微生物培養基配制和滅菌目標要求試驗材料試驗程序微生物培養基的配制和滅菌第1頁目要求了解培養基配制原理和方法，掌握其配制過程。了解幾個滅菌方法，掌握干熱滅菌法和加壓蒸汽滅菌法原理及其使用方法。熟悉分離、培養微生物前相關準備工作及操作方法。微生物培養基的配制和滅菌第2頁實驗材料藥品：牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、馬鈴薯、蔗糖；可溶性淀粉、K2HPO4、KNO3、MgSO4?7H2O、FeSO4?7H2O等。高壓蒸汽滅菌器、恒溫干熱滅菌箱、細菌過濾器、紫外線殺菌燈。其它：天平、牛角匙、電爐、2MHCl、2MNaOH、pH試紙、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、帶玻璃珠三角瓶、帶棉塞無菌試管、無棉塞空試管、培養皿、吸管、各種包裝紙、防水紙、繩索、棉花、標簽等。微生物培養基的配制和滅菌第3頁實驗程序培養基配制分離培養微生物慣用器皿準備培養基和玻璃器材滅菌方法微生物培養基的配制和滅菌第4頁試驗程序1:培養基配制培養基培養基配制標準培養基種類培養基配制方法和步驟培養基配方及配制無菌水制備微生物培養基的配制和滅菌第5頁

培養基是人工配制適合于不一樣微生物生長繁殖或積累代謝產物營養基質。它是進行科學研究，發酵生產微生物制品等基礎。微生物培養基的配制和滅菌第6頁培養基配制標準一、營養成份二、PH值三、滲透壓四、氧化還原電位微生物培養基的配制和滅菌第7頁一、營養成份總體標準

1.依據不一樣微生物營養需要配制不一樣培養基，如自養型微生物：由簡單無機物質組成異養做生物：最少需要含有一個有機物質。

按微生物主要類群來說，又有細菌、放線菌、酵母菌和霉菌之分。它們所需要培養基成份也不一樣，分別稱為牛肉膏蛋白胨培養基，高氏1號合成培養基，麥芽汁培養基，查氏合成培養基。培養基配制標準微生物培養基的配制和滅菌第8頁

能源指能為微生物生命活動提供最初能量起源營養物或輻射能。

微生物能源譜：

培養基配制標準有機物：化能異養微生物（同碳源）無機物：化能自養微生物（不一樣于碳源）化學物質輻射能：光能自養和光能異養微生物能源譜：微生物培養基的配制和滅菌第9頁

化能自養微生物能源物質都是一些還原態無機物質，比如：NH4+、NO2-、S、H2S、H2、Fe2+等，能利用這些物質作為能源全部是細菌，如：硝酸細菌、亞硝酸菌、硫化細菌、硫細菌、鐵細菌、硫細菌、氫細菌和鐵細菌等。這些無機養料經常是雙功效（如：NH4+既是硝酸細菌能源，又是它氮源。）

有機營養物常有雙功效或三功效作用，既是異養微生物能源，又是它們碳源或氮源。輻射能是單功效，只為光能微生物提供能源。培養基配制標準微生物培養基的配制和滅菌第10頁

2.注意各種營養物質濃度與配比

營養物濃度：營養物質濃度太大時對微生物生長起抑制作用，濃度小時不能滿足微生物生長需要。

各營養物質之間濃度比：尤其是碳氮比（C／N）（碳氮比普通指培養基中元素碳與元素氮比值，有時也指培養基中還原糖與粗蛋白兩種成份含量之比）影響更為顯著。培養基配制標準微生物培養基的配制和滅菌第11頁營養成份碳源氮源礦物質生長因子水分培養基配制標準微生物培養基的配制和滅菌第12頁

碳源（carbonsource）凡是提供微生物營養所需碳元素（碳架）營養源，稱為碳源。

碳源物質功效：組成細胞物質；為機體提供整個生理活動所需要能量（異養微生物）。

微生物碳源譜無機含碳化合物：如CO2和碳酸鹽等。有機含碳化合物：糖與糖衍生物、脂類、醇類。有機酸、烴類、芳香族化合物以及各種含氮化合物。

培養基配制標準微生物培養基的配制和滅菌第13頁

氮源(nitrogensource)

