ICS07.080

A20/39

中華人民共和國國家標準

GB/TXXXXX—201X

生物產品中光合細菌測定

Determinationofphotosyntheticbacteriainbiologicproducts

（征求意見稿）

201X-XX-XX發布201X-XX-XX實施

國家市場監督管理總局

發布

中國國家標準化管理委員會

1

GB/T××××—201×

I

GB/T××××—201×

生物產品中光合細菌測定

1范圍

本標準規定了生物產品中光合細菌生化測定和MNP標記測定原理、試劑與材料、儀器與設備、操

作步驟及結果分析。

本標準適用于生物產品中一種或多種紅螺菌科光合細菌的測定。

2規范性引用文件

下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本適應于本標準。

GB4789.1食品安全國際標準食品微生物學檢驗總則

GB4789.28食品微生物學檢驗培養基和試劑的質量要求

GB19489實驗室生物安全通用安全

GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法

GB/T27405實驗室質量控制規范食品微生物檢測

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1

生物產品biologicproducts

利用生物技術獲得的產品。

3.2

光合細菌photosyntheticbacteria

一類能利用多種基質，可營異養、自養或兼性營養的原核生物。

注：屬于細菌門真細菌綱紅螺菌目，包括紅螺菌科（Rhodospirillaceae）、著色菌科（Chromatiaceae）、綠硫菌

科（Chlorobiaceae）、綠色絲狀菌科（Chloroflexaceae）等4科。

3.3

單核苷酸多態性singlenucleotidepolymorphism，SNP

在基因組水平上由單個核苷酸引起的序列多態性。

1

GB/T××××—201×

3.4

多核苷酸多態性multiplenucleotidepolymorphism，MNP

一段核苷酸區域內多個核苷酸引起的序列多態性。

3.5

覆蓋倍數averagecoverageofmarkers

檢測到的標記的測序片段的數目。

3.6

檢出標記detectedmarkers

覆蓋倍數大于50的標記。

第一法培養法

4原理

將待分離的樣品進行稀釋后，接種于選擇性培養基中，由單個細胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落。

隨機挑取平板中的5個菌落進行生理生化鑒定，根據平板的菌落數及挑取菌落的生理生化鑒定結果，對

生物產品中的光合細菌進行計數。

5試劑和材料

本方法所用試劑均為分析純，除特殊說明外，實驗用水均為GB/T6882規定的二級水。

5.1AT培養基：參見附錄A。

5.2光合細菌分離瓊脂：參見附錄A。

5.3磷酸鹽緩沖稀釋液：參見附錄A。

5.4革蘭氏染色液：參見附錄A。

6設備和器具

6.1光照恒溫培養箱：照度不小于2000lx。

6.2天平：精度為0.001g。

6.3真空過濾裝置。

6.4水相濾膜：微孔徑0.45μm。

6.5微需氧培養罐：能維持1%氧濃度的透明培養容器裝置。

6.6微量移液器。

6.7顯微鏡：最低100×。

7操作步驟

2

GB/T××××—201×

7.1樣品的稀釋

7.1.1固體樣品：稱取25g樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液的無菌均質杯內，8000r/min～10000r/min

均質1min～2min，或放入盛有225mL稀釋液的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1min～2min，

制成1:10的樣品勻液。

7.1.2液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液的無菌錐形瓶（瓶內預置適

當數量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。

7.1.3用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩沖注入盛有9mL稀釋液的無

菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支無菌吸管反復吹打使其混合

均勻，制成1:100樣品勻液。

7.1.4按6.1.3操作，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1mL無菌吸管或吸頭。

7.1.5根據對樣品中光合細菌數量的估計，選擇2個～3個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原

