第一節體液調節是通過化學信號實現的調節第一節體液調節是通過化學信號實現的調節第三章動物細胞工程第二節神經系統通過下丘腦控制內分泌系統第二節神經系統通過下丘腦控制內分泌系統第三節通過細胞融合可產生具有新特性的細胞目

錄細胞融合技術制備單克隆抗體單克隆抗體技術的應用與植物體細胞雜交技術中的原生質體融合類似，動物細胞工程中也包括細胞融合技術。

那么，兩個動物細胞是如何融合成一個細胞？融合技術有什么應用？1.概念：2.范圍：在一些融合因子的作用下，將兩個或多個細胞合并形成一個細胞的技術。細胞融合技術①基因型相同的細胞間②基因型不同的同種生物細胞間3.誘導方式？③親緣關系非常遠的不同種生物細胞間因為原生質體不會自動融合，想想植物細胞融合有哪些方法？①物理法：電刺激、離心、振動②化學法：聚乙二醇（PEG)1875年，科學家們首次觀察到了脊椎動物（蛙）血液細胞的融合現象。1958年，日本科學家崗田用滅活的仙臺病毒誘導人的腹水癌細胞融合成功。①物理法：電流刺激（電脈沖）、激光融合②化學法：聚乙二醇（PEG)③生物法：滅活的病毒（動物細胞融合特有）3.誘導方式一、兩個或多個動物細胞經誘導可融合形成一個細胞滅活的病毒誘導機理什么是滅活的病毒？滅活是指用物理或化學手段使病毒失去感染能力，但是并不破壞病毒的抗原結構。滅活的病毒顆粒黏附于細胞表面↓細胞膜被病毒顆粒穿通↓細胞膜連接↓細胞核融合，形成雜交細胞病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細胞膜上的糖蛋白發生作用，使細胞互相凝聚，細胞膜上的蛋白質分子和脂質分子重新排布，細胞膜打開，細胞發生融合4.誘導機理/原理：細胞膜出現一定程度損傷，細胞相互粘連而融合。細胞膜的流動性5.結果：形成的雜交細胞具有原來兩個或多個細胞的遺傳信息。6.意義：突破了有性雜交的局限，使遠緣雜交成為可能，克服遠緣雜交不親和7.應用：（1）在染色體基因定位上的應用（2）制備單克隆抗體植物體細胞雜交動物細胞融合原理細胞融合前的處理方法誘導細胞融合的方法細胞融合成功的標志主要用途意義細胞膜具有一定的流動性、植物細胞的全能性細胞膜具有一定的流動性用果膠酶和纖維素酶去除細胞壁用胰蛋白酶或膠原蛋白酶使細胞分散成單個細胞電融合法、離心法；聚乙二醇（PEG）融合法PEG融合法、電融合法、滅活病毒誘導法再生出細胞壁細胞核的融合獲得完整的雜種植株主要用于制造單克隆抗體打破生殖隔離，實現遠緣雜交育種，培育植物新品種突破了有性雜交的局限，使遠緣雜交成為可能2024/4/4動物細胞融合和植物體細胞雜交的比較二、細胞融合技術是制備單克隆抗體的基礎1.早期獲得抗體的方法向動物體內反復注射某種抗原從動物血清中分離所需抗體產量低、純度低、特異性差（能識別多種抗原）缺點：多克隆抗體思考：1.抗體的本質是什么？如何產生的？2.用傳統的方法如何獲取抗體？3.此方法能否快速、大量獲取我們想要的某種抗體？為什么？二、細胞融合技術是制備單克隆抗體的基礎2.單克隆抗體B淋巴細胞在體外培養條件下不能無限增殖克隆單一的B淋巴細胞，得到的細胞群就能分泌出化學性質單一、特異性強的抗體制備思路：困難：若要得到大量的單一抗體，我們該如何去做？資料：人們發現，在動物發生免疫反應的過程中，體內有上億種B淋巴細胞可以產生多達百萬種以上的特異性抗體，但是每一種B淋巴細胞只分泌一種化學性質單一、特異性強的抗體。要想獲得大量的單一抗體，必須用克隆單個B淋巴細胞形成細胞群。米爾斯坦科勒

由于發明了單克隆抗體的制備技術，米爾斯坦和科勒于1984年獲得了諾貝爾生理學或醫學獎大膽設想：B淋巴細胞骨髓瘤細胞（能產生抗體）（能大量增殖）融合細胞（既能產生抗體，又能大量增殖）

