GB/T8381.3—2023代替GB/T8381.3—2005飼料中林可胺類藥物的測定液相色譜-串聯質譜法2023-08-06發布國家市場監督管理總局I本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。本文件代替GB/T8381.3—2005《飼料中林可霉素的測定》,與GB/T8381.3—2005相比，除結構調整和編輯性改動外，主要技術變化如下：a)更改了適用范圍(見第1章，2005年版的第1章);b)更改了原理(見第4章，2005年版的第4章);c)更改了試劑或材料(見第5章，2005年版的第5章);d)更改了儀器設備(見第6章，2005年版的第6章);e)更改了試驗步驟(見第8章，2005年版的第8章);f)更改了試驗數據處理(見第9章，2005年版的10.2)。請注意本文件的某些內容可能涉及專利，本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由全國飼料工業標準化技術委員會(SAC/TC76)提出并歸口。本文件起草單位：浙江大學、浙江青蓮食品股份有限公司。本文件主要起草人：王鳳芹、汪以真、路則慶、馮杰、王騰浩、劉波靜、程遠之、靳明亮、王新霞、本文件及其所代替文件的歷次版本發布情況為：——2005年首次發布為GB/T8381.3—2005;——本次為第一次修訂。1飼料中林可胺類藥物的測定液相色譜-串聯質譜法1范圍本文件描述了飼料中林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯和吡利霉素的液相色譜-串聯質譜測定方法。本文件適用于配合飼料、濃縮飼料、精料補充料和添加劑預混合飼料中林可霉素、克林霉素、克林霉素磷酸酯和吡利霉素的測定。本文件的檢出限為10μg/kg、定量限為40μg/kg。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法GB/T20195動物飼料試樣的制備3術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。4原理試樣中待測物用甲醇-磷酸鹽緩沖溶液提取，經混合型強陽離子交換固相萃取小柱凈化，液相色譜-串聯質譜儀檢測，外標法定量。5試劑或材料除非另有規定，僅使用分析純試劑。5.5鹽酸溶液：移取0.9mL鹽酸，用水稀釋至100mL,混勻。5.6磷酸鹽緩沖溶液(pH8.0):稱取11.411g三水磷酸氫二鉀，加入430mL水溶解，用鹽酸溶液(5.5)調節pH至8.0±0.1,用水稀釋至500mL,混勻。5.7甲醇-磷酸鹽緩沖溶液：取800mL甲醇(5.3),加入200mL磷酸鹽緩沖溶液(5.6),混勻。5.8甲酸溶液I:取1mL甲酸(5.2),用水稀釋至100mL,混勻。25.9甲酸溶液Ⅱ:取1mL甲酸(5.2),用水稀釋至1000mL,混勻。5.10氨化甲醇溶液：取5mL氨水，用甲醇(5.3)稀釋至100mL,混勻。5.11甲醇溶液：取50mL甲醇(5.3),用水稀釋至100mL,混勻。5.12標準儲備溶液(500μg/mL):分別稱取鹽酸林可霉素(CAS號：859-18-7,純度≥98%)、鹽酸克林霉素(CAS號：21462-39-5,純度≥98%)、克林霉素磷酸酯(CAS號：24729-96-2,純度≥98%)和鹽酸吡利霉素(CAS號：78822-40-9,純度≥98%)各適量(如所用標準品為相應的鹽，則折算成有效成分)(精確至0.01mg),用甲醇(5.3)溶解并稀釋定容，混勻，制成質量濃度均為500μg/mL的標準儲備溶液。于一18℃以下保存，有效期3個月。5.13混合標準中間溶液(10μg/mL):準確移取標準儲備溶液(5.12)各1mL于50mL容量瓶中，用甲醇(5.3)稀釋并定容，混勻。于2℃~8℃保存，有效期7d。5.14混合標準系列溶液：準確移取混合標準中間溶液(5.13)適量，用甲醇溶液(5.11)配制成質量濃度分別為1μg/L、2μg/L、5μg/L、10μg/L、50μg/L、100μg/L和200μg/L的混合標準系列溶液。臨用5.15混合型強陽離子交換固相萃取小柱：500mg/6mL,或性能相當者。6儀器設備6.1液相色譜-串聯質譜儀：配電噴霧離子源(ESI)。