遺傳學第五章基因組基因組：單倍體細胞中所含的整套染色體。

基因組：單倍體細胞中所含的整套染色體所包含的DNA分子以及DNA分子所攜帶的全部遺傳指令。人類基因組：22條常染色體和X、Y染色體的DNA組成。

基因組第2頁,共51頁，2024年2月25日，星期天

生物體單倍體DNA總量稱為C值。

C值最大最小相差10萬倍。

C值同生物進化是什么關系？一、C值悖論和序列復雜性§1、

C值悖理（C-valueparadox）第一節基因組DNA序列組成第3頁,共51頁，2024年2月25日，星期天基因組大小

種類Mb大腸桿菌4.64啤酒酵母12.1線蟲100.0果蠅140.0蝗蟲5000.0小鼠3300.0豌豆4800.0玉米5000.0小麥17000.0

人3000.0

第4頁,共51頁，2024年2月25日，星期天霉菌藻類G+細菌G-細菌顯花植物鳥類哺乳類爬行類兩棲類硬骨魚類軟骨魚類賴皮類甲殼類昆蟲類軟體動物蠕蟲類真菌枝原體A生物體進化程度高低與大C值不成明顯正相關B親緣關系相近的生物大C值相差較大C同一類生物內大C值與小c值相差極大（Euk.人體c=C/10）

(Prok.Φx174c＞C)

第5頁,共51頁，2024年2月25日，星期天

在同一類生物中，不同種的基因組大小也有很大差別。C值悖理，從總體上說，生物基因組的大小同生物在進化上所處的地位高低無關，這種現象稱為C值悖論。第6頁,共51頁，2024年2月25日，星期天§2、序列復雜性在同一類生物中，不同種的基因組大小懸殊差別。主要差別在于“多余”（excess）DNA的量的差別。“多余”DNA量多，則基因組大；“多余”DNA量少，則基因組小。“多余”DNA主要是重復序列。序列復雜性:不同序列的總長度稱為序列復雜性,用bp表示。

140bp:(1)20bp,30bp,40bp,50bp20+30+40+50=140bp(2)70bp(2個拷貝)70=70bp序列復雜性高低反映了序列包含的遺傳信息量的大小。生物體基因組的復雜程度還表現在基因的外顯子數目的多寡。第7頁,共51頁，2024年2月25日，星期天二、基因組DNA序列的分類1、編碼序列和非編碼序

編碼序列：編碼RNA和蛋白質的DNA序列。非編碼序：內含子和基因的間隔序列。2、單一序列和重復序列

單一序列：基因組中只有一份的DNA序列。重復序列：基因組中重復出現的序列。如STR,微衛星DNA等第8頁,共51頁，2024年2月25日，星期天重復序列高度重復序列。幾百---幾百萬個拷貝。Alufamily輕度重復序列。2—10個拷貝。中度重復序列。10—幾百個拷貝。rDNA、tDNA原核生物基因組幾乎不含重復序列；低等真核生物基因組中，中度重復和高度重復序列不超過20%；動物細胞基因組中，中度重復和高度重復序列約占50%；顯花植物和兩棲動物基因組中，中度重復和高度重復序列幾乎可達80%重復序列第9頁,共51頁，2024年2月25日，星期天三、DNA復性動力學●

D.S.DNAS.S.DNA

(加溫,極端pH)

▼Renaturation

復性過程依賴于單鏈分子間的隨機碰撞

(DependsonthecollisionofcomplementaryS.S.DNA)

第10頁,共51頁，2024年2月25日，星期天影響復性的因素：真核生物：第1組分（25%），快，高度重復序列；第2組分（30%），中，中度重復序列；第3組分（45%），慢，單一或少拷貝；

溫度時間離子強度

DNA片段大小

DNA序列復雜性

DNA分子濃度第11頁,共51頁，2024年2月25日，星期天四、重復序列家族重復序列家族:是指一類核苷酸序列高度相似的重復序列，這些重復序列包括基因和基因以外的序列。基因家族:真核生物基因組中來源相同，結構相似、功能相關的一組基因可歸為一個基因家族。基因家族可歸入重復序列家族，但不是其主要組成，主要組成基因以外的序列。第12頁,共51頁，2024年2月25日，星期天散在重復序列散在重復序列：散在的方式分布于基因組內的重復序列。

