PCR檢測(cè)技術(shù)生物技術(shù)教研室：鄭鳴目錄PCR技術(shù)簡(jiǎn)史PCR的原理PCR的反應(yīng)條件PCR的類型和應(yīng)用PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解鏈酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明1971年，Khorana提出：經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因。但由于測(cè)序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以，Khorana的設(shè)想被人們遺忘了……PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明1985年，美國(guó)PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制最初采用E-coliDNA聚合酶進(jìn)行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時(shí)，費(fèi)力，且易出錯(cuò)耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺(tái)PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀1993年，Mullis等因此項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)KaryB.Mullis

<<TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction>>1989年美國(guó)《Science》雜志列PCR為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。PCR只是一個(gè)簡(jiǎn)單的不起眼玩藝。

——?jiǎng)P利·穆利斯（KaryMullis)我不認(rèn)為PCR能夠用兩種“革命”(政治革命和科學(xué)革命)加以說明。……它的發(fā)明并沒有改變基因操作的本質(zhì)。有了PCR，我們能在更廣的范圍內(nèi)更快、更容易地進(jìn)行基因操作，學(xué)術(shù)界也完全不用等到某人死去或退休后才能接受PCR。它只不過是一種新工具。

——?jiǎng)P利·穆利斯（KaryMullis)生物樣品DNA片段基因診斷基因治療基因工程產(chǎn)品法醫(yī)學(xué)檢測(cè)人類學(xué)研究……基因組DNA獲取特定DNA片段擴(kuò)增特定DNA片段DNA聚合酶引物引物M13噬菌體Sanger的測(cè)序技術(shù)引物DNA聚合酶引物引物Mullis的構(gòu)思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段94℃變性50-65℃退火XX℃延伸94℃55℃37℃Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)4050607080901001008060402072℃94℃55℃PCR循環(huán)PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系4種dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA

0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+

1.5mmol/L1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)PCR的基本原理1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95℃PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)PCR的基本原理50℃引物1引物2DNA引物PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)PCR的基本原理72℃引物1引物2DNA引物Taq酶Taq酶PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)PCR的基本原理第1輪結(jié)束95℃第2輪開始PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)PCR的基本原理95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)PCR的基本原理72℃第2輪結(jié)束PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)靈敏度高皮克(pg=10-12)量級(jí)擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞病毒檢測(cè)的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU細(xì)菌檢測(cè)的最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌特異性高引物的特異性。引物延伸時(shí)，堿基配對(duì)的正確性。TaqDNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性。靶基因的特異性與保守性。選擇擴(kuò)增特異性和保守性高的靶基因區(qū)域，擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性程度就更高。PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)簡(jiǎn)便、快速整個(gè)PCR的擴(kuò)增在一個(gè)小小的離心管中完成，過程也只是簡(jiǎn)單的溫度變化，耐高溫的TaqDNA聚合酶的應(yīng)用，避免了DNA聚合酶的反復(fù)加入。一次性加好反應(yīng)液，2～4小時(shí)完成擴(kuò)增對(duì)標(biāo)本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提DNAPCR反應(yīng)五要素引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板（template）Mg2+（magnesium）引物（primer）引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。

引物設(shè)計(jì)是PCR技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)，使用不合適的PCR引物容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗：表現(xiàn)為擴(kuò)增出目的帶之外的多條帶，不出帶或出帶很弱，等等。現(xiàn)在PCR引物設(shè)計(jì)大都通過計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行。引物設(shè)計(jì)的基本原則引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配)。引物（primer）具體因素引物長(zhǎng)度（primerlength）產(chǎn)物長(zhǎng)度（productlength）序列Tm值(meltingtemperature)引物與模板形成雙鏈的內(nèi)部穩(wěn)定性(internalstability,用?G值反映)形成引物二聚體(primerdimer)及發(fā)夾結(jié)構(gòu)（duplexformationandhairpin）的能值在錯(cuò)配位點(diǎn)（falseprimingsite）的引發(fā)效率，引物及產(chǎn)物的GC含量（composition）……引物（primer）引物的長(zhǎng)度：一般為15-30bp，常用的是18-24bp，但不應(yīng)大于38，因?yàn)檫^長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，即Taq酶的最適溫度。引物過短又同時(shí)會(huì)引起錯(cuò)配現(xiàn)象，一般來說引物長(zhǎng)度大于16bp是必要的（不容易引起錯(cuò)配）。