液），在進行10倍遞增稀釋時，吸取1mL樣品勻液于無菌平皿內，每個稀釋度做兩個平皿。同時，分

別吸取1mL空白稀釋液加入兩個無菌平皿內作空白對照。

7.1.6及時將15mL～20mL冷卻至46℃的光合細菌分離瓊脂培養基傾注平皿，并轉動平皿使其混合

均勻。

7.2培養

待瓊脂凝固后，將平皿翻轉，將其置于微需氧培養罐中30℃±1℃光照培養5d。

7.3菌落計數

7.3.1可用肉眼觀察，必要時用放大鏡或菌落計數器，記錄稀釋倍數和相應的菌落數量。菌落計數以菌

落形成單位（colony-formingunits,CFU）表示。

7.3.2選取菌落數在30～300之間、無蔓延菌落生長的平板計數菌落總數。低于30CFU的平板記錄具

體菌落數，大于300CFU的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數應采用兩個平板的平均數。

7.3.3其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度

的菌落數；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘以2，

代表一個平板菌落數。

7.3.4當平板上出現菌落間無明顯界線的鏈狀生長時，則將每條單鏈作為一個菌落計數。

3

GB/T××××—201×

7.4光合細菌的鑒定

7.4.1菌落挑選和純培養

挑取計數平板上5個菌落大、紅色、表面光滑、質地柔軟、邊緣整齊的菌落分別接種于光合細菌分

離瓊脂平板，置微需氧培養罐中，30℃±1℃光照培養2～3d。

7.4.2形態學鑒定

挑取斜面上的純培養物，進行染色鏡檢，光合細菌紅螺菌科中各屬的形態特征見附錄B.1。

7.4.3生化鑒定

使用細菌生化鑒定試劑盒進行生化鑒定。紅螺菌科中代表屬種的生理生化鑒定特征見附錄B.2-B.6。

7.5結果計算

7.5.1光合細菌菌落的計算見公式（1）：

b

aC??????????????????????????????????????公式（1）

A

式中：

a——每塊平板上的某種特定光合細菌菌落數；

b——挑取后經證實為某種特定光合細菌的菌落數；

A——挑取平板上用于驗證的菌落數；

C——平板上的所有特征菌落數。

7.5.2菌落總數的計算方法

7.5.2.1若只有一個稀釋度平板上的菌落數在適宜計數范圍內，計算兩個平板菌落數的平均值，再將平

均值乘以相應稀釋倍數，作為每g（mL）樣品中菌落總數結果。

7.5.2.2若有兩個連續稀釋度的平板菌落數在適宜計數范圍內時，按式（2）計算：

Ca

N····························（2）

n0.1nd5

12

式中：

N——樣品中某一種光合細菌的活菌數

C——平板（含適宜范圍菌落數的平板）菌落數之和；

n1——第一稀釋度（低稀釋倍數）平板個數；

n2——第二稀釋度（高稀釋倍數）平板個數；

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GB/T××××—201×

d——稀釋因子（第一稀釋度）；

a——7.4鑒定結果中某一種光合細菌的陽性數；

5——每個計數平板中挑出的5個菌落數；

7.5.2.3若所有稀釋度的平板上菌落數均大于300CFU，則對稀釋度最高的平板進行計數，其他平板可

記錄為多不可計，結果按平均菌落數乘以最高稀釋倍數計算。

7.5.2.4若所有稀釋度的平板菌落數均小于30CFU，則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數

