第二章蛋白質化學本章內容第一節氨基酸的結構與分類第二節氨基酸的性質第三節氨基酸混合物的別離第四節蛋白質概論第五節蛋白質的一級結構第六節蛋白質的三維結構第七節蛋白質的理化性質與別離純化第一節氨基酸的結構與分類氨基酸是蛋白質水解的最終產物，是組成蛋白質的根本單位〔構件分子〕。從各種生物體內發現的氨基酸已有180多種，但參與蛋白質組成的常見氨基酸只有20種，這20種氨基酸稱為常見氨基酸或根本氨基酸。aminoacid,aa或AA一、氨基酸的結構氨基酸的結構通式或氨基酸是含有氨基的羧酸，不同氨基酸的R基不同，〔除脯氨酸外〕都為L-α-氨基酸。H甘氨酸CH3丙氨酸L-氨基酸的通式R據R基團化學結構分類

脂肪族ＡA〔16種〕芳香族ＡA(Phe、Tyr、Trp)雜環ＡＡ(His、Pro)據R基團極性分類極性R基團AA非極性R基團AA不帶電荷帶電荷帶正電荷（３種）帶負電荷（２種）據酸堿性質分類中性ＡＡ（一氨基一羧基）酸性ＡＡ(一氨基二羧基)Glu、Asp堿性ＡＡ()（二氨基一羧基）Lys、His、Arg據營養學分類

必需ＡＡ非必需ＡＡ

人的必需氨基酸MetTrpLysValIleLeuPheThr假設來借一兩本書

Arg、HisTrp、Cys二、根本氨基酸的分類甘氨酸〔Gly,G〕丙氨酸〔Ala,A〕纈氨酸〔Val,V〕亮氨酸〔Lue,L〕異亮氨酸〔Ile,I〕1.側鏈只是烴鏈〔5種〕脂肪族氨基酸2.側鏈含有羥基〔2種〕絲氨酸〔Ser,S〕蘇氨酸〔Thr,T〕3.側鏈含硫原子〔2種〕半胱氨酸〔Cys,C〕甲硫氨酸〔Met,M〕天冬氨酸〔Asp,D〕谷氨酸〔Glu,E〕5.側鏈含有堿性基團〔3種〕賴氨酸〔Lys,K〕精氨酸〔Arg,R〕組氨酸〔His,H〕芳香族氨基酸苯丙氨酸〔Phe,F〕酪氨酸〔Tyr,Y〕色氨酸〔Trp,W〕雜環氨基酸組氨酸〔His,H〕脯氨酸〔Pro,P〕非極性氨基酸極性中性氨基酸帶正電荷的氨基酸帶負電荷的氨基酸三、不常見蛋白質氨基酸及非蛋白質氨基酸在少數蛋白質中別離出一些不常見的氨基酸，通常稱為不常見蛋白質氨基酸。這些氨基酸都是在蛋白質合成后由相應的根本氨基酸衍生而來的。非蛋白質氨基酸：存在于生物體內，但不組成蛋白質的呈游離或結合態的氨基酸，約150種，具有多種生理功能。〔1〕L-α-氨基酸的衍生物L-瓜氨酸和L-鳥氨酸是合成精氨酸的中間產物。〔2〕D-α-氨基酸D-Ala存在于肽聚糖中，D-Phe是短桿菌肽S的組分。〔3〕β、γ、δ-氨基酸β-Ala是泛酸的前體，γ-氨基丁酸是傳遞神經沖動的化學介質。第二節氨基酸的性質一、氨基酸的構型、旋光性和光吸收構型：組成蛋白質的氨基酸除Gly以外都有手性碳原子，在三維空間上就有兩種不同的排列方式，它們互為鏡影，這兩種不同的構型分別稱為D-型和L-型。以丙氨酸為例：如含兩個手性碳原子，那么有４種立體異構體，分別稱為Ｄ-,Ｌ-，Ｄ別-和Ｌ別-氨基酸。

L-蘇氨酸(L-threonine)