例如：一個(gè)長(zhǎng)度為12bp的引物在人類基因組上存在200個(gè)潛在的退火位點(diǎn)(3x109/412=200).而一個(gè)長(zhǎng)度為20bp的引物在人基因組上存在的退火位點(diǎn)只有1/400個(gè).較長(zhǎng)的引物（28-35bp)一般是用來區(qū)分同源性較高的模板序列或者使用于產(chǎn)生一些突變位點(diǎn)。引物（primer）引物設(shè)計(jì)的一般原則引物（primer）引物設(shè)計(jì)的一般原則引物的Tm值引物的Tm值一般控制在55-60度,盡可能保證上下游引物的Tm值一致,一般不超過4～6度.如果引物中的G+C含量相對(duì)偏低,則可以使引物長(zhǎng)度稍長(zhǎng),而保證一定的退火溫度.

經(jīng)驗(yàn)公式：Tm=2(A+T)+4(C+G)（primer5.0）Nearestnei:最近鄰位（oligo6.0）引物（primer）引物設(shè)計(jì)的一般原則引物序列的GC含量一般為40-60%，以45-55％為宜，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，導(dǎo)致引物的GC含量不能在上述范圍內(nèi)，這時(shí)應(yīng)盡量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大），以有利于退火溫度的選擇。如果G-C比例超出，則在引物的5’端增加A或T；而如果A-T比例過高，則同樣在5’端增加G或C。引物3’端的序列要比5’端重要引物3’端的堿基一般不用A（3’端堿基序列最好是G、C、CG、GC），因?yàn)锳在錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)的引發(fā)效率相對(duì)比較高。另外引物間3’端的互補(bǔ)、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。5’端序列對(duì)PCR影響不大，因此常用來引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物。引物（primer）引物設(shè)計(jì)的一般原則引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高、尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)配。引物3’端出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會(huì)使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加。引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性。引物（primer）引物設(shè)計(jì)的一般原則可能的錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)決定于引物序列組成與模板序列組成的相似性，相似性高則錯(cuò)誤引發(fā)率高。

錯(cuò)誤引發(fā)的引發(fā)率一般不要高過100，如此可保證不出非目的產(chǎn)物的假帶。但對(duì)于特定的模板序列，還應(yīng)結(jié)合比較其在正確位點(diǎn)的引發(fā)效率。如果兩者相差很大，比如在正確位點(diǎn)的引發(fā)效率為450以上，而在錯(cuò)誤位點(diǎn)的引發(fā)效率為130，并且不好找其他更合適的引物，那么這對(duì)引物也是可以接受的。引物（primer）引物設(shè)計(jì)的一般原則ΔG值(自由能)反映了引物與模板結(jié)合的強(qiáng)弱程度，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性。

一般情況下，引物的ΔG值最好呈正弦曲線形狀，即5’端和中間ΔG值較高，而3’端ΔG值相對(duì)較低，且不要超過9（ΔG值為負(fù)值，這里取絕對(duì)值），如此則有利于正確引發(fā)反應(yīng)而可防止錯(cuò)誤引發(fā)。引物的3’端的?G值過高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。（能值越高越容易結(jié)合）引物（primer）引物設(shè)計(jì)的一般原則引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能量一般不要超過4.5，否則容易產(chǎn)生引物二聚體帶而且會(huì)降低引物濃度從而導(dǎo)致PCR正常反應(yīng)不能進(jìn)行。

與二聚體相關(guān)的一個(gè)參數(shù)是堿基的分布，3’端的連續(xù)GGG或CCC會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)。二聚體形成的能值越高越穩(wěn)定，越不符合要求。與二聚體相同，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值越低越好。雖然有些帶有發(fā)夾環(huán)，其ΔG為－3kcal/mol的自身互補(bǔ)引物也可以得到不錯(cuò)的結(jié)果，但是如果它的3′末端被發(fā)夾環(huán)占據(jù)時(shí)就很麻煩，即會(huì)引發(fā)引物內(nèi)部的延伸反應(yīng)，減少了參與正式反應(yīng)引物的數(shù)量。當(dāng)然，如果發(fā)夾環(huán)在5′末端對(duì)反應(yīng)就沒有多大的影響了。