計算。

7.5.2.4若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數計算。

7.5.2.5若所有稀釋度的平板菌落數均不在30~300CFU之間，其中一部分小于30CFU或大于

300CFU時，則以最接近30CFU或300CFU的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。

7.6菌落總數報告

7.6.1菌落數小于100CFU時，按“四舍五入”原則修約，以整數報告。

7.6.2菌落數大于或等于100CFU時，第3位數字采用“四舍五入”原則修約后，取前2位數字，后面用

0代替位數；也可用10的指數形式來表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數字。

7.6.3若所有平板上為蔓延菌落而無法計數，則報告菌落蔓延。

7.6.4若空白對照上有菌落生長，則此次檢測結果無效。

7.6.5稱重取樣以CFU/g為單位報告，體積取樣以CFU/mL為單位報告。

第二法MNP標記法

8原理

利用多重PCR和二代高通量測序擴增并檢測樣品的中MNP標記位點，利用生物信息學軟件分析

測序產物，得出鑒定結果。

9試劑與材料

本方法所用試劑均為分析純，除特殊說明外，實驗用水均為GB/T6882規定的一級水。

9.1多重PCR擴增與文庫構建試劑盒。

9.2高通量測序試劑盒。

9.3引物：見附錄C

10儀器與設備

10.1PCR擴增儀。

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GB/T××××—201×

10.2離心機，轉速可達12000rpm以上。

10.3電泳儀。

10.4凝膠成像儀。

10.5超微量分光光度計。

10.6實時定量PCR儀。

10.7高通量測序儀。

11操作步驟

11.1樣品要求

樣品在檢測前應充分混勻，取少量樣品進行總DNA的提取。

11.2樣品DNA提取

提取與純化的DNA溶液在260nm與230nm處的吸光度值的比值大于2.0；在260nm與280nm處的吸

光度值的比值介于1.7與1.9之間；DNA電泳主帶明顯，無明顯降解；無明顯RNA殘留。

11.3多重PCR擴增與文庫構建

按多重PCR擴增與文庫構建試劑盒的說明書進行DNA質控、多重PCR擴增、文庫構建與純化，且多

重PCR的擴增循環數不高于20個。

11.4高通量測序

按高通量測序試劑盒和高通量測序儀的操作說明進行高通量測序與測序質控。

高通量測序的平均覆蓋倍數設置為700倍以上，測序長度大于標記引物在參考基因組上的擴增長度。

12實驗數據質量控制

利用光合細菌鑒定軟件將樣品的測序數據比對到參考基因組的標記位點上，統計標記位點的平均覆

蓋倍數。

當C1時，判定樣品的測序數據量不足，從11.4或之前的步驟開始重新實驗。

當C1<500時，判定測序數據合格。

13結果C判1≥定500

利用光合細菌鑒定軟件統計光合細菌的檢出標記的數目N，并輸出判定結論。

若，判定結論為“待測樣品中不存在該光合細菌”；

若N=0或，判定結論為“待測樣品中可能存在該光合細菌”

