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文檔簡介
關于動物肝臟提取和鑒定實驗技術核酸的分類
DNA(脫氧核糖核酸)
主要存在于細胞核的染色體中。核外也有少量DNA,如線粒體DNA(mtDNA),葉綠體DNA(cpDNA),質粒DNA。
RNA(核糖核酸)
存在于細胞質中,如mRNA,rRNA,tRNA等。
除上述DNA,RNA外,還有非細胞形式存在的病毒和噬菌體,其或只含DNA,或只含有RNA。第2頁,共22頁,2024年2月25日,星期天核酸的理化性質在細胞內通常與蛋白質結合,以復合物形式存在微溶于水,不溶于乙醇,氯仿等有機溶劑在酸性溶液中容易降解,在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。DNA溶液粘度很大,RNA的粘度較小在強大離心力的作用下,可以從溶液中沉降下來第3頁,共22頁,2024年2月25日,星期天
濃鹽法:利用RNA和DNA在不同鹽濃度溶液中的溶解度不同將二者分離。離子去污劑法:利用SDS、CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)等去污劑使蛋白質變性,直接從生物材料中提取DNA。
苯酚抽提法:苯酚既是蛋白變性劑,又能抑制DNase的降解。用苯酚處理勻漿液時,由于蛋白與DNA連接鍵已斷,蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相,而DNA溶于水相。基因組DNA的提取方法第4頁,共22頁,2024年2月25日,星期天
核酸制備中常用的去垢劑
核酸本身帶負電荷,結合帶正電荷的蛋白質。用于核酸提取的去垢劑,一般都是陰離子去垢劑。
去垢劑的作用:
1.溶解膜蛋白及脂肪,使細胞膜破裂;
2.溶解核糖體上面的蛋白質,使其解聚,將核酸釋放出來;
3.對RNase、DNase有一定的抑制作用。如:SDS、脫氧膽酸鈉、4-氨基水楊酸鈉、萘-1.5-二磺酸鈉、三異丙基萘磺酸鈉第5頁,共22頁,2024年2月25日,星期天
作用:
1.使蛋白質變性、沉淀,從核酸提取液中分離除去,以防造成蛋白污染。
2.某些蛋白質變性劑也有抑制RNase活性和破裂細胞的作用。
如:苯酚、氯仿、鹽酸胍、DEPC核酸制備中常用的蛋白質變性劑第6頁,共22頁,2024年2月25日,星期天核酸制備中常用的酶
DNase:降解DNA
RNase:降解RNA
蛋白酶K:降解蛋白質溶菌酶:破碎細胞
第7頁,共22頁,2024年2月25日,星期天核酸提取的主要步驟沉淀核酸,去除鹽類,有機溶劑等雜質除去與核酸結合的蛋白質以及多糖、脂類等生物大分子:酚/氯仿抽提、蛋白變性劑(SDS、異硫氰酸胍等)、蛋白酶處理、高鹽洗滌除去其它不需要的核酸分子破碎細胞:研磨、組織勻漿、超聲、凍融;異硫氰酸胍、堿裂解;酶解(溶菌酶)第8頁,共22頁,2024年2月25日,星期天注意事項加入RNA降解酶除RNA加入DNA酶抑制劑:檸檬酸、氰化物、砷酸鹽、EDTA、SDS、苯酚等蛋白變性劑反應不宜過于劇烈避免過酸、過堿及高溫第9頁,共22頁,2024年2月25日,星期天一、實驗目的:1、學習并掌握用濃鹽法從動物組織中的提取DNA方法及其原理。2、學習和掌握二苯胺法測定DNA的原理和方法。第10頁,共22頁,2024年2月25日,星期天二、實驗原理
核酸在真核細胞中都是以與蛋白質結合的狀態(tài)存在,用DNP和RNP表示。
DNA-Pro(DNP)細胞核RNA-Pro(RNP)核仁及細胞質溶于高鹽溶液(1mol/L),微溶于低鹽溶液(0.14mol/L)溶于低鹽溶液(0.14mol/L)微溶于高鹽溶液(1mol/L)第11頁,共22頁,2024年2月25日,星期天
核酸含量的測定方法:紫外吸收法、定磷法和分別針對DNA和RNA的顏色反應方法。
脫氧核糖核酸中的脫氧核糖在酸性環(huán)境中變成ω-羥基-γ-酮基戊醛與二苯胺試劑一起加熱產生藍色化合物,在595nm處有最大的吸收。
DNA20~400微克范圍內,光密度與DNA的濃度成正比,在反應液中加入少量乙醛,可以提高反應的靈敏度。
第12頁,共22頁,2024年2月25日,星期天三、實驗試劑95%冷乙醇、NaCl固體二苯胺:稱取純二苯胺1g溶于100ml冰醋酸中,加入10ml過氯酸,混勻。臨用時加1ml1.6%乙醛溶液,所配置試劑應為無色。0.14mol/LNaCl-0.05mol/L檸檬酸鈉緩沖液(PH=6.8)DNA標準液200ug/ml:DNA鈉鹽用5mmol/L的NaOH配制。氯仿/異戊醇=20:1(V/V)5%SDS第13頁,共22頁,2024年2月25日,星期天組織搗碎勻漿機
第14頁,共22頁,2024年2月25日,星期天豬肝8g勻漿16ml的0.14mol/LNaCl-0.05mol/L
檸檬酸鈉緩沖液離心,4000r/min,10min上清(棄掉)沉淀沉淀25ml緩沖液洗滌離心,4000r/min,20min上清(棄掉)40ml的0.14mol/LNaCl-0.05mol/L
檸檬酸鈉緩沖液沉淀21ml氯仿/異戊醇4ml5%SDS振蕩30min(保鮮膜封口)加入3.6gNaCl固體,終濃度為1mol/L離心,3500r/min,20min吸取上清(量取體積)95%冷乙醇(緩慢加入)邊加邊朝一個方向緩慢攪動DNA粗制品第15頁,共22頁,2024年2月25日,星期天第16頁,共22頁,2024年2月25日,星期天除去蛋白質的方法
SDS(十二烷基硫酸鈉)等去污劑使蛋白質變性,可以直接從生物材料中提取DNA防止DNA酶的降解,提取時可加入適量EDTA(乙二胺四乙酸)、檸檬酸,以降低DNA酶的活性氯仿一異成醇使蛋白質變性,離心除去變性蛋白質第17頁,共22頁,2024年2月25日,星期天DNA的定量測定第18頁,共22頁,2024年2月25日,星期天DNA粗品用5mmol/LNaOH溶解并定容至50ml,作為待測品。混勻,60℃水浴保溫45min,冷卻后,595nm處,比色。第19頁,共22頁,2024年2月25日,星期天以吸光度A595nm對DNA含量(ug)作圖,繪制標準曲線。從標準曲線上查出樣品的DNA含量。計算100g豬肝中DNA的含量:
待測樣品中DNA的質量×25(稀釋倍數(shù))稱取豬肝的質量=第20頁,共22頁,2024年2月25日,星期天勻漿(破碎細胞)要充分,需剪成小塊。固體NaCl應磨碎,加入應分批緩慢加入,邊加邊搖,避免局部濃度過大或者未及溶解而沉入氯仿
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