引物（primer）引物設(shè)計(jì)的一般原則Oligo6（引物評(píng)價(jià)）*PrimerPremier（自動(dòng)搜索）*VectorNTISuitDnasisOmigaDnastarPrimer3（在線服務(wù)）*引物（primer）引物設(shè)計(jì)的常用軟件PrimerPremier5.0的使用簡(jiǎn)介主要功能:引物設(shè)計(jì)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)分析DNA基元(motif)查找同源性分析簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)根據(jù)氨基酸序列來設(shè)計(jì)引物DNA引物PremierPrimer5提供了8種生物遺傳密碼使用的偏好選擇1、纖毛蟲大核（CiliateMacronuclear）2、無(wú)脊椎動(dòng)物線粒體（InvertebrateMitochondrion）3、支原體（Mycoplasma）4、植物線粒體（PlantMitochondrion）5、原生動(dòng)物線粒體（ProtozoanMitochondrion）6、一般標(biāo)準(zhǔn)（Standard）7、脊椎動(dòng)物線粒體（VertebrateMitochondrion）8、酵母線粒體（YeastMitochondrion）PrimerPremier5.0使用介紹(1)PreimerPremier啟動(dòng)界面Loadsequence基本信息SequencenameOriginalsequenceUsethesetwobuttontotranslatetheDNAseqtoaproteinseqoraproteinseqtoaDANseq8種密碼子偏好Chooseafunction引物設(shè)計(jì)界面Sensestrandoranti-sensestrandUsefulinformationoftheprimerFirstyoucandesigntheprimermanually引物搜索選項(xiàng)設(shè)定引物類型搜索模式5’引物位置范圍3’引物位置范圍產(chǎn)物大小范圍引物長(zhǎng)度搜索結(jié)果28對(duì)引物引物分值100分為滿分每對(duì)引物的信息雙擊選中一對(duì)引物引物信息回到主窗口引物及產(chǎn)物信息是否出現(xiàn)hairpin,dimer,falseprimingandcrossdimer一對(duì)理想的引物應(yīng)當(dāng)不存在任何一種上述結(jié)構(gòu)，因此最好的情況是最下面的分析欄都none，But…引物編輯引物編輯EditprimerhereAnalysistheeditresultAccepttheeditresultReturntothemainwindow用primer5.0對(duì)引物評(píng)價(jià)duplexformation:這是評(píng)價(jià)引物二聚體形成的，包括自身形成二聚體和引物間二聚體，形成二聚體的能值，引物3‘端有無(wú)配對(duì)堿基(最好沒有)。hairpinformation:是看引物自身能否形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，主要也是看3’端不要形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。還要看形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值，不超過4.5。falseprimingsite:如果模板不是基因組DNA，而是一個(gè)特定模板序列，需要進(jìn)行錯(cuò)配的分析，看你的引物（尤其3‘端）是否與特定模板的其他位點(diǎn)結(jié)合。PCR：總結(jié)性的顯示引物位置，產(chǎn)物大小，Tm值等參數(shù)，你可以橫向比較一下，Oligo6.0使用說明主要功能：專門的引物設(shè)計(jì)和分析軟件Oligo6.44啟動(dòng)界面Opensequencefile3個(gè)彈出窗口Meltingtemperature?GInternalStabilityFrq為鄰近6至7個(gè)堿基組成的亞單位在一個(gè)指定數(shù)據(jù)庫(kù)文件中的出現(xiàn)頻率。該頻率高則可增加錯(cuò)誤引發(fā)的可能性。用Oligo

設(shè)計(jì)引物時(shí)的3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)Tm值曲線以選取5’到3’的下降形狀有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng)。Frq曲線宜選用3’端Frq值相對(duì)較低的片段。ΔG值在5’端和中間值比較高，而在3’端相對(duì)低。選中引物上游引物下游引物只是示意圖引物分析首先檢查引物二聚體尤其是3’端二聚體形成的可能性。引物分析二項(xiàng)檢查是發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpin）；與二聚體相同，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值越低越好。引物分析第三項(xiàng)檢查為GC含量，以45-55％為宜。第四Falsepriming檢查引物分析KeyinformationofprimerHairpinDimerandcrossDimerGC%TotalPCRinformationFinalPCRinformationSearchforprimerusingOligo