短散在重復序列（SINEs）,500bp長散在重復序列（LINEs）,1000bpAlu序列家族：人類50-70萬拷貝；人和靈長類基因標志。多聚（dT-dG）家族：10萬拷貝第13頁,共51頁，2024年2月25日，星期天基因組學結構基因組學功能基因組學基因和基因組的結構各種元件的序列特征基因作圖和基因定位不同序列結構具有不同功能基因表達的調控基因與環境相互作用轉錄物組學蛋白質組學表型組學第二節基因組研究第14頁,共51頁，2024年2月25日，星期天一、人類基因組研究1986[美]Dulbecco首次提出了“人類基因組工程”1990.4月美國宣布人類基因組測序工作的5年計劃。2001.1.12中、美、日、德、法、英等國科學家（Nature,15日)和美國塞萊拉公司(Science,16日)各自公布人類基因組圖譜和初步分析結果。約3萬基因。我國參與研究的第3號染色體，共計3000萬個堿基對，約占人類基因組全部序列1%（1999.9月加入這一研究計劃）。第15頁,共51頁，2024年2月25日，星期天1、遺傳圖：遺傳圖以染色體上某一點為遺傳標記，以與之相伴遺傳的特征為對象，通過計算連鎖的遺傳標志之間的重組頻率，確定它們的相對距離(單位：cM,厘摩)；2、物理圖：以特定的DNA序列為標界，將各種標記直接定位在基因庫中的某一點上。物理圖上標界之間的距離以物理長度來表示，即以核苷酸對的數目來表示（單位：bp,kb）；3、序列圖：核苷酸組成的基因組全部DNA序列。4、基因圖：測定這些可表達片段（EST）的標記圖。人類基因組框架圖第16頁,共51頁，2024年2月25日，星期天人類基因組計劃（HGP）遺傳圖物理圖序列圖基因圖基因定位

基因克隆

基因轉移

比較基因組研究物種的起源與進化基因的證實與克隆生物學的發展水稻等作物基因組計劃豬，牛等家畜基因組計劃第17頁,共51頁，2024年2月25日，星期天二、基因定位和作圖§1、基因標記和作圖界標基因標記：利用可鑒別的形態、生化等表型性狀作標記。如：血型、蛋白質氨基酸、等位基因等圖譜標記：可用基因或DNA作為可鑒別的標記(marker)。基因標記和DNA的分子標記。分子標記：特定DNA序列構建遺傳圖譜的標記。

每種生物DNA具有穩定性。第18頁,共51頁，2024年2月25日，星期天

（1）RFLPrestrictfragmentlengthpolymorphism限制性片段長度多態性（2）SSLPsimplesequencelengthpolymorphism簡單序列長度多態性

（3）SNPsinglenucleotidepolymorphism

單核苷酸多態性

（4）STS/EST非多態的短單一序列作為標界DNA的分子標記RAPDrandomamplifiedpolymorphismDNA隨機擴增多態性AFLP

amplifiedfragmentlengthpolymorphism

擴增片段長度多態性第19頁,共51頁，2024年2月25日，星期天如一對同源染色體二個DNA分子，一個具有某種酶的酶切位點，另一個無此位點

酶切后形成的DNA片段長度就會有差異，即多態性(RFLP)

根據該等位基因的遺傳，將RFLP作為標記定位在基因組的某一位置上。限制性內切酶多態性:限制性內切酶能識別和切割特異核苷酸序列，DNA序列能或不能被某一酶酶切，實際上相當于一對等位基因的差異。（1）

RFLP限制性片段長度多態性第20頁,共51頁，2024年2月25日，星期天（2）

簡單序列長度多態性(simplesequencelengthpolymor-phisms,SSLP)簡單序列長度多態性,又稱為VNTR

variablenumbertandemrepeat

數目可變的串聯重復多態性。指重復單位相對較小,由重復單位的序列差異和數目變化,可形成豐富的多態性。

包括:小衛星序列、微衛星序列。小衛星序列(microsatellite):又稱簡單重復序列(STRs)，常只有2~4個核苷酸重復單位。微衛星(minisatellite)也稱多次重復序列(VNTR)，重復序列長度為幾十個核苷酸。由于基因組中某一特定的微衛星的側翼序列通常都是保守性較強的單一序列，據串聯重復排列微衛星基序兩側的單一序列可以人工合成引物,對微衛星序列（microsatelliteDNA或simplesequencerepeats，SSR）進行擴增，從而將單個微衛星位點擴增出來,由微衛星基序重復數目的變異而產生多態性。第21頁,共51頁，2024年2月25日，星期天隨機擴增片段長度多態性DNA，簡稱RAPD技術，是由Williams和Welsh（1990）同時發展起來的一項新的遺傳標記技術。RAPD以PCR為基礎而又不同于經典的PCR，一般采用10個核苷酸的DNA序列為引物，擴增時退火溫度降至35℃左右。與其他標記相比,RAPD具有以下優點：①不依賴于種屬的特異性和基因組的結構，合成的一套引物可用于不同生物的分析。②操作簡單，可實現自動化，短期內可利用大量引物完成覆蓋的分析。③不需制備探針、雜交等程序，成本較低。④DNA用量少（10ngDNA即可完成一次分析）,允許快速、簡單地分離DNA。已在遺傳圖譜構建、種質資源分析、基因標記等方面得到了廣泛的應用。RAPD是一種顯性標記,分離群體中純合體和雜合體通過后代才能區別，并且由于該技術采用的是隨機引物擴增，擴增結果的穩定性較差，這在一定程度上限制了其發展。（3）隨機擴增片段長度多態性DNA（RandomAmplifiedPolymorphicDNA,RAPD

