Theextractionand

endonucleasecleavageofplasmid

質粒的提取和酶切鑒定

huangchunhong

掌握質粒DNA提取的原理與方法

了解DNA限制性核酸內切酶酶切鑒定原理

質粒為環狀雙鏈DNA，它是染色體DNA之外的單獨復制單元。質粒一般存在于細菌細胞中，并常用于DNA重組，用于外源基因的克隆和表達。質粒的分類與構成克隆載體；表達載體原核質粒；真核質粒質粒的構成-復制起始位點-多克隆位點（含多個內切酶位點，用于外源基因插入）-選擇性標記（抗性基因）

1.氨芐青霉素抗性，新霉素抗性。2.多克隆位點C端含有myc表位標簽和His6標簽。Myc標簽和His6標簽與外源蛋白融合表達，可以用以親和層析分離和westernblot3.Pcmv巨細胞皰疹病毒啟動子4.BGHpA,牛生長因子polyA5.SV40猴空泡病毒SV40pA猴空泡病毒polyA7.核糖體結合位點：5300-5304bp6.pUCori復制起始位點f1ori噬菌體復制位點，能產生單鏈DNA，可用于測序

T7啟動子，比大腸桿菌RNA聚合酶啟動子強5倍pCDNA3.1/myc-His-IFT57重組質粒:6475bppCDNA3.1/myc-His：5497bp(講義上錯誤)IFT57基因（intraflagellartransport57，鞭毛內運輸蛋白)：1270bp酶切位點：BamHI:G^GATCC920bpEcoRI:G^AATTC941bp質粒提取：堿裂解法

基于染色體DNA與質粒DNA的變性與復性的差異而達到分離目的。染色體DNA：氫鍵斷裂變性。質粒DNA：大部分氫鍵斷裂，但超螺旋共價閉合環狀的兩條互補鏈不會完全分離。（不完全變性）質粒DNA：復性，溶于溶液中染色體DNA：不能復性；形成纏連的網狀結構。pH=12.6（堿性）

NaAc溶液（pH4.8）pH=中性染色體DNA與不穩定的大分子RNA、蛋白質-SDS復合物等一起沉淀下來離心溶菌酶可破壞菌體細胞壁，十二烷基硫酸鈉（Sodiumdodecylsulfate,SDS）可使細胞壁裂解。細菌經溶菌酶和陰離子去污劑（SDS）處理后，細菌DNA纏繞附著在細胞壁碎片上，離心時易被沉淀出來，而質粒DNA則留在上清液中。再經酒精沉淀、洗滌處理，可得到質粒DNA。提取的質?？捎腥N結構：線形、開環、閉環超螺旋。溶液Ⅰ—溶菌液：50mM葡萄糖，25mMTris-Cl(pH8.0)，10mMEDTA，2mg/ml溶菌酶。溶液Ⅱ—NaOH-SDS液：0.2NNaOH，1%SDS。溶液Ⅲ—3mol/LNaAc（pH4.8）溶液：5MKAC10ml，冰醋酸11.5ml，水28.5ml。質粒抽提：即去除RNA，將質粒與細菌基因組DNA分開，去除蛋白質及其它雜質，以得到相對純凈的質粒。如何去除RNA

使用RNase消化(抽提中或者抽提后)。經過RNase消化后，RNA變得比較小了，其殘留對酶切反應幾乎沒有影響。Theprinciplesofplasmidextraction如何將質粒與細菌基因組DNA分開

利用NaOH/SDS完全裂解細菌，讓質粒和細菌基因組DNA都從細菌中出來，再利用質粒和基因組DNA在變性/復性過程中的不同表現，將質粒與基因組DNA分開。去除蛋白質及其它雜質

基本上是與去除細菌基因組同時實現的。但是，依據不同的細菌，不同的培養條件，以及操作時的精細程度等，雜質的殘留量會不同。所以，通常需要使用苯酚做更進一步的純化。提取步驟10000g離心1min1.5ml菌液重復3次沉淀250ulP1吹打250ulP2350ulP3溶液清亮粘稠白色沉淀12000g離心10min上清500ul平衡液BL12000g離心1minCP3柱600ulPW12000g離心1min重復1次PWCP3柱開蓋2-5min50ulEB靜置2min12000g離心2minpcDNA3.1/myc-His質粒的提?。A先過夜搖好菌液）1、吸取1.5ml過夜培養的細菌于Ep管中，10,000rpm離心1分鐘，小心吸棄上清重復兩次操作，共獲得4.5ml過夜培養的細菌。2、加入250ul溶液P1（含RNaseA）于Ep管中，移液槍吹打懸浮細菌。3、加入250ul溶液P2，溫和地上下翻轉混合6次（2-5分鐘）。4、加入350ul溶液P3，輕輕混合6次，室溫靜置2分鐘。5、12,000rpm離心10分鐘，小心吸取上清加入吸附柱中。(可選步驟：吸附柱實驗前加500ulBL平衡液，12,000rpm離心1分鐘后倒棄收集管內液體)pcDNA3.1/myc-His質粒的提?。A先過夜搖好菌液）6、12,000rpm離心1分鐘，棄流出液。7、加入600ul溶液PW，12,000rpm離心1分鐘，棄流出液。(重復1次)8、12,000rpm離心2分鐘，徹底去除殘留的PW。9、將吸附柱置于一干凈的1.5mlEp管中，在柱的中央加入30-50ulEB（pH>7.0），室溫靜置1分鐘。（EB在60-70℃水浴預熱，使用效果更好10、10,000rpm離心1分鐘，洗脫質粒DNA待用。TheconcentrationandpurityofPlasmidPlasmid/dsDNA:1OD260=50ug/ml

100%DNA:OD260/OD280=1.8100%RNA:OD260/OD280=2.0Question:

OD260/OD280<1.8?OD260/OD280>1.8?DL5KbMarkerABCA:cleavageplasmid5000bp3000bp2000bp1500bp1000bp750bpPlasmidconformationvariationleadstodifferentmigrationB:linearplasmidC:superhelixplasmid反應物

體積（μl)bufferMC2質粒DNA15.8(μl)BamHI1EcoRI1BSA0.2在一個潔凈的0.2ml離心管中混勻下列反應物：

混合后37℃水浴1h質粒DNA的酶切分析操作三

、瓊脂糖凝膠電泳膠濃度（％）線性DNA分子大小（kb）0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.4～61.50.2～42.00.1～3本次電泳使用1.0%瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠濃度與DNA分子的有效分離范圍MarkerABCD6000bp5000bp2000bp1000bp750bp

AgarosegelelectrophoresisidentificationBamHIEcoRIpcDNA3.1/myc-HisA5.5kbInsertfragment:1270bp瓊脂糖凝膠電泳上樣1：DNAMarker（10

l）2：提取的質粒DNA（10

l）3：質粒DNA酶切產物（20

l）+-1234每組上2個樣品LoadingBuffer

上樣緩沖液EDTA甘油……………增大溶液密度溴酚藍…………指示劑二甲苯胺藍……指示劑組成0.5TBE,