6.0Searchprimer利用oligo6.0進(jìn)行引物評(píng)價(jià)duplexformation:這是評(píng)價(jià)引物二聚體形成的，包括自身形成二聚體和引物間二聚體，主要是看引物3‘端有無(wú)配對(duì)堿基(最好沒有)。形成的二聚體要看能值，能值越低越好，最好不要超過4.5hairpinformation:是看引物自身能否形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，主要也是看3’端不要形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。還要看形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值，不超過4.5。如果引物中加入酶切位點(diǎn)，可能會(huì)有發(fā)夾結(jié)構(gòu)且能值不會(huì)太低，這就需要靈活控制退火溫度了。compositionandTm:分析上下游引物的堿基組成，GC比和Tm值，原則我就不多說了。falseprimingsite:如果模板不是基因組DNA，而是一個(gè)特定模板序列，需要進(jìn)行錯(cuò)配的分析，看你的引物（尤其3‘端）是否與特定模板的其他位點(diǎn)結(jié)合。一般錯(cuò)配的引發(fā)效率以不超過100為好，但并不絕對(duì)，如果正確結(jié)合位點(diǎn)的引發(fā)效率為450以上，而有一個(gè)錯(cuò)配的引發(fā)效率是120左右的，這個(gè)引物也是可以接受地！！PCR：總結(jié)性的顯示引物位置，產(chǎn)物大小，Tm值等參數(shù)，你可以橫向比較一下，尤其是給了一個(gè)optimalannealingtem還是可以參照一下地。也給了簡(jiǎn)單的評(píng)價(jià)供參考。利用oligo6.0進(jìn)行引物評(píng)價(jià)每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。引物（primer）引物濃度目前有兩種TaqDNA聚合酶供應(yīng)天然酶：從棲熱水生桿菌中提純基因工程酶：大腸菌合成一個(gè)典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U（指總反應(yīng)體積為100ul時(shí)）濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少酶（TaqDNApolymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系dNTP呈顆粒狀，保存不當(dāng)易變性失活dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以1MNaOH或1MTris-HCl的緩沖液將其pH調(diào)節(jié)到7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會(huì)使dNTP降解在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等（等摩爾配制），如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)（偏高或偏低），就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低模板（template）單、雙鏈DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。濃度一般為100ng/100L，模板濃度過高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。一般臨床檢測(cè)標(biāo)本，可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增。模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。核酸的分離純化盡可能保持其天然狀態(tài)，防止降解和變性。條件溫和，防止過酸、過堿、劇烈攪拌。抑制核酸酶。制備細(xì)胞及破碎細(xì)胞消化蛋白質(zhì),去除生物大分子去除不需要的核酸分子沉淀核酸,去除雜質(zhì)基本步驟：基本原則：模板（template）基因組DNA的提取

CTAB法

SDS法其它核酸的分離純化模板（template）非基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取

堿裂解法煮沸法

線粒體、葉綠體DNA的提取

差速離心結(jié)合SDS裂解法核酸的分離純化模板（template）

CTAB法原理CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽(yáng)離子去污劑，可溶解細(xì)胞膜，并與核酸形成復(fù)合物。該復(fù)合物在高鹽溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。注：CTAB溶液在低于15℃

時(shí)會(huì)形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時(shí)溫度不要低于15℃。基因組DNA的提取方法簡(jiǎn)介

CTAB法（植物DNA提取經(jīng)典方法）

組份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）NaClCTABβ-巰基乙醇

終濃度100mM20mM1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入Tris-HCl（pH8.0）提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl提供一個(gè)高鹽環(huán)境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；β-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除

CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方

CTAB法（植物DNA提取經(jīng)典方法）

組份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）NaClCTABPVP40β-巰基乙醇

終濃度100mM20mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時(shí)它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。

CTAB提取緩沖液的改進(jìn)配方

CTAB法（植物DNA提取經(jīng)典方法）植物材料裂解液上層溶液液氮研磨抽提細(xì)胞裂解干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液

CTAB法流程圖

CTAB法（植物DNA提取經(jīng)典方法）SDS法原理SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫（55～65℃）條件下能裂解細(xì)胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；提高鹽(KAc或NH4Ac)濃度并降低溫度（冰浴），使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。組份Tris-HCl（pH8.0）