若N=1，判N=定2結論為“待測樣品中存在該光合細菌”。

對于N≥判定3結論為“待測樣品中可能存在該光合細菌”的樣品，可采用本標準第一法進行鑒定。

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GB/T××××—201×

14防污染措施

樣品準備、核酸提取、多重PCR擴增與高通量測序在規定的區域按單一方向進行操作且保持實驗室

通風良好。不同區域的儀器和設備應專用。

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GB/T××××—201×

附錄A

（資料性附錄）

培養基

A.1AT培養基

A.1.1基礎培養基成分

乙酸鈉3.0g

碳酸氫鈉1.0g

酵母膏2.0g

磷酸氫二鉀0.5g

氯化銨1.0g

氯化鎂0.2g

氯化鈉5.0g

乙二胺四乙酸鐵鈉1.0mL

蒸餾水1000mL

A.1.2微量元素添加液

A.1.2.1成分

氯化鐵1.8g

氯化鈷250mg

氯化鎳10mg

氯化銅10mg

氯化錳70mg

氯化鋅100mg

硼酸500mg

鉬酸鈉30mg

亞硒酸鈉10mg

A.1.2.2制法

上述鹽分別溶解到約900mL水中，用1mol/L的鹽酸調節pH為2～3，定容至1L。

A.1.3維生素添加液

A.1.3.1成分

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對-氨基苯甲酸20mg

生物素10mg

蒸餾水100mL

A.1.3.2制法

經0.22μm濾膜過濾，保存在無菌容器中，冷藏保存。

A.1.4抗壞血酸添加液

A.1.4.1成分

抗壞血酸5.0g

蒸餾水100mL

A.1.4.2制法

經0.22μm濾膜過濾，保存在無菌容器中，冷藏避光保存。

A.1.4.3制法

臨用前，1000mLA.1.1基礎液中添加1mLA.1.2微量元素添加液、1mLA.1.3維生素添加液和10mL

A.1.4抗壞血酸添加液，調節pH6.9±0.1，培養基經0.45μm濾膜過濾，分裝到13mL滅菌螺口試管中，每

管裝液12mL。加入

A.1.5不同碳源AT培養基

將A1.1基礎液中乙酸鈉換為其他所需碳源，其他成分及制法同A1.4.3

A.2光合細菌分離瓊脂

A.2.1基礎培養基

A.2.1.1成分

乙酸鈉3.0g

碳酸氫鈉1.0g

酵母膏2.0g

磷酸氫二鉀0.5g

氯化銨1.0g

氯化鎂0.2g

氯化鈉5.0g

乙二胺四乙酸鐵鈉1.0mL

瓊脂粉10g

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蒸餾水1000mL

A.2.1.2制法

除瓊脂外，將其余成分溶解于蒸餾水中，pH6.9，加入瓊脂，加熱溶解，定量分裝適宜容器，121℃

高壓滅菌15min。

A.2.2乙二胺四乙酸鐵鈉溶解

硫酸亞鐵557mg

乙二胺四乙酸二鈉鹽745mg

蒸餾水100mL

A.2.3光合細菌分離瓊脂制法

臨用前，將A.2.1基礎培養基融化，保溫于46℃水浴，1000mLA.2.1基礎培養基中加入5mLA.1.4

抗壞血酸添加液。搖勻后備用。

A.3磷酸鹽緩沖稀釋液

A.3.1貯存液

A.3.1.1成分

磷酸二氫鉀34.0g

蒸餾水500mL

A.3.1.2制法

用大約175mL的1mol/L氫氧化鉀溶液調節pH至7.2，用蒸餾水稀釋至1000mL后貯存于冰箱中。

A.3.2稀釋液

用蒸餾水稀釋1.25mL貯存液至1000mL，分裝于適宜容器中，121℃高壓滅菌15min。

A.4革蘭氏染色法

A.4.1結晶紫染色液

A.4.1.1成分

結晶紫1.0g

95%乙醇20mL

1%草酸銨水溶液80mL

A.4.1.2制法

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GB/T××××—201×

將結晶紫完全溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。

A.4.2革蘭氏碘液

A.4.2.1成分

碘1.0g

碘化鉀2.0g

蒸餾水300mL

A.4.2.2制法

將碘與碘化鉀先行混合，加入蒸餾水少許充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300mL。

A.4.3復染液

A.4.3.1成分

沙黃0.25g

95%乙醇10mL

蒸餾水90mL

A.4.3.2制法

將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。

A.4.4染色法

A.4.4.1將涂片在火焰上固定，滴加結晶紫染色液，染色1min，水洗；

A.4.4.2滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗；

A.4.4.3滴加95%乙醇脫色，約30s，水洗；或將乙醇滴滿整個涂片，立即傾去，再用乙醇滴滿整個涂片，

脫色10s；

A.4.4.4水洗，滴加沙黃復染液，復染1min，水洗，待干，鏡檢。

A.4.4.5結果：革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。

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GB/T××××—201×

附錄B

（規范性附錄）