6.2分析天平：精度0.01g和0.01mg。6.3離心機：轉速不低于8000r/min。6.4超聲波清洗儀。6.5固相萃取裝置。7樣品按GB/T20195制備試樣。取樣品至少200g,粉碎使其全部通過0.425mm孔徑的分析篩，充分混8試驗步驟平行做兩份試驗。稱取2.5g(精確至0.01g)試樣于50mL離心管中，準確加入25mL甲醇-磷酸鹽緩沖溶液(5.7),渦旋混勻，超聲提取15min,于8000r/min離心5min,取上清液于另一支50mL離心管中。重復提取一次，合并上清液，混勻。準確移取2.5mL(V?)于10mL離心管中，加入2.5mL甲8.2凈化依次用6mL甲醇(5.3)、6mL水和6mL甲酸溶液I(5.8)活化固相萃取小柱，備用液(8.1)全部過柱，分別用6mL甲酸溶液I(5.8)、6mL水和6mL甲醇(5.3)淋洗，抽干。用3mL氨化甲醇溶液3(5.10)洗脫，收集洗脫液于50℃氮氣吹干，準確加入2.5mL(V?)甲醇溶液(5.11),渦旋溶解，微孔濾膜8.3儀器參考條件8.3.1液相色譜參考條件液相色譜參考條件如下：a)色譜柱：C?色譜柱，柱長50mm,內徑2.1mm,粒徑1.7μm,或性能相當者；b)流動相：A——甲酸溶液Ⅱ(5.9),B——乙腈(5.4);c)梯度洗脫，洗脫程序見表1;表1梯度洗脫程序時間/minA/%B/%224.5228.3.2質譜參考條件質譜參考條件如下：a)電離方式：電噴霧電離，正離子模式(ESI+);b)檢測方式：多反應監測(MRM);e)脫溶劑氣流速：1000L/h;f)霧化氣、干燥氣為高純氮氣，碰撞氣為高純氬氣或其他合適氣體；g)監測離子對、錐孔電壓和碰撞能量見表2。表2林可胺類藥物的監測離子對、錐孔電壓和碰撞能量參考值化合物母離子(m/z)子離子(m/z)錐孔電壓/V碰撞能量/eV林可霉素407.4359.5克林霉素425.4377.44GB/T8381.3—2023表2林可胺類藥物的監測離子對、錐孔電壓和碰撞能量參考值(續)化合物母離子(m/z)子離子(m/z)錐孔電壓/V碰撞能量/eV克林霉素磷酸酯505.2457.4吡利霉素411.2363.3”定量離子。8.4測定8.4.1標準系列溶液和試樣溶液測定在儀器的最佳條件下，分別取混合標準系列溶液(5.14)和試樣溶液上機測定。標準溶液的定量離子對色譜圖見附錄A。8.4.2定性在相同試驗條件下，試樣溶液中待測物的保留時間應與標準系列溶液(濃度相當)中待測物的保留時間一致，其相對偏差在±2.5%之內。根據表2選擇的定性離子對，比較試樣譜圖中待測物監測離子對的相對離子豐度與濃度接近的標準系列溶液中對應的監測離子對的相對離子豐度，若最大允許偏差不超過表3規定的范圍，則可判定為樣品中存在對應的待測物。表3定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差相對離子豐度/%最大允許偏差/%8.4.3定量在儀器最佳工作條件下，混合標準系列溶液與試樣溶液交替進樣，采用外標法定量。以標準溶液中被測組分的峰面積為縱坐標，以標準溶液中被測組分的濃度為橫坐標繪制標準工作曲線，標準曲線的相關系數應不低于0.99。試樣溶液與標準溶液中待測物的響應值均應在儀器檢測的線性范圍內。當試樣的上機濃度超過線性范圍時，需根據測定濃度稀釋后進行重新測定。單點校準定量時，試樣溶液中待測物的濃度與標準溶液濃度相差不超過30%。9試驗數據處理點校準按式(2)計算：式中：p——從標準曲線查得的試樣溶液待測物的質量濃度，單位為微克每升(μg/L);5GB/T8381.3—2023V——試樣提取溶液的體積，單位為毫升(mL);V?——上機前最終定容體積，單位為毫升(mL);n——超出線性范圍后試樣溶液的稀釋倍數；V?——移取上清液的體積，單位為毫升(mL);m——試樣的質量，單位為克(g)。 (2)式中：A——試樣溶液中待測物的色譜峰面積；p、——標準工作液中待測物的質量濃度，單位為微克每升(μg/L);V——試樣提取溶液的體積，單位為毫升(mL);V?——上機前最終定容體積，單位為毫升(mL);n——超出線性范圍后試樣溶液的稀釋倍數；A、——標準工作液中待測物的色譜峰面積；V?——移取上清液的體積，單位為毫升(mL);測定結果用平行測定的算術平均值表示，保留三位有效數字。10