GB/TXXXXX–2012GB/TXXXXX–2012蛋白酶K酶活力及雜質檢測方法1范圍本標準規定了蛋白酶K檢測原理、儀器設備及器具、主要試劑、分析步驟和結果分析。本標準適用于生化試劑蛋白酶K產品的生產、監督和檢測。2規范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法GB/Txxxx核糖核酸酶活力檢測GB/Txxxx脫氧核糖核酸酶活力檢測3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1蛋白酶K（proteinaseK）能水解天然角蛋白（keratin）的一種絲氨酸蛋白酶。3.2蛋白酶K酶活力單位（proteinaseKactivityunit）在57℃和pH8.0條件下，在1min內水解血紅蛋白產生相當于1μmol酚基氨基酸（由酪氨酸等同物表示）的酶量，為一個酶活力單位，以U表示。4原理蛋白酶K具有很高的水解活性，可催化脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵斷裂。它在57℃和pH8.0條件下，水解血紅蛋白底物產生含有酚基的氨基酸；在堿性條件下，可將福林（Folin）試劑還原，生成鉬藍與鎢藍，其顏色的深淺與酚基氨基酸含量成正比。通過在680nm測定其吸光度，得到酶解產生的酚基氨基酸的量，進而計算蛋白酶活力。5儀器設備及器具5.1恒溫水浴鍋：精度為±0.2℃。5.2pH計：精度為0.1pH單位。5.3分光光度計：波長范圍380~780nm，吸光度值精確至0.001。5.4比色皿：1cm。5.5電子天平：精度為0.0001g和0.01g。5.6高速離心機：最小離心力為8000×g，具1.5mL離心管。6主要試劑本方法所用試劑均為分析純，除特殊說明外，實驗用水均為GB/T6882規定的二級水。6.10.01mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液（Tris-HCl），pH8.0稱取三羥甲基氨基甲烷（Tris）12.11g，加入適量水使其溶解，定容至100mL，用濃鹽酸調至pH8.0，即成1mol/LTris-HCl緩沖液。再取1mL1mol/LTris-HCl緩沖液，加水定容至100mL，即成0.01mol/LTris-HCl緩沖液。6.20.4mol/L三氯乙酸溶液稱取三氯乙酸65.40g，用水溶解并定容至1000mL。6.31mol/LHCl溶液取8.50mL濃鹽酸加入到50mL水中稀釋，然后定容至100mL，得1mol/LHCl溶液。6.40.1mol/LHCl溶液取10.00mL1mol/LHCl溶液加水定容至100mL，得0.1mol/LHCl溶液。6.51%（w/v）血紅蛋白溶液準確稱取血紅蛋白1.000g，用0.01mol/LpH8.0的Tris-HCl緩沖液溶解，并定容至100mL。此溶液在4℃冰箱貯存，有效期為3天。6.60.4mol/L碳酸鈉溶液稱取無水碳酸鈉42.40g，用水溶解并定容至1000mL。6.7福林（Folin）試劑于2000mL磨口回流裝置加入鎢酸鈉（Na2WO4.2H2O）100.0g、鉬酸鈉（Na2MoO4.2H2O）25.0g、水700mL、85%磷酸50mL、濃鹽酸100mL。小火沸騰回流10h。取下回流冷卻器，在通風櫥中加入硫酸鋰（Li2SO4）50g、水50mL和數滴濃溴水。再微沸15min，以除去多余的溴，至冷卻后無綠色。加水定容至1000mL。混勻，過濾。試劑應呈金黃色。貯存于棕色瓶內，避光保存。使用時，用1份福林試劑與2份水混勻，制成稀福林試劑。也可將商品化福林試劑按照產品使用指南稀釋成稀福林試劑。6.8100μg/mLL-酪氨酸標準溶液稱取預先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，用20mL1mol/LHCl溶液溶解后，再用水定容至100mL，即為1mg/mLL-酪氨酸標準儲備溶液，在4℃冰箱貯存。臨用前，吸取1mg/mLL-酪氨酸標準儲備溶液10.00mL，用0.1mol/L鹽酸溶液定容至100mL，即得到100μg/mL的L-酪氨酸標準液。7分析步驟7.1核糖核酸酶（RNase）按GB/Txxxx-201x進行檢測。7.2脫氧核糖核酸酶（DNase）按GB/Txxxx-201x進行檢測。