EDTA（pH8.0）

NaClSDS終濃度10mM20mM0.4M2%SDS法DNA提取緩沖液

SDS法基因組DNA的提取方法簡(jiǎn)介動(dòng)物組織細(xì)胞裂解上層溶液組織勻漿抽提干燥溶解離心洗滌酒精沉淀DNA溶液SDS法流程圖（以動(dòng)物組織為例）

SDS法物理方式：玻璃珠法、超聲波法、研磨法、凍融法化學(xué)方式：異硫氰酸胍法、堿裂解法生物方式：酶法根據(jù)細(xì)胞裂解方式的不同有：其它方法基因組DNA的提取方法簡(jiǎn)介吸附材料結(jié)合法：根據(jù)核酸分離純化方式的不同有：硅質(zhì)材料

陰離子交換樹脂磁珠

高鹽低pH值結(jié)合核酸，低鹽高pH值洗脫。快捷高效。低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用于純度要求高的實(shí)驗(yàn)。磁性微粒掛上不同基團(tuán)可吸附不同的目的物，從而達(dá)到分離目的。其它方法基因組DNA的提取方法簡(jiǎn)介濃鹽法：

有機(jī)溶劑抽提法：

密度梯度離心法：

利用RNP和DNP在鹽溶液中溶解度不同，將二者分離有機(jī)溶劑作為蛋白變性劑，同時(shí)抑制核酸酶的降解作用利用不同內(nèi)容物密度不同的原理分離各種內(nèi)容物根據(jù)核酸分離純化方式的不同有：其它方法堿裂解法原理染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子；當(dāng)用堿處理DNA溶液時(shí)，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性pH時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。質(zhì)粒DNA的提取非基因組DNA的提取方法簡(jiǎn)介對(duì)數(shù)期菌體溶液III中和溶液I充分重懸溶液II裂解上清液抽提離心洗滌酒精沉淀干燥溶解沉淀質(zhì)粒DNA溶液堿裂解法流程圖質(zhì)粒DNA的提取煮沸法原理染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價(jià)閉合環(huán)狀分子；當(dāng)加熱處理DNA溶液時(shí)，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在冷卻時(shí)即恢復(fù)其天然構(gòu)象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。質(zhì)粒DNA的提取

細(xì)胞器DNA－差速離心法差速離心法原理是利用物質(zhì)比重的不同分離混合物的一種方法。將待分離物質(zhì)置于均勻介質(zhì)（蔗糖）中，以一定的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心，比重大的物質(zhì)優(yōu)先沉降，比重小的卻處于上層，從而得以分離。線粒體和葉綠體是生物體內(nèi)半自主性細(xì)胞器，自身可編碼蛋白，它們的比重和大小一定，因而在同一離心場(chǎng)內(nèi)的沉降速度也一定，根據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法，將細(xì)胞內(nèi)各種組分分級(jí)分離出來。非基因組DNA的提取方法簡(jiǎn)介I.材料準(zhǔn)備II.破碎細(xì)胞或包膜－內(nèi)容物釋放III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)

