IMAR與冠脈病變相關性的臨床研究及鐵調(diào)素與糖尿病心肌病關系的基礎研究研究背景急性冠脈綜合征(acutecoronarysyndrome,ACS)是冠心病的急性且嚴重類型,是全球范圍內(nèi)人群的主要死因之一。判斷冠狀動脈病變嚴重程度對ACS患者的治療選擇十分重要,是關鍵的臨床決策依據(jù)之一。冠狀動脈造影是評價冠脈狹窄部位和程度的金標準,但存在有創(chuàng)性、風險性,且花費較高,受限于醫(yī)療機構的條件及操作者的水平。因此,尋找一種無創(chuàng)且能早期檢測到的生物標志物用來評估冠狀動脈病變嚴重程度有十分重要的臨床意義。缺血修飾白蛋白(ischemiamodifiedalbummin,IMA)是人血清白蛋白(albumin,ALB)經(jīng)過缺血組織時發(fā)生結構改變而轉變而成的一種特殊白蛋白,可反映心肌缺血。人血清白蛋白包含—組位于氨基末端的氨基酸序列,是銅、鐵、鈷、鎳等過渡金屬離子的結合位點。當發(fā)生心肌缺血或缺血-再灌注時,增多的活性氧使血清白蛋白的氨基末端發(fā)生等結構改變,使其與銅、鐵、鈷、鎳等過渡離子的結合能力下降,成為IMA。心肌缺血數(shù)分鐘后IMA迅速增高,在心肌缺血的早期診斷中具有高度敏感性。但是,IMA在冠狀動脈病變程度中的預測價值仍有爭議。IMA的測定方法是采用白蛋白鈷結合(albumincobaltbinding,ACB)試驗,該方法受血清白蛋白水平的影響。白蛋白具有一定的抗氧化作用,能與自由基結合,而低白蛋白血癥是冠心病的獨立預測因子。因此,有研究將缺血修飾白蛋白/血清白蛋白比值(IMA/ALBratio,IMAR)作為IMA評估氧化應激水平及疾病嚴重程度的指標。目前尚無研究探究IMAR是否與冠脈病變嚴重程度存在相關性。因此,我們設計了本研究課題。我們進行了病例-對照研究,探討了IMAR與冠狀動脈病變嚴重程度評估中的臨床應用價值。研究目的(1)探討ACS患者血清IMA及IMAR水平;(2)研究IMAR和冠脈病變嚴重程度的關聯(lián)性;(3)比較IMA與IMAR在預測冠狀動脈病變嚴重程度中的價值。材料與方法我們制定了納入標準及排除標準,根據(jù)標準納入山東大學齊魯醫(yī)院診斷為ACS的住院患者219例,包括167例UA組患者,52例AMI組。選取同時段同醫(yī)療中心行冠狀動脈造影且冠狀動脈造影結果顯示無血管狹窄或血管狹窄<50%的患者46例作為對照組。收集患者住院期間病歷信息資料。包括一般情況、既往病史、行冠脈造影前的實驗室檢查、用藥史、冠狀動脈造影結果。根據(jù)造影結果計算Gensini評分,根據(jù)血清IMA及ALB水平計算IMAR。將所得數(shù)據(jù)用IBMSPSSStatistics24軟件進行統(tǒng)計學分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果(1)對照組、UA組及AMI組三組間的性別、年齡差異無統(tǒng)計學意義。與對照組相比,SBP在UA組(P<0.01)及AMI組顯著升高(P<0.05),心率在AMI組顯著降低(P<0.05)。與對照組相比,AMI組合并高血壓的比率(P<0.05)升高,而UA組及AMI組合并糖尿病的比率(P<0.001)均顯著升高。實驗室指標方面,與對照組相比,UA組HDL-c(P<0.01)顯著降低,而兩組間其他實驗室指標的差異均未無統(tǒng)計學意義。與對照組相比,AMI組FBG(P<0.05)、CK-MB(P<0.0505)、cTnI(P<0.00001)、AST(P<0.00001)、WBC(P<0.0000)、NEU(P<0.001)、、NEU%(<0.01)均顯著升高,而HDL-c(P<0.001)顯著降低,兩組其他實驗室指標差異無統(tǒng)計學意義。與UA組相比,AMI組FBG(P<0.05)、CK-MB(P<0.01)、cTnI(P<0.001)、AST(P<0.001)、WBC(P<0.001)、NEU(P<0.001)、、NEU%(P<0.01)顯著升高,而HDL-c(P<0.01)及ALB(P<0.01)顯著降低。用藥史方面,與對照組相比,UA組應用阿司匹林(P<0.001)、氯吡格雷/替格瑞洛(P<0.001)、β3受體阻滯劑(P<0.001)、ACEI/ARB(P<0.01)、利尿劑(P<0.001)、硝酸酯類(P<0.05)、他汀類藥物(P<0.001)比率顯著升高,而AMI組應用阿司匹林(P<0.001)、氯吡格雷或替格瑞洛(P<0.001)、β3受體阻滯劑(P<0.001)、ACEI/ARB(P<0.01)、利尿劑(P<0.001)、硝酸酯類(P<0.05)、他汀類藥物(P<0.001)及LMWH(P<0.001)比率顯著升高。