凡是提供微生物營養所需氮元素營養源，稱為氮源。

氮源物質主要作用是合成細胞物質中含氮物質，少數自養細菌能利用銨鹽、硝酸鹽作為機體生長氮源與能源，一些厭氧細菌在厭氧與糖類物質缺乏條件下，也能夠利用氨基酸作為能源物質。

無機氮源：碳酸銨、硝酸鹽、硫酸銨、尿素

有機氮：蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等。

生產上慣用氮源有硝酸鹽、銨鹽、尿素、氨以及蛋白含量較高魚粉、蠶蛹粉、黃豆餅粉、花生餅份、玉米漿等。

培養基配制標準微生物培養基的配制和滅菌第14頁二.控制培養基PH值細菌與放線菌生長pH在7—7.5之間，酵母菌與霉菌生長pH值在4-5之間。在微生物生長和代謝過程中，因為營養物質利用和代謝產物形成與積累，常會改變培養基pH值，為了維持培養基pH值相對恒定，通常采取以下兩種方式：內源調整：在培養基里加一些緩沖劑或不溶性碳酸鹽；調整培養基碳氮比。外源調整：按實際需要流加酸或堿液培養基配制標準微生物培養基的配制和滅菌第15頁三、滲透壓注意營養物質要有適合濃度，不能太低滿足不了生長需要，太高則滲透壓太大，也會抑制微生物生長培養基配制標準微生物培養基的配制和滅菌第16頁四、氧化還原電位氧化還原電位越高，培養基氧化活動越強，在厭氧菌培養中，加入還原劑，可降低自由氧毒害。培養基配制標準微生物培養基的配制和滅菌第17頁培養基種類據組成成份可分為:

1.合成培養基：由各種純化學物質按一定百分比配制而成。2.半合成培養基：有一部分純化學物質和另一部分天然物質配制而成。3.天然培養基：利用天然起源有機物配制而成。從培養基物理狀態可分為1.液體培養基：不加凝固劑（慣用凝固劑為瓊脂）液體狀態培養基。2.固體培養基：在液體培養基中加入2%左右凝固劑固體狀態培養基或農副產品培養基。3.半固體培養基：在液體培養基中加入0.2—0.5%凝固劑而成半固體狀培養基。微生物培養基的配制和滅菌第18頁按照培養基用途，可將其分為1.加富培養基：加富培養基是指在普通培養基里加過血、血清、動物（或植物）組織液或其它營養物質（或生長因子）一類營養豐富培養基，用以培養某種或某類營養要求苛刻異養微生物2.選擇培養基：選擇培養基是依據某種或某一類群微生物特殊營養需要或對某種化合物敏感性不一樣而設計出來一類培養基。利用這種培養基能夠將某種或某類微生物從混雜微生物群體中分離出來。3.判別培養基：普通培養基中加入能與某種代謝產物發生反應指示劑或化學藥品，從而產生某種顯著特征性改變，以區分不一樣微生物培養基配制標準微生物培養基的配制和滅菌第19頁培養基配制方法和步驟稱量：按照配方正確稱取各種原料放于搪瓷杯中。溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒攪勻，加熱溶解。調pH值：用2MNaOH或2MHCl調pH，用pH試紙對照。加瓊脂溶化：加熱過程中要不停攪拌，可適當補水。分裝：注意不要污染棉塞。包扎成捆，掛上標簽（必須用鉛筆寫），注明何種培養基。滅菌備用：培養基滅菌后必須在370C下恒溫培養24h，確定無菌生長，方可使用。微生物培養基的配制和滅菌第20頁配制方法和步驟微生物培養基的配制和滅菌第21頁配制方法和步驟微生物培養基的配制和滅菌第22頁配制方法和步驟微生物培養基的配制和滅菌第23頁注意事項培養基配方在附錄Ⅱ按照每組安排來配制，每人配不一定都相同按照書上百分比，但總量有變（全部配方均為1000ml量，同學們需要依據不一樣要求換算）配溶液調PH值加瓊脂粉滅菌（在老師監督下進行）普通微生物培養基配制能夠使用自來水，在細胞培養以及分子試驗中需要區分對待微生物培養基的配制和滅菌第24頁試驗程序2:分離培養微生物慣用器皿準備清洗一些玻璃儀器：如三角燒瓶、試管、培養皿、吸管等。棉塞制作包裝培養皿和吸管等。

