第四章

抗體制藥

生物技術制藥抗體制藥網載專家講座第1頁第一節概述

1890年Behring和北里柴三郎發覺白喉抗毒素,建立了血清療法,開創了抗體制藥。

1937年Tiselius用電泳法將血清蛋白分離為白蛋白、α、β、γ球蛋白，并證實抗體活性主要存在于γ球蛋白組分。

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抗體是指能與對應抗原特異性結合含有免疫功效球蛋白。

抗體產生：機體免疫系統受抗原刺激后，B淋巴細胞被活化增殖和分化為漿細胞，由漿細胞合成和分泌球蛋白。生物技術制藥抗體制藥網載專家講座第3頁20世紀60年代發覺多發性骨髓瘤是漿細胞癌變形成惡性增殖性疾病。病人血清中出現同抗體結構類似球蛋白，統稱為免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。所以Ig是化學結構概念，而抗體是生物學功效概念。生物技術制藥抗體制藥網載專家講座第4頁

多克隆抗體：病原微生物含有各種抗原決定簇抗原物質，所以這些抗體制劑也是各種抗體混合物，故稱多克隆抗體。生物技術制藥抗體制藥網載專家講座第5頁1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴細胞雜交瘤技術制備出單克隆抗體（monoclonalantibodyMcAb）。單克隆抗體含有高度特異性、均一性、起源穩定、可大量生產等特點，為抗體制備和應用提供了全新伎倆，還促進了基礎和臨床醫學發展。生物技術制藥抗體制藥網載專家講座第6頁

單克隆抗體作為抗體制劑，在臨床上主要用與疾病診療和治療。單克隆抗體檢測與一些疾病相關抗原，輔助臨床診療。用放射性核素標識單克隆抗體進行腫瘤顯像，做免疫定位診療。生物技術制藥抗體制藥網載專家講座第7頁

單克隆抗體用于臨床治療，CD3單克隆抗體作為免疫抑制劑對器官移植免疫排斥有抑制作用。以單克隆抗體作為載體藥品對腫瘤進行定向治療。生物技術制藥抗體制藥網載專家講座第8頁第二節單克隆抗體

單克隆抗體是將抗體產生細胞與含有沒有限增殖能力骨髓瘤細胞相融合，經過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細胞成為純一單克隆細胞系而產生。生物技術制藥抗體制藥網載專家講座第9頁生物技術制藥抗體制藥網載專家講座第10頁生物技術制藥抗體制藥網載專家講座第11頁

一、抗原與動物免疫制備特定抗原單克隆抗體，首先要制備用于免疫適當抗原，再用抗原進行動物免疫。有抗原能夠用化學合成：地高辛多數抗原物為混合物須經免疫、篩選、克隆化。生物技術制藥抗體制藥網載專家講座第12頁

為使雜交瘤細胞穩定，免疫動物和骨髓瘤細胞供體同一品系動物進行免疫。當前慣用骨髓瘤細胞系多來自BALB/c小鼠和LOU大鼠，所以免疫動物也采取對應品系。生物技術制藥抗體制藥網載專家講座第13頁

免疫方法采取體內免疫法和體外免疫法。

體內免疫法適合用于免疫原性強、抗原量較多時應用，普通用8～12周齡雌性鼠。顆粒性抗原（如細菌細胞抗原）免疫原性強，可不加佐劑，直接注入腹腔10個細胞進行首次免疫，間隔1～3周，再追加免疫1～2次。7生物技術制藥抗體制藥網載專家講座第14頁可溶性抗原按每只小鼠10～100μg抗原與福氏完全佐劑等量混合后注入腹腔內，進行首次免疫，間隔2～4周，再用不加佐劑原抗原追加免疫1～2次。普通再采脾細胞前3日由靜脈注射最后一次抗原。刺激B細胞分裂。生物技術制藥抗體制藥網載專家講座第15頁

脾內免疫法即在麻醉下直接將

0.1～0.2ml抗原注入脾臟進行免疫。細胞抗原需105個，可溶性抗原需10μg。

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體外免疫法用于不能采取體內免疫情況下，如制備人源性單克隆抗體；免疫源性極弱，易引發免疫抑制。優點：需抗源量少，免疫期短，干擾原因少。生物技術制藥抗體制藥網載專家講座第17頁

體外免疫法：用4～8周齡BALB/c

小鼠脾臟制成單細胞懸液，再加入適當抗原使其濃度達0.5～5μg/ml,在5%CO

37C下培養4～5天,再分離脾細胞,進行細胞融合。o2o生物技術制藥抗體制藥網載專家講座第18頁二、細胞融合與雜交瘤細胞選擇性培養細胞融合方法：脾細胞（1×10）骨髓瘤細胞（2×10）混合聚乙二醇誘導下融合，2分鐘，然后用培養液將融合液遲緩稀釋。87生物技術制藥抗體制藥網載專家講座第19頁