7.3酶活力7.3.1標準曲線繪制按表1，在10mL容量瓶中配制L-酪氨酸標準工作溶液。表1L-酪氨酸標準工作溶液配制管號酪氨酸標準工作溶液的濃度（μg/mL）100μg/mL酪氨酸標準溶液（mL）水（mL）00.00.0010.00110.01.009.00220.02.008.00330.03.007.00440.04.006.00550.05.005.00660.06.004.00分別吸取L-酪氨酸標準工作溶液1.0mL于具塞試管中（每個濃度作2個平行），然后加入5.0mL碳酸鈉溶液和1.0mL稀福林試劑，混勻。將標準管同時置于40℃水浴，反應20min，取出，用冷水迅速冷卻至室溫，用分光光度計，在680nm波長下，以不含酪氨酸的0號管為空白，用1cm比色皿，測定吸光度（A）。以吸光度A為縱坐標，以L-酪氨酸的濃度C為橫坐標，繪制標準曲線（此線應通過零點）。得出線性回歸方程和回歸系數（R2）。回歸系數在0.9990及以上時，方可使用，否則應重做。新配制的福林試劑應制作新的標準曲線。7.3.2固體待測樣品制備稱取0.0050g固體酶，精確至0.0001g，用0.01mol/LpH8.0的Tris-HCl緩沖液溶解，并稀釋至酶濃度曲線中呈線性關系的酶濃度范圍內。7.3.3液體待測樣品制備吸取100μL液體酶，用0.01mol/LpH8.0的Tris-HCl緩沖液稀釋至酶濃度曲線中呈線性關系的酶濃度范圍內。7.3.4測定取3支10mL具塞試管，樣品空白管1支，樣品管2支。分別向3支試管中準確加入稀釋好的待測酶液1.0mL，在57℃下水浴預熱5min。向2支樣品管中加入1.0mL經同樣預熱的1%血紅蛋白溶液，準確計時反應10min；迅速、準確地向3支試管中加入2.0mL0.4mol/L三氯乙酸溶液；于樣品空白管中加入1.0mL1%血紅蛋白溶液，混勻。3支試管繼續在57℃下水浴10min，取出，迅速冷卻至室溫，11000×g離心5min。另取3支10ml具塞試管，樣品空白管1支，樣品管2支，分別吸取上述相應上清液1.0mL于3支試管，然后均加入5.0mL碳酸鈉溶液、1.0mL稀福林試劑，混勻，40℃水浴20min顯色。迅速冷卻至室溫。與此同時，另取1支試管，用水代替上清液做試劑空白，均加入5.0mL碳酸鈉溶液、1.0mL稀福林試劑，混勻，40℃水浴20min顯色，迅速冷卻至室溫。以試劑空白管調儀器零點，用分光光度計于波長680nm下，用1cm比色皿，分別測定樣品空白管（A0）和樣品管中樣液的吸光度（A）。將樣品管與樣品空白管吸光度之差取平均值，經線性回歸方程求解生成的酪氨酸濃度（C-C0）。8結果分析8.1酶活力計算按照式（1）計算： （SEQ標準自動公式\*ARABIC1）式中：X：蛋白酶K樣品的酶活力（U/mL或U/g）；C：樣品管的酪氨酸濃度（μg/mL）；C0：樣品空白管的酪氨酸濃度（μg/mL）；4：酶反應體系的總體積（mL）；N：酶樣品溶液的稀釋倍數；M：L-酪氨酸的摩爾質量（181.20g/mol）；10：反應時間（min）；Cs：酶樣品溶液的濃度（mL/mL或g/mL）。以平行樣的平均值為最終的酶活力測定值，計算結果保留整數位。8.2重復性在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差