V.核酸溶解在適量緩沖液或水中基因組DNA的提取基本步驟I.材料準(zhǔn)備最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融提取血液基因組DNA時(shí)，要選擇有核細(xì)胞（白細(xì)胞）組培細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間不能過長(zhǎng)，否則會(huì)造成DNA降解含病毒的液體材料DNA含量較少，提取前先富集基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取使用處于對(duì)數(shù)期的新鮮菌體（老化菌體導(dǎo)致開環(huán)質(zhì)粒增加）培養(yǎng)時(shí)應(yīng)加入篩選壓力，否則菌體易污染，質(zhì)粒易丟失盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒，如為低拷貝或大質(zhì)粒，則應(yīng)加大菌體用量菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失）材料應(yīng)適量，過多會(huì)影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低針對(duì)不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式：植物材料－－液氮研磨動(dòng)物組織－－勻漿或液氮研磨組培細(xì)胞－－蛋白酶K細(xì)菌－－溶菌酶破壁酵母－－破壁酶或玻璃珠高溫溫浴時(shí)，定時(shí)輕柔振蕩基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取菌體量適當(dāng)培養(yǎng)基去除干凈，同時(shí)保證菌體在懸浮液中充分懸浮變性的時(shí)間不要過長(zhǎng)（5分鐘），否則質(zhì)粒易被打斷復(fù)性時(shí)間也不宜過長(zhǎng)，否則會(huì)有基因組DNA的污染G＋菌、酵母質(zhì)粒的提取，應(yīng)先用酶法或機(jī)械法處理，以破壁II.破碎細(xì)胞或包膜采用吸附材料吸附的方式分離DNA時(shí)，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系采用有機(jī)（酚/氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，但動(dòng)作要輕柔離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間針對(duì)不同材料的特點(diǎn)，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取III.核酸分離、純化蛋白質(zhì)的去除：酚/氯仿抽提使用變性劑變性（SDS、異硫氰酸胍等）高鹽洗滌蛋白酶處理III.核酸分離、純化多糖的去除：高鹽法：用乙醇沉淀時(shí)，在待沉淀溶液中加入1/2體積的5MNaCl，高鹽可溶解多糖。用多糖水解酶將多糖降解。在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積)，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μLDNA液中加入200μl20%PEG8000(含1.2MNaCl)，冰浴20min。III.核酸分離、純化多酚的去除：在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：β-巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等加入易與酚類結(jié)合的試劑：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它們與酚類有較強(qiáng)的親和力，可防止酚類與DNA的結(jié)合鹽離子的去除：70％的乙醇洗滌III.核酸分離、純化當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會(huì)更充分沉淀時(shí)加入1/10體積的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后應(yīng)用70％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥）若長(zhǎng)期儲(chǔ)存建議使用TE緩沖液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNasepH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解基因組DNA的提取質(zhì)粒DNA的提取IV.核酸的沉淀、溶解DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)DNA中殘留有金屬離子重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)（具體方法見前）重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)增加70％乙醇洗滌的次數(shù)（2-3次）DNA提取常見問題問題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)。

原因?qū)Σ卟牧喜恍迈r或反復(fù)凍融未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性提取過程操作過于劇烈，DNA被機(jī)械打斷外源核酸酶污染反復(fù)凍融盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時(shí)，可增加裂解液中螯合劑的含量細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔所有試劑用無(wú)菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌將DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融問題二：DNA降解。對(duì)策

原因DNA提取常見問題實(shí)驗(yàn)材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗滌時(shí)DNA丟失盡量選用新鮮（幼嫩）的材料動(dòng)植物要?jiǎng)驖{研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或機(jī)械方式破壁高溫裂解時(shí)，時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)（對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌可增加PK的用量）低溫沉淀，延長(zhǎng)沉淀時(shí)間加輔助物，促進(jìn)沉淀洗滌時(shí)，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒問題三：DNA提取量少。對(duì)策

原因DNA提取常見問題異硫氰酸胍/苯酚法

原理：細(xì)胞在變性劑異硫氰酸胍的作用下被裂解，同時(shí)核蛋白體上的蛋白變性，核酸釋放；釋放出來的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分別位于整個(gè)體系中的中間相和水相，從而得以分離；有機(jī)溶劑抽提，沉淀，得到純凈RNA。RNA的提取方法簡(jiǎn)介

步驟:材料準(zhǔn)備：盡量新鮮。裂解變性：異硫氰酸胍（亞硫氫胍，巰基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。使細(xì)胞及核蛋白復(fù)合物變性，釋放RNA，有效抑制核酸酶。純化分離：苯酚，氯仿，異戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除雜物。洗滌：70％乙醇。沉淀：異丙醇、無(wú)水乙醇。乙酸鈉（pH4.0）：維持變性的細(xì)胞裂解液的pH值，沉淀RNA。此外還常用氯化鋰選擇沉淀RNA。異硫氰酸胍/苯酚法RNA的提取方法簡(jiǎn)介影響RNA提取的因素

材料：新鮮，切忌使用反復(fù)凍融的材料如若材料來源困難，且實(shí)驗(yàn)需要一定的時(shí)間間隔。可以先將材料貯存在TRIzol或樣品貯存液中，于－70℃或－20℃保存如要多次提取，請(qǐng)分成多份保存液氮長(zhǎng)期保存，－70℃短期保存異硫氰酸胍/苯酚法

樣品破碎及裂解：根據(jù)不同材料選擇不同的處理方法：培養(yǎng)細(xì)胞：通常可直接加裂解液裂解酵母和細(xì)菌：一般TRIzol可直接裂解，對(duì)于一些特殊的材料可先用酶或者機(jī)械方法破壁動(dòng)植物組織：先液氮研磨和勻漿，后加裂解液裂解。期間動(dòng)作快速，樣品保持冷凍樣品量適當(dāng)，保證充分裂解為減少DNA污染，可適當(dāng)加大裂解液的用量影響RNA提取的因素異硫氰酸胍/苯酚法