）第22頁,共51頁，2024年2月25日，星期天AFLP是指通過PCR擴增經限制性內切酶酶切后的基因組DNA模板產生顯示多態性的DNA片段。這一方法最初是在1992年由荷蘭一家私人公司提出的。其原理和步驟大致為：將基因組DNA用限制性內切酶酶切成片段，在DNA片段兩端連接上一段已知序列，再以該已知序列為基礎，加上2~3個隨機變化的核苷酸序列設計引物，進行PCR擴增和進一步檢測。AFLP技術是在RAPD技術基礎上，結合RFLP技術產生的。由于AFLP引物的特異性比RAPD的隨機引物強，從而克服了RAPD重復性差的問題，還可以通過增減引物的長度來控制PCR擴增帶型的復雜程度。這一方法的缺點是技術操作較為復雜、成本也較高。對基因組DNA進行雙酶切，形成分子量大小不同的隨機限制片段，再進行PCR擴增，根據擴增片段長度的多態性的比較分析，可用于構建遺傳圖譜、標定基因和雜種鑒定以輔助育種。

（4）擴增片段長度多態性分析

第23頁,共51頁，2024年2月25日，星期天DNA指紋圖譜第24頁,共51頁，2024年2月25日，星期天主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種。占所有已知多態性的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500～1000個堿基對中就有1個，估計其總數可達300萬個甚至更多。SNP所表現的多態性只涉及到單個堿基的變異，這種變異可由單個堿基的轉換（transition）或顛換（transversion）所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。但通常所說的SNP并不包括后兩種情況。

單核苷酸多態性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）氯吡格雷(抗凝藥)

第25頁,共51頁，2024年2月25日，星期天§2、基因定位(1)植物基因定位：借助基因標記和DNA的分子標記，可使基因定位在精度、深度、廣度等方面有極大的提高。已陸續在一些農作物上定位了許多重要農藝性狀和經濟性狀的基因，在復雜數量性狀位點(quantitativetraitloci，QTL)定位分析方面，也取得了很大進展。第26頁,共51頁，2024年2月25日，星期天

中斷雜交實驗(min)：

F+

×F–

Hfr×F–（2）細菌的基因定位第27頁,共51頁，2024年2月25日，星期天（3）人類家系分析定位

Y染色體X染色體常染色體：

第28頁,共51頁，2024年2月25日，星期天（4）原位雜交定位DNA或RNA分子探針

放射性標記分子雜交顯影/顯色基因定位第29頁,共51頁，2024年2月25日，星期天（1）酶切完全酶切部分酶切§3、序列圖作圖（1）酶切（2）疊連群建立（3）序列測定第30頁,共51頁，2024年2月25日，星期天（2）疊連群建立第31頁,共51頁，2024年2月25日，星期天（3）序列測定①DNA測定的酶法，②化學測序法③DNA自動測序第32頁,共51頁，2024年2月25日，星期天DNA測定的酶法：即Sanger法、終止法、雙脫氧法

DNA聚合酶，單鏈DNA模板，引物復性后分4份加4種dNTP（dATP、dGTP、dTTP和

dCTP），其中一種為α-32P標記各加一種雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）,3’

缺少一個羥基，故不能同后續的dNTP形成磷酸二酯鍵。經變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離制得的放射性自顯影區帶圖譜直接讀得DNA的堿基序列序列測定方法之一AGTTGCTA第33頁,共51頁，2024年2月25日，星期天化學測序法又稱Maxam-Gilbert法序列測定方法之二把待測序的DNA分子成單鏈分子，其5’端用32P進行放射性標記。分成4份，每份用一種化學試劑處理DNA片段，每種試劑可使DNA分子在一種堿基的5’端的磷酸二酯鍵處發生斷裂。使每個DNA分子只發生一次斷裂。把這4種反應產物用聚丙烯凝膠電泳進行分離，用X光膠片進行曝光，得到一張由不同條帶組成的序列圖。從圖上就可以讀出待測DNA片段的堿基序列。第34頁,共51頁，2024年2月25日，星期天序列測定方法之三DNA自動測序儀：根據Sanger法酶促原理