微生物培養基的配制和滅菌第25頁濕熱滅菌法原理濕熱滅菌法菌體吸收水分蛋白質較易凝固濕熱穿透力比干熱大，水傳熱能力比許多非導體固體強濕熱蒸汽有潛熱存在，1g水在100℃由液態變為固態可放出2.26kJ，可增強滅菌效果微生物培養基的配制和滅菌第26頁培養基和玻璃器材滅菌方法空氣膨脹壓大于水蒸氣膨脹壓微生物培養基的配制和滅菌第27頁試驗程序3:培養基和玻璃器材滅菌方法干熱滅菌法：電熱烘箱作為干熱滅菌器加壓蒸汽滅菌法其步驟以下：1.滅菌器內加入一定量水，將用防水紙包扎好物品放入其中。2.接通電源，進行加熱。3.排除高壓鍋內冷空氣，可將排氣閥打開，待排出大氣后關閉排氣閥；或關閉排氣閥，待壓力上升到0.5kg/cm2時再打開排氣閥，待壓力回復到0時再關閉排氣閥。4.當壓力達15bl/in2（即1.05kg/cm2,0.1MPa）時，此時滅菌器內溫度為1210C，維持20-30min。對熱不穩定培養基如含有葡萄糖、氨基酸等物時，應適當降低壓力(0.06MPa,約112.60C)，30min。5.滅菌時間一到，切斷電源，待壓力降至零時，才能打開排氣閥，然后打開滅菌器蓋，取出物品。培養基和玻璃器材滅菌方法微生物培養基的配制和滅菌第28頁微生物培養基的配制和滅菌第29頁微生物培養基的配制和滅菌第30頁培養基和玻璃器材滅菌方法微生物培養基的配制和滅菌第31頁間歇滅菌法：待滅菌物品放在滅菌器或蒸籠里，天天蒸煮1次，每次煮沸1h，連續3d重復進行。在每兩次蒸煮之間，將物品（指培養基）放在370C恒溫條件下培養過夜，這么能夠使每次蒸煮后未殺死殘留芽孢萌發成營養體，方便下次蒸煮時殺滅。培養基和玻璃器材滅菌方法微生物培養基的配制和滅菌第32頁過濾除菌法：不能用加熱滅菌液體物質（如維生素、血清），普通可用細菌過濾器進行除菌。培養基和玻璃器材滅菌方法微生物培養基的配制和滅菌第33頁紫外線滅菌法：普通30W燈管，9m3空間，距地面2m每次打開紫外線照射0.5h，就使室內空氣滅菌。若照射紫外線時先噴灑石炭酸等化學消毒劑，可增強滅菌效果。紫外線雖有較強殺菌力，但穿透力弱，即使一薄層玻璃或水層就能將大部分紫外線濾除，所以只適合用于空氣及表面殺菌。培養基和玻璃器材滅菌方法微生物培養基的配制和滅菌第34頁化學藥劑消毒滅菌：微生物試驗室中慣用化學殺菌劑有升汞、甲醛、高錳酸鉀、酒精、碘酒、龍膽紫、石炭酸、漂白粉、新潔爾滅、煤酚皂溶液，它們有是殺菌劑，有是抑菌劑。培養基和玻璃器材滅菌方法微生物培養基的配制和滅菌第35頁培養基配制標準配制培養基配方，及方法培養基蒸汽滅菌原理，方法微生物培養基的配制和滅菌第36頁牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基AmpR細菌分離培養基成份牛肉膏0.3g;蛋白胨1g;氯化鈉0.5g;瓊脂2g;蒸餾水

100mL;pH7.0～7.2;滅菌1.05kg/cm2，20-25min用量：100-150mL/行；制備8-10個平板；2個/組（涂布/劃線）制作斜面（只需1個組制備）：無需抗生素配制方法微生物培養基的配制和滅菌第37頁牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基-2配制方法稱量：按培養基配方百分比依次準確稱取。注意：牛肉膏、蛋白胨。溶化：在燒杯中加入約2/3所需水量，然后依次逐一溶化培養基各成份。調pH：注意pH值不要調過頭，以防止回調。定容：待各成份完全溶化后，補足水量至所需體積。加瓊脂（固體培養基）：加入所需瓊脂量，加熱融化，補足失水。分裝、加塞、標識、包扎：分裝入試管內或三角燒瓶內。注意：不要使培養基沾在管口或瓶口上。