純化：在使用氯仿抽提純化時(shí)，一定要充分混勻，且動(dòng)作快速；經(jīng)典的純化方法，如LiCl沉淀等，雖然經(jīng)濟(jì)，但操作時(shí)間長(zhǎng)，易造成RNA降解；柱離心式純化方法：抽提速度快，能有效去除影響RNA后續(xù)酶反應(yīng)的雜質(zhì)，是目前較為理想的選擇。影響RNA提取的因素異硫氰酸胍/苯酚法

RNA的降解

OD260/OD280比值偏低電泳帶型異常下游實(shí)驗(yàn)效果不佳RNA的提取常見問題

新鮮細(xì)胞或組織：裂解液的質(zhì)量外源RNase的污染裂解液的用量不足組織裂解不充分另外某些富含內(nèi)源酶的樣品(如脾臟，胸腺等)，很難避免RNA的降解。建議在液氮條件下將組織碾碎，并且勻漿時(shí)使用更多裂解液。

RNA的降解

冷凍樣品：樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍，然后可以移至-70℃冰箱保存。樣品要相對(duì)小一點(diǎn)；先用液氮研磨，再加裂解液勻漿；樣品與裂解液充分接觸前避免融化，研磨用具必須預(yù)冷，碾磨過程中及時(shí)補(bǔ)充液氮。

RNA的降解OD260/OD280

比值偏低

蛋白質(zhì)污染：不要吸入中間層及有機(jī)相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。減少起始樣品量，確保裂解完全、徹底解決辦法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。苯酚殘留：不要吸入中間層及有機(jī)相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。解決辦法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。

抽提試劑殘留：確保洗滌時(shí)要徹底懸浮RNA，并且徹底去掉75%乙醇。解決辦法:再沉淀一次后，溶解。設(shè)備限制：測(cè)定OD260及OD280數(shù)值時(shí)，要使OD260讀數(shù)在0.10-0.50之間。此范圍線性最好。用水稀釋樣品：測(cè)OD時(shí)，對(duì)照及樣品稀釋液請(qǐng)使用10mMTris，pH7.5。用水作為稀釋液將導(dǎo)致比值的降低。OD260/OD280

比值偏低電泳帶型異常

非變性電泳：上樣量超過

3ug，電壓超過

6V/cm，電泳緩沖液陳舊，均可能導(dǎo)致

28S和

18S條帶分不開。

變性電泳條帶變淡：

EB與單鏈的結(jié)合能力要差一些，故同樣的上樣量，變性電泳比非變性電泳要淡一些；甲醛的質(zhì)量不高。下游實(shí)驗(yàn)效果不佳RNA降解

抽提試劑的殘留

75%乙醇洗滌

樣品中雜質(zhì)的殘留

多糖等雜質(zhì)，再次沉淀

DNA污染

使用RNase-Free的DNaseI消化抽提RNAMg2+是DNA聚合酶的激活劑。0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。Mg2+濃度過低會(huì)使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合，所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。Mg2+（magnesium）PCR反應(yīng)條件的選擇溫度時(shí)間循環(huán)次數(shù)溫度與時(shí)間的設(shè)置設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對(duì)于較短靶基因（長(zhǎng)度為100～300bp時(shí)）可采用二溫度點(diǎn)法，將退火與延伸溫度合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸。溫度與時(shí)間的設(shè)置變性溫度與時(shí)間變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因一般93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性若低于93℃則需延長(zhǎng)時(shí)間但溫度不能過高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗。溫度與時(shí)間的設(shè)置退火溫度與時(shí)間退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(zhǎng)度對(duì)于20個(gè)核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想溫度與時(shí)間的設(shè)置退火溫度與時(shí)間經(jīng)驗(yàn)公式：Tm值（解鏈溫度）=4（G+C）＋2（A+T）復(fù)性溫度=Tm值-（5～10℃）在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性復(fù)性時(shí)間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合延伸溫度：一般選擇在70～75℃之間常用溫度為72℃過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。延伸反應(yīng)時(shí)間：根據(jù)待擴(kuò)增片段長(zhǎng)度而定1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間1min（足夠）3～4kb的靶序列需3～4min擴(kuò)增10Kb需延伸至15min延伸進(jìn)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些。溫度與時(shí)間的設(shè)置延伸溫度與時(shí)間循環(huán)次數(shù)的設(shè)置決定PCR擴(kuò)增程度主要取決于模板DNA的濃度循環(huán)次數(shù)：選在30～40次之間循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多PCR的類型和應(yīng)用RT-PCR（reversetranscriptionPCR）不對(duì)稱PCR（AsymmetricPCR）多重PCR（multiplexPCR）反向PCR(reversePCR)LP-PCR（Labelledprimers)原位PCR（InSituPCR,Is－PCR）巢氏PCR（NestedPCR,N-PCR）實(shí)時(shí)熒光定量PCRRT-PCR（reversetranscriptionPCR）ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴(kuò)增逆轉(zhuǎn)錄酶先將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后再以cDNA為模板，用PCR方法加以擴(kuò)增。基因蛋白質(zhì)多肽鏈RT-PCR（reversetranscriptionPCR）不對(duì)稱PCR