4種熒光染料標記引物激光照射閱讀4種顏色第35頁,共51頁，2024年2月25日，星期天GACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGTCGTCAGTCTTTAGTTGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGACTGGACCAGCAGTTAGAAAGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGTCGTCAGTCTTTAGTTGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGACTGGACCAGCAGTTAGAAAGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGTCGTCAGTCTTTAGTTGACCAGCAGTTAGAAATCAA1.部分酶切3.疊連群建立2.DNA測序CTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGACTGGACCAGCAGTTAGAAAGACCAGAGTTAGAAATCAACTGGTCGTCAGTCTTTAGTTGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGACTGGACCAGCACTGGACCAGCACTGGACCAGCACTGGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGTCGTCAGTCTTTAGTTGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGACTGGACCAGCAGTTAGAAAGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGTCGTCAGTCTTTAGTTGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGACTGGACCAGCAGTTAGAAAGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGTCGTCAGTCTTTAGTTGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGACTGGACCAGCAGTTAGAAAGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGTCGTCAGTCTTTAGTTGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCAACTGGACCAGCAGTTAGAAATCA第36頁,共51頁，2024年2月25日，星期天克隆:是英文Clone一詞的單譯，意為無性繁殖系，即通過無性繁殖（如細胞絲分裂）可連續傳代并形成的群體，常用于細胞水平的描述。克隆技術（Cloning）:則指由眾多的基因或細胞群體中通過無性繁殖和選擇獲得目的基因或細胞的技術操作。基因克隆:是指某種目的基因的分離過程，通常是將生物材料的遺傳物質如DNA以酶切成片斷，插入到載體中，通過無性繁殖（細菌或細胞的倍增）使其擴增，然后再以某種探針選擇、釣取目的基因。§2、基因克隆（Clone）基因克隆策略：1）功能克隆：

2）定位克隆；

第37頁,共51頁，2024年2月25日，星期天1）功能克隆克隆（致病）基因的一種策略。收集所要克隆的基因的蛋白質產物及其功能的信息，用以分離基因，并對基因進行定位。性狀（疾病）蛋白質產物（生物學功能）從氨基酸序列出發設計DNA引物，從文庫調取基因得到基因序列染色體定位疾病功能基因第38頁,共51頁，2024年2月25日，星期天血紅蛋白病——鐮刀形細胞貧血癥正常HbA四條多肽鏈（2條鏈，兩條鏈）第39頁,共51頁，2024年2月25日，星期天

2）定位克隆又稱為“逆向遺傳學”，始于20世紀80年代后期利用遺傳連鎖或細胞學定位技術將致病基因定位于染色體的特定區帶定位：通過連鎖分析找出與目的基因緊密連鎖的遺傳標記在染色體上的位置克隆：從定位的染色體區段內分離克隆所要的基因，并進一步研究其功能。疾病遺傳標記，染色體定位基因序列mRNAcDNA蛋白質產物生物學功能

疾病

基因功能第40頁,共51頁，2024年2月25日，星期天賀林實驗室利用布依族、苗族和漢族的三個A-1型短指（趾）癥大家系，對該病的致病基因進行了精確定位（位點定在2q35-36區）、克隆，并首次發現了人IHH基因和該基因上的三個突變位點是導致A-1型短指（趾）癥的直接原因。A-1型短指（趾）——癥位點定在2q35-36區第41頁,共51頁，2024年2月25日，星期天1）構建基因文庫：用DNA重組技術將某種生物的總DNA用特定的限制性內切酶切割成一個個片段，然后將這些片段隨機地連接在某些質粒或其他載體上，再將它們轉移到適當的宿主細胞中，通過細胞的增殖而構成各個片段的無性繁殖系（克隆），當這些克隆多到可以包括某種生物的全部基因時，這一批克隆的總體就稱為該種生物的基因文庫。cDNA文庫基因克隆具體方法：第42頁,共51頁，2024年2月25日，星期天2）篩選文庫：用放射性同位素或非放射性化學物質標記探針（待克隆的基因或cDNA的一段同源序列）同文庫的細菌克隆或噬菌斑作核酸分子雜交經放射自顯影或顯色反應后，可以篩選出含有同探針互補序列的細菌克隆或噬菌斑然后分析這些重組載體中所插入的DNA片段或cDNA最后分離出所要的基因或cDNA。

第43頁,共51頁，2024年2月25日，星期天3）染色體步移知道距該基因一定距離上的一段DNA序列用該DNA序列作探針,篩查文庫,得到陽性克隆分離出來重組載體中的插入片段用這個片段的末端部分作探針再一輪篩查文庫得到新的重組載體中的插入片段再用新得的插入片段的末端部分作為探針，再去篩查文庫通過一系列的操作，得到的插入片段逐漸連接延伸，最后可以步移到待克隆的基因第44頁,共51頁，2024年2月25日，星期天4）電子雜交ESTexpressedsequencetag,EST表達序列標簽，短的、