光和細菌形態和生化特征

B.1紫色非硫細菌形態特征j見表B.1

表B.1紫色非硫細菌形態特征

特征紅螺菌屬紅假單胞菌屬紅微菌屬

培養液顏色紅色或棕色紅色棕色

細胞形態螺旋形或弧形球形或卵圓形球形或卵圓形

鞭毛極生鞭毛極生鞭毛周生鞭毛

B.2深紅紅螺菌生理生化特征見表B.2

表B.2深紅紅螺菌生理生化特征

鑒定項目特征深紅紅螺菌鑒定項目特征深紅紅螺菌

pH7.0+乙醇+

37℃-天門冬酰胺+

葡萄糖-硫代硫酸鈉-

丙氨酸+硫化鈉-

谷氨酰胺+

注：+表示不小于90%陽性,-表示陰性

B.3黃褐紅螺菌生理生化特征見表B.3

表B.3黃褐紅螺菌生理生化特征

鑒定項目特征黃褐紅螺菌鑒定項目特征黃褐紅螺菌

pH7.0+葡萄糖-

37℃-果糖-

苯甲酸鹽+糖醇-

琥珀酸鹽+硫代硫酸鹽-

乙醇+

注：+表示不小于90%陽性,-表示陰性

B.4沼澤紅假單胞菌生理生化特征見表B.4

表B.4沼澤紅假單胞菌生理生化特征

鑒定項目特征沼澤紅假單胞菌鑒定項目特征沼澤紅假單胞菌

pH5.5+檸檬酸+

37℃+硫代硫酸鈉+

葡萄糖-觸酶+

苯甲酸+氫化酶+

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GB/T××××—201×

酒石酸+甲酸脫氫酶+

乙醇+

注：+表示不小于90%陽性,-表示陰性

B.5莢膜紅假單胞菌生理生化特征見表B.5

表B.5莢膜紅假單胞菌生理生化特征

鑒定項目特征莢膜紅假單胞菌鑒定項目特征莢膜紅假單胞菌

pH5.5+山梨醇-

25℃+亮氨酸-

果糖-硫代硫酸鈉-

葡萄糖+甘油-

甘露醇-氫化酶+

乙醇-甲酸脫氫酶+

注：+表示不小于90%陽性，-表示陰性

B.6球形紅假單胞菌生理生化特征見表B.6

表B.6球形紅假單胞菌生理生化特征

鑒定項目特征球形紅假單胞菌鑒定項目特征球形紅假單胞菌

pH6.0+山梨醇+

25℃+乙醇+

果糖+苯甲酸鈉-

葡萄糖+硫代硫酸鈉-

甘露糖+氫化酶+

甘油+甲酸脫氫酶+

注：+表示不小于90%陽性,-表示陰性

附錄C

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GB/T××××—201×

（規范性附錄）

MNP標記引物

MNP標記引物見表C.1

表C.1MNP標記引物

物種標記位點編號引物類別引物序列（5'端到3'端）

正向引物GATGGGCGTCAAGGTCGA

沼澤紅假單胞菌1

反向引物ACCGGCTTCGGCATGAA

正向引物ATCAAGATCAACCACGAGACCCA

沼澤紅假單胞菌2

反向引物GAGACGTGGATCAGGCCTTC

正向引物CGGGTGCTGATGATGCTGT

沼澤紅假單胞菌3

反向引物ACGCCGTCGGTGCTTAAA

正向引物TCTTGCCGACCACGATCG

沼澤紅假單胞菌4

反向引物CGACCGAAGTCGAGGTCAAG

正向引物GGCGAAATCGTCGCCTG

沼澤紅假單胞菌5

反向引物GAGCACGCTTTGGACGAAC

正向引物ATCAACGCCTTCACCAACCC

沼澤紅假單胞菌6

反向引物CGGACCCGGATCGATCTTG

正向引物GGCACGCTGTTCACCTTC

沼澤紅假單胞菌7

反向引物CTTGATGTCGCCCTTGGC

正向引物TAACGGCTGGCATTCATCGTTTA

沼澤紅假單胞菌8

反向引物TGATACTGGAAGTCTTGAGTATGGCA

正向引物CCTGCTCGTCGGTCTTCATG

沼澤紅假單胞菌9

反向引物CGGTTGAACTCGCAGCTGAT

正向引物AAGTGGTGCTGGTCGGC

沼澤紅假單胞菌10

反向引物CGAGAACACCTGGCTCTTCTTG

正向引物CGGCACTTCCATGCCGA

沼澤紅假單胞菌11

反向引物GTCAACTTCGAAGAGCCGC

正向引物GGGAAATTGGAATGGGCGAAGAT

莢膜紅假單胞菌12

反向引物GGTCGATCAGCGTGCTGAA

正向引物GGAAGCGCGTCTGTTCAAATAC

莢膜紅假單胞菌13

反向引物TCGATGACCTTCCAGTTGATGAATTC

正向引物ATGCGGGAACGCGCAGATA

莢膜紅假單胞菌14

反向引物ATGGTCGGAGCGAGAGGAT

正向引物CGCGCAATACTACATGAACCAC

莢膜紅假單胞菌15

反向引物CCATGCCCAGACGTTCTTTCTT

正向引物TAGCGCACCACATCCTCG

莢膜紅假單胞菌16

反向引物ATCCCGGTGGCGGTGAAGA

正向引物CTGATCTTTGACGCCTGCG

莢膜紅假單胞菌17

反向引物AGGTGAATGCCCAGCGC

莢膜紅假單胞菌18正向引物TTGACCACCTGCACCAGCAT

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GB/T××××—201×

反向引物AGCATGACCACGATCACCATG

正向引物CGGTCTGGGCAAGACCTA

莢膜紅假單胞菌19

反向引物GCTTGCCCAGATAGGTCGA

正向引物GCGATGCTGCGCAAGAAC

莢膜紅假單胞菌20

反向引物GTCGGCCTTCACCACCAGAC

正向引物GCCTGCAAGCGCAAGATC

莢膜紅假單胞菌21

反向引物CCGATCATCAC