而與UA組相比,AMI組應用ACEI/ARB(P<0.01)、LMWH(P<0.001)的比率顯著升高.(2)IMA水平與年齡呈正相關(r=0.161,P=0.009),與TC(r=-0.140,P=0.023)、TG(r=-0.167,P=0.007)、HDL-c(r=-0.244,P<0.001)、ALT(r=-0.176,P=0.004)、RBC(=-0.289,P<0.001)以及Hb(r=-0.328,P<0.001)呈負相關。HDL-c(β=-0.242,P<0.001)、TG(β=-0.126,P=0.034)、Hb(β=-0.347,P<0.001)、NEU%(β=-0.163,P=0.007)、氯吡格雷/替格瑞洛(β=-0.143,P=0.015)是IMA的獨立影響因素。IMAR水平與年齡呈相關(r=0.186,P=0.002),與HDL-c(r=-0.234,P<0.001)、ALT(r=-0.178,P=0.004)、RBC(=-0.304,P<0.001)及Hb(r=-0.367,P<0.001)呈負相關。HDL-c(β=-0.257,P<0.001)、Hb(β3=-0.347,P<0.001)、PLT(β=-0.163,P=0.005)、ALT(β=-0.263,P=0.003)、AST(β=0.312,P<0.001)、氯吡格雷/替格瑞洛(β=-0.143,P=0.013)是IMAR的獨立影響因素。(3)在未控制混雜因素的情況下,與對照組比較,UA組IMA水平、IMAR水平差異均無統(tǒng)計學意義,而AMI組IMA(P<0.01)、IMAR(P<0.001)均顯著增高。ACS組內(nèi),UA組、AMI組兩組間的IMA及IMAR水平差均無統(tǒng)計學差異。控制混雜因素后,仍得到相同結果。(4)在ACS組,IMA與Gensini評分無顯著相關性,IMAR與Gensini評分有一定的正相關性(r=0.215,P=0.009),IMAR((β=0.180,P=0.009)及年齡(β=0.180,P=0.009)是Gensini評分的獨立影響因子。結論(1)急性心肌梗死患者IMA及IMAR水平分別相較于不穩(wěn)定型心絞痛及非冠心病人群升高。(2)不穩(wěn)定型心絞痛患者與對照人群IMA及IMAR水平無顯著差異。(3)IMA與冠脈病變嚴重程度無顯著相關性,而IMAR與冠狀病變嚴重程度存在正相關,可反映冠脈狹窄程度。研究背景糖尿病是當前威脅全球人類健康的慢性代謝性疾病,預計到2035年,全球患病人數(shù)將升至59.2億。糖尿病心肌病(diabeticcardiomyopathy,DCM)是糖尿病常見的心血管并發(fā)癥之一,是導致糖尿病患者高心力衰竭患病率和高死亡率的重要原因。因此,防治DCM的發(fā)生發(fā)展具有非常重要的臨床意義。DCM以心臟舒張性功能障礙為特征,主要病理變化包括心肌細胞凋亡和心肌纖維化,其發(fā)生及調(diào)控機制復雜,目前尚未完全明了。現(xiàn)有證據(jù)表明,氧化應激在DCM心肌細胞凋亡和心肌纖維化兩方面均發(fā)揮重要作用。鐵是人體必需的微量元素之一,參與多種生理生化過程,但作為一種氧化還原活性金屬,可通過Haber-Weiss反應和Fenton反應產(chǎn)生大量活性氧(ROS)引起機體的氧化應激。據(jù)報道,鐵過載性心肌病(ironoverloadcardiomyopathy,IOC)是依賴頻繁輸血的地中海貧血和鐮刀細胞貧血患者的主要死因。在IOC動物模型中,心肌鐵過載誘發(fā)氧化應激反應,引起的心肌細胞凋亡和心肌纖維化等病理改變,最終導致左室舒張及收縮功能減退。已有研究結果表明,DCM心臟中存在鐵的異常沉積。因此,我們將鐵代謝做為深入研究DCM發(fā)生發(fā)展的新的切入點。鐵調(diào)素(Hepcidin,Hep)是一種多肽類物質(zhì),是一種重要的全身鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)激素。有研究發(fā)現(xiàn),2型糖尿病和妊娠期糖尿病患者的血清Hep水平升高。