D-蘇氨酸(D-threonine)

L-別-蘇氨酸(L-allo-threonine)

D-別-蘇氨酸(D-allo-threonine)自然界中組成蛋白質的氨基酸都是L-型。(Gly除外)旋光性：組成蛋白質的氨基酸除Gly以外，都有手性碳原子，所以都有旋光性，能使偏振光的偏振面的向左或向右旋轉，向左旋轉的稱左旋，用“一〞號表示，向右旋轉的稱右旋，用“＋〞號表示。是AA的物理常數，與結構、PH值有關。消旋外消旋內消旋光吸收：組成蛋白質的氨基酸中，Trp、Tyr和Phe對紫外光有一定的吸收，這是因為它們分子中含有苯環，是苯環的共軛雙鍵造成的，這三個氨基酸的光吸收都在280nm附近。

pH=pI+OH-pH>pI+H++OH-+H+pH<pI帶電荷為零帶電荷為正帶電荷為負完全質子化完全去質子化兼性離子二、氨基酸的兩性解離及等電點(pK′1)(pK′2)不同pH時氨基酸以不同的離子化形式存在！

氨基酸是兩性電解質，其解離程度取決于所處溶液的酸堿度。等電點(isoelectricpoint,pI)

在某一pH的溶液中，氨基酸解離成陽離子和陰離子的趨勢及程度相等，成為兼性離子，呈電中性，在電場中既不向陽極也不向陰極移動。此時溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點。氨基酸等電點的特點：

1.凈電荷數等于零，在電場中不移動；

2.此時氨基酸的溶解度最小。氨基酸等電點確實定：pI=————pK1+pK22或（pI=————）pK2+pK32氨基酸的酸堿滴定Henderson-Hasselbalch方程pH=pKa+lg[質子受體][質子供體]酸性氨基酸，以Asp為例：堿性氨基酸，以Lys為例：〔1〕與HNO2的反響三、氨基酸的化學反響〔2〕與茚三酮的反響：脯氨酸產生黃色物質，其它為藍紫色。在570nm〔藍紫色〕或440nm〔黃色〕定量測定〔0.5-50μg/ml〕。(3)與甲醛反響：氨基酸的甲醛滴定法OH中和滴定

反響特點A.為α-NH2的反響B.在常溫，中性條件，甲醛與α-NH2很快反響，生成羥甲基衍生物，釋放氫離子。應用：氨基酸定量分析—甲醛滴定法〔間接滴定〕A.直接滴定，終點pH過高〔12〕，沒有適當指示劑。B.與甲醛反響，滴定終點在9左右，可用酚酞作指示劑。C.釋放一個氫離子，相當于一個氨基〔摩爾比1：1〕D.簡單快速，一般用于測定蛋白質的水解速度。

反響特點A.為α-NH2的反響B.在弱堿性條件下，與DNFB發生芳環取代，生成二硝基苯氨基酸應用：鑒定多肽或蛋白質的N-末端氨基酸。首先由Sanger應用，確定了胰島素的一級結構。(4)與2,4-二硝基氟苯〔DNFB〕的顏色反響〔黃色〕

(5)與苯異硫氰酸酯〔PITC〕的反響由Edman于1950年首先提出為α-NH2的反響用于N末端分析，又稱Edman降解法+胱氨酸二硫鍵-HH〔6〕半胱氨酸的氧化與復原反響pIPK2=4.25PK3=9.67PK1=2.19PK2PK3PK1pIPK1=1.82PK2=6.0PK3=9.17PK2PK1PK3第三節氨基酸混合物的別離根據固定相基質的形式分類，層析可以分為紙層析、薄層層析和柱層析。

根據流動相的形式分類，層析可以分為液相層析和氣相層析。根據別離的原理不同分類，層析主要可以分為吸附層析、分配層析、凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析等。原理：組成層析系統的固定相和流動相具有相反的極性。被分析的樣品〔如aa混合物〕中的各組分依據其自身極性的強弱，與此兩相的親和力不同。與固定相親和力大者，易留滯于原地，與流動相親和力大者，易隨流動相移動，因而到達別離的目的。2.分配層析〔1〕紙層析單向紙層析遷移率：Rf

