關于聚合酶鏈反應2

一.概述聚合酶鏈反應（polymerasechainreaction,PCR),又稱無細胞克隆技術，是一種特定DNA片段在體外快速擴增的新方法。數小時達107-108倍1985年，Centus公司KaryMullis發明1993年因此獲諾貝爾化學獎第2頁,共42頁，2024年2月25日，星期天3PCR擴增儀第3頁,共42頁，2024年2月25日，星期天4變性5’3’5’3’3’5’3’5’引物復性3’5’3’5’5’3’3’5’P1P2第4頁,共42頁，2024年2月25日，星期天5延伸3’5’3’5’5’3’3’5’P1P2再變性第5頁,共42頁，2024年2月25日，星期天6再復性P1P1P2P2再延伸第6頁,共42頁，2024年2月25日，星期天7P1P1P2P2短片段以指數形式擴增長片段以線性形式擴增最終主產物片段長度在P1-P2之間第7頁,共42頁，2024年2月25日，星期天8PCR循環的主要參數：1.預變性：92°C--95°C，2--5min2.變性：92°C--95°C，30s-1min3.復性：40°C--60°C，20s--2min4.延伸：70°C--75°C，30s--3min5.總延伸：72°C，7min第8頁,共42頁，2024年2月25日，星期天9三、PCR的基本反應步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C第9頁,共42頁，2024年2月25日，星期天10PCR擴增條件

94℃,5min

94℃,1min

30

55℃,1min

72℃,1min

72℃,7min第10頁,共42頁，2024年2月25日，星期天11第11頁,共42頁，2024年2月25日，星期天12DNAMarkerNGF←2000bp←1000bp←750bp←500bp←250bp←100bp第12頁,共42頁，2024年2月25日，星期天13第13頁,共42頁，2024年2月25日，星期天14第14頁,共42頁，2024年2月25日，星期天15第15頁,共42頁，2024年2月25日，星期天16三.PCR反應體系緩沖液提供所需的pH環境DNA模板：欲擴增的DNA樣品

dNTP：四種脫氧核苷酸MgCl2：提供Mg++離子引物：根據欲擴增的DNA樣品設計耐熱的DNA聚合酶：來源于喜熱的細菌第16頁,共42頁，2024年2月25日，星期天17耐熱的DNA聚合酶Taq聚合酶喜溫性細菌ThermusaquaticusBM5→3聚合活性5→3外切活性

Pwo聚合酶

喜溫性細菌Pyrococcyswoesei5→3聚合活性3→5外切活性（校正）耐熱1000C2小時

Tth聚合酶

喜溫性細菌Thermusthermophilus5→3聚合活性當錳離子存在時具有逆轉錄酶活性

C.therm聚合酶

喜溫性細菌Thermusthermophilus3→5外切活性（校正）當鎂離子存在時具有逆轉錄酶活性第17頁,共42頁，2024年2月25日，星期天181.PCRbuffer:72C時，反應體系的pH值下降1個單位，接近于7.2MgCl2－

濃度1－2mmol/L，過量引起非特異擴增，不足使酶活性顯著降低，導致產物量少；2.三磷酸脫氧核苷酸（dNTP）：是合成的原料，四種的濃度應相等，濃度一般為50—200μmol／L。第18頁,共42頁，2024年2月25日，星期天193.引物：0.1-1umol/L高濃度－引物二聚體、非特異產物低濃度－產率低4.Taq酶：來自于水生棲熱菌（Thermusaquaticus),

最適反應溫度為70—75oC。常用濃度為1—2.5U/100ul，濃度過高缺乏專一性，過低則產物產量低。第19頁,共42頁，2024年2月25日，星期天205.DNA樣品按照常用的分子生物學方法制備的DAN或RNA樣品，其純度應能達到實驗要求。質量100-500ng不含有蛋白酶、核酸酶、DNA結合酶、Taq酶抑制劑6.石蠟油減少反應液的蒸發第20頁,共42頁，2024年2月25日，星期天21四.影響PCR的主要因素1.溫度參數：模板變性溫度--低溫不產生單鏈DNA模板，PCR不啟動；超過95C，影響Taq酶活性退火溫度

溫度高--特異性強，引物與模板結合不

牢，DNA擴增效率下降溫度低--產量高，特異性差

Ta=Tm-5=4(G+C)+2(A+T)-5

第21頁,共42頁，2024年2月25日，星期天22引物延伸溫度：取決于Taq酶最適溫度

70-75C

大于1Kb的DNA片段，1min以上，并加入明膠或BSA15-20%甘油有助于2.5KbDNA片段擴增第22頁,共42頁，2024年2月25日，星期天23PCR擴增平臺期循環到一定次數后，擴增產物不再以指數關系增加，而是以線性關系增加或不增加，稱為平臺期。提前進入平臺期的原因