Hep對細胞鐵代謝的作用依賴于細胞膜表面鐵輸出者——膜鐵轉運蛋白(Ferroportinl,Fpn1)。Hep與細胞膜表面的Fpn1結合后,后者將在溶酶體內(nèi)內(nèi)化和降解,鐵輸出通道的減少將阻止細胞內(nèi)鐵的外排,造成鐵的異常分布。Hep通過Fpn1造成細胞內(nèi)外鐵分布異常,進而影響靶器官的功能,是Hep參與疾病的病理生理基礎。肝臟是鐵調(diào)素的主要合成部位,心肌細胞亦表達Hep。近期研究顯示,心肌特異性Hamp(編碼Hep的基因)敲除的小鼠心肌細胞內(nèi)鐵含量顯著減少。然而Hep作為調(diào)節(jié)心肌細胞鐵代謝的關鍵分子對DCM心臟結構與功能的影響目前尚不明確。因此,本研究以2型糖尿病小鼠為研究對象,應用基因沉默技術探討鐵代謝調(diào)控分子Hep在DCM中的作用及潛在機制。研究目的(1)探討心肌鐵代謝與糖尿病心肌病的關系;(2)探究Hep基因沉默對對糖尿病心肌病的心臟結構和功能的影響;(3)探究Hep基因沉默改善糖尿病心肌病的機制。材料與方法(1)7周齡雄性自發(fā)性2型糖尿病C57BLKSdb/db小鼠36只適應性喂養(yǎng)3周后,隨機分為3組:糖尿病組、糖尿病空載體組、糖尿病Hep基因沉默組。采用尾靜脈注射法給予糖尿病Hep基因沉默組小鼠注射攜帶Hep特異性shRNA的rAAV9,給予糖尿病空載體組小鼠注射同等量空病毒,給予糖尿病組小鼠注射生理鹽水。繼續(xù)喂養(yǎng)16周后處死小鼠,留取血清及心臟標本。(2)實驗末采用小動物超聲行超聲心動圖檢測。以左室長軸面行M型超聲檢查,以心尖四腔心切面行脈沖多普勒及組織多普勒檢查,評估心臟結構、舒張及收縮功能。(3)實驗末抽取小鼠靜脈血測定各項生化指標:總膽固醇(totalcholesterol,TC)、甘油三醋(triglycerides,TG)、空腹血糖(fastingbloodglucose,FBG)、高密度脂蛋白膽固醇(highdensitylipoproteincholesterol,HDL-c)、低密度脂蛋白膽固醇(lowdensitylipoproteincholesterol,LDL-c)、游離脂肪酸(freefattyacid,FFA)及空腹胰島素(fastinginsulin,FINS),計算胰島素敏感指數(shù)(insulinsensitivityindex,ISI)。(4)對小鼠心肌組織分別進行蘇木素-伊紅染色(HE染色)、Masson復合染色、天狼星紅染色、油紅O染色。計算心臟質(zhì)量/體質(zhì)量(HW/BW),應用圖像分析儀分析心肌膠原體積分數(shù)(CVF)、血管周圍膠原面積/管腔面積(PVLA/LA)和心肌脂質(zhì)含量。(5)免疫組織化學染色觀察Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白及鐵代謝相關蛋白(Hep、Fpn1、H-鐵蛋白及L-鐵蛋白)的分布情況。(6)取新鮮左室心肌組織,提取蛋白,應用蛋白印跡(westernblot)技術檢測Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白、Hep、Fpn1、H-鐵蛋白及L-鐵蛋白抗體在心肌中的表達情況。(7)取心肌組織勻漿上清,用超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathioneperoxidase,GSH-Px)測試盒檢測SOD及GSH-Px活力。(8)脫氧核苷酸原位末端標記(TUNEL)染色檢測左室心肌組織凋亡細胞。結果(1)實驗結束時,三組小鼠體重、FBG、FINS、ISI、TC、TG、HDL-c、LDL-c及FFA的差異無統(tǒng)計學意義。(2)實驗末,超聲心動圖顯示,與糖尿病空載體組相比,糖尿病Hep基因沉默組小鼠心臟舒張功能指標E’/A’顯著升高(0.98±1.34vs.1.36±0.28,P<0.05)、E/E’顯著降低(30.26±5.07vs.23.05±3.97,P<0.05)。而兩組小鼠LVEDd、IVSd、LVPWd、LVEF、FS的差異無統(tǒng)計學意義。(3)左室心肌HE染色顯示,糖尿病組與糖尿病空載體組小鼠心肌細胞扭曲、排列紊亂,Hep基因沉默組心肌細胞排列較為整齊。天狼星及Masson染色顯示,與糖尿病空載體組比較,糖尿病Hep基因沉默組心肌纖維化程度減輕,血管周圍膠原面積/管腔面積(P