雙向紙層析圖

〔2〕薄層層析2．離子交換層析

原理：別離氨基酸時，用離子交換樹脂作為支持物，利用離子交換樹脂上的活性基團與溶液中的離子進行交換反響，由于各種離子交換能力不同，與樹脂結合的牢固程度就不同，在洗脫過程中，各種離子以不同的速度移動，從而到達別離的目的。離子交換原理及流程示意圖+

樹脂是一種人工合成的聚苯乙烯一苯二乙烯組成的具有網狀結構的高分子聚合物。

洗脫順序主要與各種離子所帶電荷有關，在電荷相同時，與極性、非極性有關。陽離子交換樹脂：活性基團是酸性的，如磺酸基-SO3H〔強酸型〕，羧基-COOH〔弱酸型〕根本步驟：裝柱上樣分步洗脫分步收集強酸型陽離子交換樹脂pH2~3，使所有氨基酸帶正電荷，正電荷大小順序：堿性AA>中性AA>酸性AA逐步提高洗脫液pH和離子強度習題舉例:有一種蛋白質水解物,在pH6時,用陽離子交換柱層析別離,第一個被洗脫的氨基酸是()A.Val(pI5.96)B.Lys(pI9.74)C.Asp(pI2.77)D.Arg(pI10.76)E.Tyr(pI5.66)二、電泳第四節蛋白質概論一、蛋白質的定義

蛋白質(Protein，pr)

：是一切生物體中普遍存在的，由天然氨基酸按照一定的順序，通過肽鍵連接而成的一條或多條肽鏈構成的生物大分子；其種類繁多，各具有一定的相對分子質量，復雜的分子結構和特定的生物功能；是表達生物遺傳性狀的一類主要物質。二、蛋白質的生物學重要性1.蛋白質是生物體重要組成成分分布廣含量高2.蛋白質具有重要的生物學功能1〕催化生物化學反響〔酶〕2〕結構成分(結締組織的膠原蛋白、皮膚的彈性蛋白、膜蛋白)3〕貯藏〔卵清蛋白、種子蛋白〕4〕物質運輸〔血紅蛋白、脂蛋白、電子傳遞體〕5〕細胞運動〔肌肉收縮的肌球蛋白、肌動蛋白〕6〕激素功能〔胰島素〕7〕防御功能〔抗體、血凝蛋白〕8〕接受傳遞信息〔受體蛋白、味覺蛋白〕9〕調節細胞生長、分化和遺傳信息的表達〔組蛋白、阻遏蛋白〕3.氧化供能三、蛋白質的元素組成主要有C、H、O、N和S。

有些蛋白質含有少量磷或金屬元素鐵、銅、鋅、錳、鈷、鉬，個別蛋白質還含有碘

。各種蛋白質的含氮量很接近，平均為16％，這是凱氏定氮法測蛋白質含量的理論依據：蛋白質含量＝蛋白質含N量×6.251.按組成分類

﹡單純蛋白質這類蛋白質只含有

-氨基酸組成，不含其它成分。例如：RNA酶、血清清蛋白、肌球蛋白、肌動蛋白、角蛋白等。

﹡結合蛋白由簡單蛋白與其它非蛋白成分結合而成，這些非蛋白成分包括糖、脂、核酸、色素等，又稱為輔基或配體。

糖蛋白：如細胞膜中的糖蛋白等。脂蛋白：如血清

-，

-脂蛋白等。核蛋白：如細胞核中的核糖核蛋白等。色蛋白：如血紅蛋白、葉綠蛋白和細胞色素等。四、蛋白質的分類2.按蛋白質的外形分類

﹡球狀蛋白質

外形接近球形或橢圓形，溶解性較好，能形成結晶，大多數蛋白質屬于這一類。但肌動蛋白屬于球狀蛋白卻不溶于水。

﹡纖維狀蛋白質分子類似纖維或細棒。它又可分為可溶性纖維狀蛋白質和不溶性纖維狀蛋白質。

不溶性纖維狀蛋白質：大多數纖維狀蛋白質屬此類，如膠原蛋白、彈性蛋白、角蛋白、絲蛋白等。可溶性纖維狀蛋白質：肌球蛋白和血纖蛋白原可溶于水。3.按多肽鏈條數分類﹡單體蛋白質僅含一條多肽鏈。﹡多聚蛋白質含兩條或多條多肽鏈。