1.引物量不足

2.dNTP量不足

3.Taq酶失活

4.原始模板數量太多第23頁,共42頁，2024年2月25日，星期天24循環次數：25-35次次數太多--核苷酸錯配、非特異擴增多進入平臺期，增加次數效果不大次數太少--產率低第24頁,共42頁，2024年2月25日，星期天252.引物設計引物與待擴增的DNA序列互補的寡核苷酸片段。5’引物又稱上游引物，其核苷酸序列與模板5’序列相同。3’引物又稱下游引物，其核苷酸序列與模板3’序列互補。第25頁,共42頁，2024年2月25日，星期天26引物長度人類基因組有30億bp，按照統計學的計算，隨機組合的17個堿基的核苷酸序列，在人類基因組中可能出現一次。 引物長度一般為20-24個堿基。有時也見50甚至更多的堿基。第26頁,共42頁，2024年2月25日，星期天27引物組成： 堿基隨機分布，避免聚嘌呤或聚嘧啶的存 在，G、C含量一般在40-60%

引物內部避免形成次級結構如發卡結構 兩個引物之間不應互補，避免形成引物 二聚體第27頁,共42頁，2024年2月25日，星期天28兩條引物應避免有同源序列，以免兩條引物競爭模板的同一位點。引物5’端：

可加上酶切位點或熒光素等引物3’端：5-6個堿基與靶DNA嚴格配對第28頁,共42頁，2024年2月25日，星期天293’

‥‥TTCAAGCATCTCCAAGAGTTGGCATACGGTAAG‥‥5’

引物5’GTGAATTCTCTCAACCGTAT3’注：紅色部分為限制性內切酶切割位點，堿基與 模版鏈不完全互補。第29頁,共42頁，2024年2月25日，星期天30逆轉錄PCR（ReverseTranscriptionPCR，RT-PCR）

原理：提取組織細胞總RNA，以其中的mRNA為模板，采用需要的引物，在逆轉錄酶的作用下反轉錄成cDNA。再以cDNA作為模板，通過特異性引物，PCR擴增目的基因。應用：分析基因的轉錄產物；獲取目的基因；

合成cDNA探針；第30頁,共42頁，2024年2月25日，星期天31選取適當的組織，提取總RNA以mRNA做模版加入引物、逆轉錄酶、dNTP、合成cDNA的第一鏈逆轉錄酶水解mRNA鏈合成cDNA的第二鏈加入引物、Taq酶，做常規PCR擴增出大量的cDNA分子第31頁,共42頁，2024年2月25日，星期天32RT-PCR操作需注意的問題：

1.模版RNA應嚴格純化，；

2.避免RNA酶污染；

3.所用與實驗有關的物品，需用0.1％的焦炭酸二乙酯（DEPC)浸泡處理。第32頁,共42頁，2024年2月25日，星期天33增效PCR（boosterPCR）當擴增少于1000拷貝的模板DNA時會遇到兩個問題：一是形成引物二聚體，一是非特異擴增，而特異擴增片段產量降低。對于這種情況，可設置二步PCR，先用較低濃度的引物進行初級PCR，此時由于引物少，形成引物二聚體的可能減少，但它并不影響靶序列的擴增，只是由于引物少產物亦少。約經15～20個循環后補充引物量，以初級PCR產物為模板進行擴增，靶序列的產量將相應增加。第33頁,共42頁，2024年2月25日，星期天342.巢式PCR（nestPCR）此時也是進行二步PCR，與上面不同的是，第二級PCR需另行設置反應體系，并應用另外的PCR引物，此時引物的位置位于初級PCR引物的內側，用初級PCR產物做模板，進行第二步PCR，這樣只有初級PCR中特異的擴增片段才能被二級引物擴增。除了達到增效PCR同樣的目的外，還提高了最終產物的特異性。第34頁,共42頁，2024年2月25日，星期天35巢式PCR采用兩對引物進行PCR，其中第二對引物位于第一對引物內。P1上P1下P2上P2下P1上P2上第35頁,共42頁，2024年2月25日，星期天36FirstroundprimersFirstroundPCRSecondroundprimersSecondroundPCRGeneofinterest第36頁,共42頁，2024年2月25日，星期天37在同一PCR體系中加入數對PCR引物，如果這些引物的退火溫度相近，并且所覆蓋的區域不重疊，這樣的反應體系可同時擴增多個DNA片段。多重PCR常用來檢測同一基因的多個外顯子的缺失，或在檢測缺失設置內對照。3、多重PCR

第37頁,共42頁，2024年2月25日，星期天38定量PCR測定靶基因的原始拷貝數目前常用Taqman法.該法的原理是:反應底物中加入熒光探針,探針中的熒光基團與淬滅基團距離