(1)液體分裝分裝高度以試管高度1/4左右為宜。

(2)固體分裝分裝試管，其裝量不超出管高1/5，滅菌后制成斜面。分裝三角燒瓶量以不超出三角燒瓶容積二分之一為宜。

(3)半固體分裝試管普通以試管高度1/3為宜，滅菌后垂直待凝。滅菌：121.3℃，20分鐘高壓蒸汽滅菌。如因特殊情況不能及時滅菌，則應放入冰箱內暫存?？股氐壬锘钚晕镔|添加：臨用前加入，約55℃，按比列添加（終濃度10-60ug/mL）。制作平板or斜面：擱置斜面長度以不超出試管總長二分之一為宜。無菌檢驗：將滅菌培養基放入37℃溫室中培養24-48小時，以檢驗滅菌是否徹底。微生物培養基的配制和滅菌第38頁馬丁培養基淀粉降解真菌分離培養基成份葡萄糖2.5g蛋白胨1.25g；KH2PO4·3H2O0.25g;MgSO4·7H2O0.125g;0.1％孟加拉紅溶液0.83ml;瓊脂3.8～5g;蒸餾水250ml;自然pH;用量：250mL/行；制備12個平板；2個/人（涂布/劃線）制作斜面：無需抗生素配制方法微生物培養基的配制和滅菌第39頁馬丁培養基-2配制方法稱量：稱取培養基各成份所需量。溶化：在燒杯中加入約2/3所需水量，然后依次逐一溶化培養基各成份。按每250ml培養基加入0.83ml0.1％孟加拉紅溶液。定容：待各成份完全溶化后，補足水量至所需體積。加瓊脂（固體培養基）：加入所需瓊脂量，加熱融化，補足失水。分裝、加塞、標識、包扎。滅菌：高壓蒸汽滅菌121．3℃，20min。臨用前，加熱融化培養基，候冷至60℃左右，按每100ml培養基無菌操作加入2ml2％去氧膽酸鈉溶液及0.33ml鏈霉素溶液（10000u/ml），快速混勻。制作平板or斜面用量：250mL/行；制備12個平板；2個/人（涂布/劃線）制作斜面（6支），4支無菌試管，1瓶50ml無菌水微生物培養基的配制和滅菌第40頁高氏I號培養基產色素放線菌分離培養基成份溶性淀粉2g;KNO30.1g;K2HPO40.05g;MgSO4?7H2O0.05g;NaCl0.05g;FeSO4?7H2O0.001g（母液）;瓊脂2g;自來水100mL;pH7.2～7.4;滅菌1.05kg/cm2，20-25min用量：100-150mL/行；制備8-10個平板；2個/組（涂布/劃線）制作斜面（只需1個組制備）：無需抗生素配制方法微量元素（母液）pH微生物培養基的配制和滅菌第41頁樣品制備及目標微生物分離梯度稀釋：無菌操作稱取檢樣25克土（或25mL），放入含有225mL滅菌水玻璃三角瓶中(0.5g/5mL)，振搖30min，即為1：10稀釋液，依次做1：100、1：1000……稀釋。依據對樣品污染情況預計，選擇2-3個適當稀釋度，涂布（100-200ul稀釋液）or劃線（稀釋原液）or450C混合共培養（0.5-1.0mL稀釋液）標識并培養：平皿底；平皿倒置；28～37℃

恒溫培養細菌/真菌/放線菌=37/28/28℃合理安排時間，協作多出平板和斜面寫上班級和組號，交汪老師供轉接使用準備下個班級公用試驗材料（無菌水、三角瓶、試管等）微生物培養基的配制和滅菌第42頁思索題培養基中加瓊脂作用是什么？干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌和間歇滅菌場所有何不一樣？怎樣檢驗培養基滅菌是否徹底？微生物培養基的配制和滅菌第43頁注意事項培養基配方在附錄Ⅱ按照每組安排來配制，每人配不一定都相同按照書上百分比，但總量有變（標準配方均為1000ml量，同學們需要依據不一樣要求換算）配溶液調PH值加瓊脂粉滅菌（在老師監督下進行）普通微生物培養基配制能夠使用自來水，在細胞培養以及分子試驗中需要區分對待微生物培