他們利用仙臺病毒使經羊紅細胞免疫的、從小鼠脾臟分離的B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合。壽命有限的B淋巴細胞與具有無限繁殖能力的骨髓瘤細胞融合，經篩選后就可以獲得既能產生特異性抗體，又能在正常培養條件下進行無限增殖的雜交瘤細胞。通過對雜交瘤細胞進行傳代培養，就能長久地得到針對羊紅細胞的單克隆抗體了。（1）單克隆抗體制備的過程：2024/4/4注射特定的抗原培養骨髓瘤細胞從脾中提取B淋巴細胞多種骨髓瘤細胞誘導融合將骨髓瘤細胞與B淋巴細胞融合能產生抗體，但不能大量增殖不能產生抗體，但能大量增殖PEG融合法、電融合法、滅活病毒誘導法目的是獲得產生特定抗體的B淋巴細胞多種雜交細胞：未融合的細胞B-骨、骨-骨、B-B、第一次篩選：用特定的HAT選擇培養基在該培養基上，未融合的親本細胞和融合的具有同種核的細胞都會死亡，只有融合的雜交瘤細胞才能生長多種雜交瘤細胞：（既能迅速大量增殖，又能產生抗體）（能產生所需抗體的雜交瘤細胞）此雜交瘤細胞包括能分泌所需抗體的細胞和產生其他抗體的細胞。如何篩選？閱讀教材P82-83課外讀多種雜交細胞：未融合的細胞B-骨、骨-骨、B-B、第一次篩選：用特定的HAT選擇培養基雜交瘤細胞：（既能迅速大量增殖，又能產生抗體）第二次篩選：克隆化培養、抗體檢測（可進行多次）抗體檢測呈陽性的雜交瘤細胞（分泌的抗體能與特定抗原結合）每一個孔中盡量只接種一個雜交瘤細胞克隆化培養多孔細胞培養板（能產生所需抗體的雜交瘤細胞）在該培養基上，未融合的親本細胞和融合的具有同種核的細胞都會死亡，只有融合的雜交瘤細胞才能生長抗體檢測板多孔細胞培養板陽性孔抗體檢測的方法——抗原-抗體雜交法將雜交瘤細胞群稀釋（極限稀釋），約每孔1個細胞進行培養一段時間后，檢測各孔上清液中細胞分泌的抗體上清液可與特定抗原結合的培養孔為陽性孔分泌抗體能跟特定抗原結合的細胞即為所需雜交瘤細胞知識拓展：篩選獲得能分泌所需抗體的雜交瘤細胞克隆培養抗體檢測呈陽性的雜交瘤細胞（分泌的抗體能與特定抗原結合）注射到小鼠腹腔內體外培養單克隆抗體從細胞培養液中提取從小鼠腹水中提取（能產生所需抗體的雜交瘤細胞）第一次篩選第二次篩選原因方法結果誘導融合后得到的細胞中，除雜交瘤細胞之外，還有未融合的親本細胞，也有融合的具有同種核的細胞由于小鼠在生活中還受到其他抗原的刺激，所以經第一次篩選之后獲得的雜交瘤細胞中有能產生其他抗體的細胞用特定的HAT選擇培養基進行篩選多孔細胞培養板培養，在每一個孔中盡量只接種一個雜交瘤細胞的情況下，進行克隆化培養和抗體檢測（進行多次篩選）篩選獲得雜交瘤細胞獲得足夠數量的能分泌所需抗體的雜交瘤細胞兩次篩選的比較應用到的技術：原理：

細胞膜具有一定的流動性、細胞增殖多種雜交細胞及未融合的細胞誘導

融合小鼠骨髓瘤細胞多種B淋巴細胞給小鼠注射特定抗原提取雜交瘤細胞第一次篩選用特定的選擇性培養基第二次篩選足夠數量的能產生所需抗體的雜交瘤細胞體外培養注射到小鼠腹腔大量單克隆抗體克隆化培養、抗體檢測（既能迅速大量增殖，又能產生抗體）（產生抗體）（能無限增殖）從腹腔液中提取從培養液中提取歸納：（可進行多次）動物細胞融合、動物細胞培養產生所需（特異性）抗體的雜交瘤細胞克隆培養的途徑：體外和體內將培養液離心獲取抗體，并進一步分離、純化、檢測便可獲得單克隆抗體可用于免疫標記測定，若用于日常診斷、或定性研究不需純化。（液體里還有各種氨基酸、維生素、指示劑蛋白質、核酸、毒素和病毒）純度高，可大量制備，在應用時具備特異性強、靈敏度高。如利用脊髓灰質炎病毒的單克隆抗體做診斷試劑（2）單克隆抗體的優點：(3)單克隆抗體的應用①廣泛用作診斷試劑②直接用于治療疾病。實例：利妥昔單抗（美羅華）是一種針對CD20抗原的人鼠嵌合型單克隆抗體，是第一個被FDA批準用于臨床治療的單抗。進入人體后能通過介導抗體依賴的細胞毒性作用、補體依賴的細胞毒性作用和抗體與CD20分子結合引起的直接效應，抑制細胞生長，改變細胞周期以及凋亡等方式殺死淋巴瘤細胞。使用高效的細胞毒素類藥物進行化療可以有效殺傷腫瘤細胞。但細胞毒素沒有特異性，在殺傷腫瘤細胞的同時還會對健康細胞造成傷害，這限制了它在臨床上的應用。抗體-藥物偶聯物（antibody-drugconjugates,ADC）通過將細胞毒素與能特異性識別腫瘤抗原的單克隆抗體結合，實現了對腫瘤細胞的選擇性殺傷。ADC通常由抗體、接頭和藥物(如細胞毒素)三部分組成，它的作用機制如下圖所示。抗體藥物接頭ADC被細胞吞噬釋放藥物溶酶體裂解細胞凋亡單克隆抗體+藥物=“生物導彈”(“生物導彈”—單抗導向，藥物為彈頭)優點：位置準確、療效高、副作用小③運載藥物：如ADC。思考：單克隆抗體的制備過程中的幾個問題：（2）兩次篩選的目的相同嗎？（1）給小鼠注射抗原的目的是什么？（3）三次培養的目的是什么？（4）該過程運用了哪些技術？動物細胞培養技術、動物細胞融合技術。誘導小鼠體內