用于細胞融合骨髓瘤細胞應含有融合率高，本身不分泌抗體，所產生雜交瘤細胞分泌抗體能力強，長久穩定。

PEG相對分子量4000，濃度為50%

二甲基亞砜增加融合率。生物技術制藥抗體制藥網載專家講座第20頁

細胞融合后可產生各種融合。脾—脾、脾—瘤、瘤—瘤融合細胞。選擇性培養:

培養基為HAT培養液。次黃嘌呤(H)氨甲喋呤(A)胸腺嘧啶(T)配制。

A阻斷DNA合成。生物技術制藥抗體制藥網載專家講座第21頁生物技術制藥抗體制藥網載專家講座第22頁

三、篩選陽性克隆與克隆化篩選陽性克隆慣用檢測方法：免疫酶技術、免疫熒光技術、放射免疫技術等。克隆化是指單個細胞經過無性繁殖而取得細胞集團整個培養過程。生物技術制藥抗體制藥網載專家講座第23頁ELISA用于破傷風抗體篩選生物技術制藥抗體制藥網載專家講座第24頁四、雜交瘤細胞與抗體性狀判定雜交瘤細胞判定：染色體分析。它是判定客觀指標，了解分泌抗體能力。單抗進行Ig類和亞類判定：用羊或兔抗Ig不一樣類或亞類抗體，進行免疫擴散或ELISA判定。親和力、特異性、純度、分子量測定。生物技術制藥抗體制藥網載專家講座第25頁五、單克隆抗體大量制備體外培養法可獲10μg/ml抗體體內誘生法可獲5～20mg/ml抗體用BALB/c小鼠。降植烷接種雜交瘤細胞取腹水離心上清。生物技術制藥抗體制藥網載專家講座第26頁

六、單克隆抗體純化依單抗IgG類和亞類不一樣，選各種不一樣純化方法。體內誘生法單克隆抗體純化方法：1離心取上清，超濾，鹽析。2分離⑴凝膠過濾用于IgGIgM單抗純化。⑵陰離子交換層析IgG單抗純化。⑶親和層析IgG單抗純化。生物技術制藥抗體制藥網載專家講座第27頁第三節鼠源性單克隆抗體

改造

雜交瘤單抗為鼠源性，應用人體產生人抗鼠抗體及毒副作用。對鼠源性單抗進行基因加工和改造。目標：降低免疫源性；降低相對分子量。人-鼠嵌合抗體、改形抗體、小分子抗體。生物技術制藥抗體制藥網載專家講座第28頁生物技術制藥抗體制藥網載專家講座第29頁Ig分子結構生物技術制藥抗體制藥網載專家講座第30頁Ig分子基因結構生物技術制藥抗體制藥網載專家講座第31頁一、人鼠嵌合抗體

抗原抗體結合功效—抗體可變區（V）同種性免疫源性—抗體穩定區（C）在基因水平上將鼠源單抗H和L鏈可變區基因分離出來，分別與人IgH和L鏈穩定區（C）基因連接成人-鼠嵌合抗體H和L鏈基因，再共轉染骨髓瘤細胞，就能表示完整人-鼠嵌合抗體。生物技術制藥抗體制藥網載專家講座第32頁二、改形抗體（CDR移植抗體）Ig分子中參加組成抗原結合部位區域是H和L鏈V區中互補決定區（CDR區），而不是整個可變區。H和L鏈各有三個CDR，其它部分稱框架區。用鼠源單抗CDR序列替換人Ig分子中CDR序列，則可使人Ig分子含有鼠源單抗抗原結合特異性。可消除免疫源性。生物技術制藥抗體制藥網載專家講座第33頁生物技術制藥抗體制藥網載專家講座第34頁三、小分子抗體

基因工程小分子抗體僅表示鼠源單抗V區片段，相對分子量為原抗體1/80～1/3。即保留CDR區，而Ig分子中C區不表示。小分子抗體類型有：①Fab片段抗體②Fv抗體③單鏈抗體生物技術制藥抗體制藥網載專家講座第35頁④單域抗體⑤最小識別單位單鏈抗體優點：①可去除非特異性反應競爭性表面蛋白，腫瘤顯象背景愈加清楚性。②易滲透腫瘤組織中增加藥品治療濃度。③免疫源性小，可消除人抗鼠排異反應。生物技術制藥抗體制藥網載專家講座第36頁

單鏈抗體大多在大腸桿菌中表示，有三種形式：①直接在細胞質中表示；②與其它菌體融合表示融合蛋白；③分泌表示含有功效單鏈抗體。生物技術制藥抗體制藥網載專家講座第37頁四、雙功效抗體雙功效抗體就是雙特征抗體。它是一個非天然性抗體。其結合抗