例如：牛核糖核酸酶：一條多肽鏈胰島素：兩條〔兩種〕多肽鏈血紅蛋白：四條〔兩種〕多肽鏈

胰島素牛核糖核酸酶血紅蛋白五、蛋白質的分子結構層次一級結構(primarystructure)二級結構(secondarystructure)三級結構(tertiarystructure)四級結構(quaternarystructure)高級結構蛋白質的一級結構決定高級結構！第五節蛋白質的一級結構一、肽〔peptide〕1.肽的結構和命名肽是由一個氨基酸的-羧基與另一個氨基酸的-氨基脫水縮合而形成的無分支線形聚合物。其中的氨基酸單位稱氨基酸殘基。氨基酸間縮水形成的共價鍵稱肽鍵(peptidebond)。+-HOH甘氨酰甘氨酸肽鍵NH-CH-CHOHOOH甘氨酸甘氨酰甘氨酸*兩分子氨基酸縮合形成二肽，三分子氨基酸縮合那么形成三肽……*由十個以內氨基酸相連而成的肽稱為寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相連形成的肽稱多肽(polypeptide)。*多肽鏈(polypeptidechain)是指許多氨基酸之間以肽鍵連接而成的一種結構。N末端：多肽鏈中有自由氨基的一端C末端：多肽鏈中有自由羧基的一端多肽鏈有兩端氨基酸的順序是N端→C端的排列順序。如上述五肽可表示為：

Ser-Val-Tyr-Asp-Gly

絲氨酰纈氨酰酪氨酰天冬氨酰谷氨酸COOH２.肽鍵的結構特點：氮原子上的孤對電子與羰基具有明顯的共軛作用，肽鍵中的C-N鍵具有局部雙鍵性質，不能自由旋轉。所以連接在肽鍵兩端的基團處于一個平面上，這個平面稱為肽平面。在大多數情況下，相鄰肽平面以反式結構存在。

ＮＣＯ—C—NH—OOCa—CN—CaH鍵長介于單雙鍵之間O–—CNH—+雖是單鍵卻有雙鍵性質周邊六個原子在同一平面上前后兩個a-carbon在對角(trans)CNCHaNCOCa0.123nm0.132nm0.153nm0.147nmC-N0.149nmC=N0.127nm相關名詞：肽單元：參與肽鍵的6個原子被約束于一個平面上，與此相應的-Cα-CO-NH-Cα-那么稱為肽單元。多肽主鏈：在多肽鏈中由肽鍵連接的各氨基酸殘基形成的長鏈骨架(…Cα-CO-NH-Cα….)為多肽鏈的主鏈。或：肽鏈的骨干是由肽單元重復排列而成長鏈，稱為主鏈。多肽側鏈：在多肽鏈中的各氨基酸殘基所連接的側鏈基團

為多肽側鏈。或：氨基酸殘基的R-基連在主鏈上成為側鏈。說明：各種不同的肽鏈主鏈都是一樣的，但側鏈〔R-基〕

的順序即氨基酸的順序各不相同。３.肽的理化性質——類似于氨基酸性質１〕旋光性２〕兩性解離及等電點３〕化學反響

雙縮脲反響：含有兩個或兩個以上肽鍵的化合物與堿性硫酸銅作用，生成藍紫色的復合物，肽鍵越多顏色越深，受蛋白質特異性影響小，可用于肽和蛋白質定量測定及測定蛋白質水解程度。４.天然存在的活性肽在生物體中，多肽最重要的存在形式是作為蛋白質的亞單位。有許多分子量比較小的多肽以游離狀態存在，這類多肽通常都具有特殊的生理功能，常稱為活性肽。如：腦啡肽；激素類多肽；抗生素類多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。

