀對樣品進行核酸恒溫擴增檢測，使用離心管載體每種濃度配制相同的樣本量m(m≥5)樣品進行核酸擴增檢測，或采用微流控芯片在同一9片芯片上觀測相同的獨立通道樣本量m(m≥5),在60min內獲得核酸恒溫擴增標準測試曲線，即產生連續穩定的指數級上升并到達平臺期的熒光(或濁度變化)擴增信號，檢查結果是否符合5.4的規定。注：標準核酸樣品如Sau或Mtb。6.6不同通道熒光干擾6.6.1隨機選取n(n≥2)個不同波長熒光通道進行測量，分別配制非目標通道的熒光染料溶液，光學系統收集所有通道的數據，檢查結果是否符合5.5的規定。6.6.2在對通道熒光干擾進行修正或顏色補償后，檢查結果是否符合5.5的規定。目視檢查。6.8電氣安全按照GB4793.1的規定進行試驗。6.9電磁兼容性按照GB/T18268.1、GB/T18268.26的規定進行試驗。6.10環境試驗按照GB/T14710的規定進行試驗。6.11多加熱模塊多加熱通道設備按照6.1～6.10的規定對每個加熱模塊或加熱通道進行試驗。7.1通則產品的標志、標簽和說明書應符合YY/T0466.1的規定。擴增儀的標志、標簽應清晰地標注在顯著位置，并包含以下信息：c)編號或序列號直接標注在貼于擴增儀的標簽上；d)電源連接條件、輸入功率；e)醫療器械注冊證書編號；f)產品生產日期或者批(編)號；g)依據產品特性應標注的圖形、符號以及其他相關內容。如適用，以上信息采用符號表示，并應符合YY/T0466.1的規定。如使用的符號無現有標準規定，則在相關文件中對這些符號進行說明。7.3儀器的外包裝標識擴增儀的外包裝標識應包含以下信息：a)儀器名稱和型號；b)體積(長×寬×高);c)重量(凈重、毛重);d)出廠編號和生產日期；e)運輸儲存標志，圖示標志應符合GB/T191的規定；f)運輸儲存允許環境條件；g)制造企業名稱地點；h)醫療器械注冊證編號；j)本儀器編號；k)電源連接條件、輸入功率。7.4檢驗合格證擴增儀的檢驗合格證應包含以下信息：a)生產廠商名稱；b)產品型號；c)檢驗日期；d)檢驗員代號。7.5使用說明書擴增儀的使用說明書應包含以下信息：b)生產企業名稱、注冊地址、生產地址、聯系方式及售后服務單位；c)《醫療器械生產企業許可證》編號、醫療器械注冊證書編號；d)本文件編號；f)禁忌證、注意事項以及其他需要警示或者提示的內容；g)醫療器械標簽所用的圖形、符號、縮寫等內容的解釋；h)安裝和使用說明或者圖示；i)產品維護和保養方法，特殊儲存條件、方法；j)本文件中規定的應當在說明書中標明的其他內容；k)使用說明書發行的年月或修訂版本號。8.1包裝產品包裝應符合下列要求：a)產品及附件、隨機文件置于中性塑料材料制作的袋內；b)包裝箱的外邊有防雨標志，外包裝箱能保證產品不受自然損壞，箱內用防雨和軟性襯墊等物；c)隨機文件有產品說明書、裝箱清單；d)包裝使用的圖示標志符合GB/T191及《醫療器械說明書和標簽管理規定》的要求。