目的：擴(kuò)增產(chǎn)生特異長(zhǎng)度的單鏈DNA。方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,關(guān)鍵是限制性引物的絕對(duì)量。用途：制備核酸序列測(cè)定的模板；制備雜交探針;基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究高濃度引物低濃度引物不對(duì)稱PCR

多重PCR（multiplexPCR）多重PCR是在同一反應(yīng)中采用多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增幾個(gè)不同的DNA片段引物用于檢測(cè)特定基因序列的存在或缺失。是用反向的互補(bǔ)引物來擴(kuò)增兩引物以外的DNA片段對(duì)某個(gè)已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。可對(duì)未知序列擴(kuò)增后進(jìn)行分析,如探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長(zhǎng)cDNA的克隆,擴(kuò)增基因文庫(kù)的插入DNA；建立基因組步移文庫(kù)。已知序列未知序列未知序列反向PCR(reversePCR)已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶連接酶反向PCR

LP-PCR（Labelledprimers)利用同位素、熒光素等對(duì)ＰＣＲ引物進(jìn)行標(biāo)記，用以直觀地檢測(cè)目的基因。細(xì)菌1細(xì)菌2細(xì)菌3細(xì)菌4可同時(shí)檢測(cè)多種基因成分，適合基因診斷和生物檢測(cè)。標(biāo)記引物ＰＣＲ觀察PCR產(chǎn)物L(fēng)P-PCR（Labelledprimers)原位PCR（InSituPCR,Is－PCR）原位分子雜交（insituhybridization）

原位PCR技術(shù)是PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物，其基本過程是，先用合適的固定劑對(duì)組織或細(xì)胞進(jìn)行固定，然后用蛋白酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透處理，以確保PCR試劑進(jìn)入細(xì)胞并同靶序列接觸，最后于Eppendorf管中或載玻片對(duì)DNA和RNA進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)原位擴(kuò)增。原位PCR（InSituPCR,Is－PCR）A.陽(yáng)性對(duì)照B.陰性對(duì)照C.原位檢測(cè)mRNA表達(dá)巢氏PCR（NestedPCR,N-PCR）實(shí)時(shí)熒光定量PCR巢式PCR也叫套式引物PCR，由于擴(kuò)增過程中用了兩對(duì)具有嵌套形式的引物而得名。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的幾種方法介紹實(shí)時(shí)熒光定量PCR在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法定義實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理之實(shí)時(shí)原理

對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析無(wú)法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無(wú)法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)。

利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析。常規(guī)

PCR技術(shù)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理之定量原理通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析擴(kuò)增曲線？熒光閾值？Ct值？原理之定量原理

擴(kuò)增曲線圖：

橫坐標(biāo)：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Cycle）；

縱坐標(biāo)：熒光強(qiáng)度

每個(gè)循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號(hào)的收集熒光基團(tuán)熒光檢測(cè)元件熒光信號(hào)閾值（threshold）：前15個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信號(hào)（baseline），即樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光值熒光域值的缺省設(shè)置是3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍

手動(dòng)設(shè)置：原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光最高值，同時(shí)要盡量選擇進(jìn)入指數(shù)期的最初階段，并且保證回歸系數(shù)大于0.99。真正的信號(hào):熒光信號(hào)超過域值原理之定量原理C