①谷胱甘肽(glutathione,GSH)γ-GSH過氧化物酶H2O22GSH2H2OGSSGGSH復原酶NADPH+H+NADP+谷胱甘肽在體內參與氧化復原過程，作為某些氧化復原酶的輔因子，作用是保護巰基酶，或防止過氧化物積累。②抗生素類多肽短桿菌肽S

體內許多激素屬寡肽或多肽③激素類多肽二、蛋白質一級結構的測定1.蛋白質一級結構:

蛋白質分子中氨基酸殘基的排列順序，即氨基酸的線性序列。一級結構中包含的共價鍵主要指肽鍵和二硫鍵。在基因編碼的蛋白質中，這種序列是由mRNA中的核苷酸序列決定的。蛋白質的一級結構(Primarystructure)包括：(1)組成蛋白質的多肽鏈數目;(2)多肽鏈的氨基酸順序;(3)多肽鏈內或鏈間二硫鍵的數目和位置。★其中最重要的是多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質生物功能的根底。——2.蛋白質一級結構測定的意義①是推測蛋白質高級結構的分子依據②是理解蛋白質生理功能的分子根底③是說明遺傳疾病發生機理的分子手段④是研究生物進化的分子佐證

胰島素一級結構高級結構正常紅細胞與鐮刀形紅細胞的掃描電鏡圖鐮刀形紅細胞正常紅細胞-鏈N端氨基酸排列順序12345678Hb-A〔正常人〕Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys…Hb-S〔患者〕Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys…不同生物與人的Cytc的AA差異數目不同生物來源的細胞色素c中不變的AA殘基

14106100134323029271817675952514845413887848280706891GlyGlyPheCysGlyGlyGlyArgLysGlyCysLysPheHisProLeuGlyArgTyrAlaAsnTrpTyr707580LysLysLysProProTyrIleGlyThrMetAsnLeu血紅素

細胞色素c分子的空間結構不變的AA殘基35個不變的AA殘基，是CytC的生物功能所不可缺少的。其中有的可能參加維持分子構象；有的可能參與電子傳遞；有的可能參與“識別〞并結合細胞色素復原酶和氧化酶。3.一級結構測定的原那么和根本流程一級結構測定的原那么：將大化小，逐段分析，制成兩套肽片段，找出重疊位點，排出肽的前后位置，最后確定蛋白質的完整序列。目前往往采用從待測蛋白質的基因序列反推出蛋白質的一級結構。將肽段順序進行疊聯以確定完整的順序

將肽段分離并測出順序專一性裂解末端氨基酸測定拆開二硫鍵純蛋白質蛋白質順序測定根本戰略

通過核酸來推演蛋白質中的氨基酸序列按照三聯密碼的原那么推演出氨基酸的序列別離編碼蛋白質的基因測定DNA序列排列出mRNA序列一級結構測定的根本流程:

測定蛋白質的一級結構前的準備工作4.蛋白質的一級結構測定1〕多肽鏈的拆分——獲得單條線形多肽鏈由多條多肽鏈組成的蛋白質分子，必須先進行拆分。如：血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體等。

①拆分非共價鍵：可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理。②拆分二硫鍵：幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯在一起。可在8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的-巰基乙醇處理，使二硫鍵復原為巰基，然后用烷基化試劑保護生成的巰基，以防止它重新被氧化。拆分

★巰基的保護2〕N-末端和C-末端氨基酸殘基確實定——為氨基

酸序列排列建立兩個重要的參考點N端分析方法：

①二硝基氟苯法〔DNP法、DNFB法或FDNB法〕②丹磺酰氯法〔DNS法〕丹磺酰-氨基酸有很強的熒光性質③苯異硫氰酸(酯)法〔PI