生物大分子（biopolymer、biomacromolecule)

是指生物體內由分子量較低的基本結構單位首尾相連形成的多聚化合物。包括核酸、蛋白質脂類、多糖以及復雜大分子。

自然界典型的生物大分子的分子量在10～103ＫＤ之間。轉錄翻譯復制基因表達調控核酸種類分布性質結構功能遺傳信息傳遞、表達核酸概況基因突變與重組研究方法第二章生物大分子第一節DNA與染色體第二節基因組的結構與功能第三節DNA的復制第四節DNA的損傷、修復第五節DNA的轉座第六節RNA核酸（nucleicacid）

是以核苷酸為基本組成單位的生物大分子。依據其化學組成,天然存在的核酸有兩類，一類為脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid,DNA)，另一類為核糖核酸（ribonuleicacidRNA)。第一節

核酸概況

一

核酸的化學組成

核酸核糖脫氧核糖核苷酸磷酸核苷戊糖堿基AGTCU核酸的化學組成1.1

元素組成C、H、O、N、P（9~10%）1.2

分子組成——堿基(base)：嘌呤堿，嘧啶堿——戊糖(ribose)：核糖，脫氧核糖——磷酸(phosphate)核酸單核苷酸磷酸堿基戊糖核苷核酸的化學組成嘌呤(purine)

腺嘌呤(adenine,A)鳥嘌呤(guanine,G)1.2.1堿基

嘧啶(pyrimidine)胞嘧啶(cytosine,C)尿嘧啶(uracil,U)胸腺嘧啶(thymine,T)1.2.2戊糖DNA中戊糖的為β-D-2-脫氧核糖(deoxyribose)RNA中的戊糖的為β-D-核糖(ribose)

β-D-2-脫氧核糖β-D-核糖1.2.3核苷（nucleoside）核苷戊糖+堿基糖與堿基之間的C-N鍵，稱為C-N糖苷鍵1’2’3’4’5’(OH)1’2’3’4’5’(OH)核苷（nucleoside）堿基戊糖糖苷鍵purine：N9-C1’pyrimidine：N1-C1’HHHHHHHHH核苷（脫氧核苷）和磷酸以磷酸酯鍵連接形成核苷酸（脫氧核苷酸）。1.2.4核苷酸（nucleotide）堿基、戊糖、核苷、核苷酸的關系

NitrogenousbasePentosesugarHOCH2HOHDoxyribose(inDNA)HOCH2HOOHRibose(inRNA)PhosphatePyrimidinesCytosineThymineUracilCUTPurihesAdenineGuanineAG核酸磷酸核苷戊糖堿基

3.核酸是遺傳物質遺傳物質必須具備以下特點:①必須穩定地含有關于有機體細胞結構、功能、發育和繁殖的各種信息。②必須能精確地復制，這樣后代細胞才能具有和親代細胞相同的信息。③必須能夠變異，如果沒有變異，生物就不能改變、適應，進化也不能發生。orand可分離遺傳物質的發現(1)1952年,Hershey的噬菌體感染實驗DNA是遺傳物質遺傳物質的發現(2)遺傳物質的發現(3)1956年AGierer和GSchraman發現從煙草花葉病毒分離的RNA也能侵染植物,產生典型的煙草花葉病毒所致的病斑,如用RNA酶處理,則RNA就失去感染的能力,而分離的蛋白部分沒有這種感染力。這個實驗的結果證明了煙草花葉病毒的遺傳物質是RNA，而不是蛋白質。二核酸的一級結構

單核苷酸通過3’,5’-磷酸二酯鍵連接成大分子——多核苷酸。5’-末端：P3’-末端：OH

DNA和RNA的一級結構是指核苷酸的數量和排列順序。

核苷單核苷酸3′5′磷酸二酯鍵5′3′糖苷鍵酯鍵AGP5

P

TPGPCPTPOH3

書寫方法5

pApCpTpGpCpT-OH

3

5

ACTGCT

3

2.2

DNA的二級結構定義：指兩條多核苷酸鏈反向平行盤繞所產生的雙螺旋結構。分類：右手螺旋：A-DNA，B-DNA左手螺旋：Z-DNA

2.2.1DNA螺旋的幾種構象及其動態平衡

（一）Watson–Crick右手雙螺旋結構（B-DNA構象）相對濕度為92%時，DNA鈉鹽纖維為B-DNA構象。在天然情況下，絕大多數DNA以B構象存在。

1，主鏈:

2，堿基對

3，螺距

4，大溝和小溝脫氧核糖-磷酸-為骨架,排列在外側堿基堆積在內側

DNA雙螺旋結構模型要點（Watson,Crick,1953）DNA分子由兩條相互平行但走向相反的脫氧多核苷酸鏈組成，兩鏈以-脫氧核糖-磷酸-為骨架，以右手螺旋方式繞同一公共軸盤。螺旋直徑為2nm，形成大溝(majorgroove)及小溝(minorgroove)相間。

DNA雙螺旋結構模型要點（Watson,Crick,1953）堿基垂直螺旋軸居雙螺旋內側，與對側堿基形成氫鍵配對（互補配對形式：A=T;G

C）。相鄰堿基平面距離0.34nm，螺旋一圈螺距3.4nm，一圈10對堿基。2.0nm小溝大溝DNA的雙螺旋結構的形成5′3′5′3′5′3′5′3′磷酸核糖堿基T-A堿基對C-G堿基對氫鍵維持雙鏈橫向穩定性，堿基堆積力維持雙鏈縱向穩定性。

1.兩條反向平行的脫氧核苷酸鏈繞同一中心軸，形成右手螺旋的結構。

2.磷酸-戊糖骨架位于外側，兩條鏈上的堿基以A=T、G

C相連，構成堿基平面，位于螺旋內側。

3.螺距為3.4nm，旋轉一周為10個堿基對。螺旋直徑為2.0nm。

4.majorgrooveminorgroove5.氫鍵：維持雙螺旋橫向穩定

6.堿基堆砌力：維持縱向穩定DNA二級結構要點總結維持DNA結構穩定的作用力

(1)堿基堆積力(basestackingforce)堿基堆積力是維持DNA結構穩定的主要作用力。堿基有規律的堆積可以使堿基之間發生締合，這種作用力稱為堿基堆積力。由于堿基的層層堆積，在DNA分子內部形成一個疏水核心區，有助于氫鍵的形成。

(2)氫鍵互補堿基對之間形成氫鍵：G≡C，A=T

(3)離子鍵 磷酸基團上的負電荷與介質中的陽離子之間形成離子鍵，消除了DNA自身各部位之間因負電荷而產生的斥力，增加了DNA分子的穩定性。DNA雙螺旋的不同構象

Watson和Crick提出的DNA雙螺旋結構屬于B型雙螺旋，它是以在生理鹽溶液中抽出的DNA纖維在92%相對濕度下進行X-射線衍射圖譜為依據進行推測的，這是DNA分子在水性環境和生理條件下最穩定的結構。在不同的濕度和離子強度時，還可形成A、C、Z等各種象。DNA結構的多態性

在以鉀或銫作反離子，相對濕度為75%時，DNA分子的X-射線衍射圖給出的是A構象。它是B-DNA螺旋擰得更緊的狀態。DNA-RNA雜交分子、RNA-RAN雙連分子均采取A構象。A-DNA構象

1979年，Wang和Rich等人在研究人工合成的CGCGCG單晶的X-射線衍射圖譜時出人意料地發現這種六聚體的構象與上面講到的完全不同。它是左手雙螺旋，與右手螺旋的不同是螺距延長(4.5nm左右)，直徑變窄(1.8nm)，每個螺旋含12個堿基對，分子長鏈中磷原子不是平滑延伸而是鋸齒形排列，有如“之”字形一樣，因此叫它Z構象(英文字Zigzag的第一個字母)。

Z-DNA構像

Z-DNA是左手螺旋，構象中的重復單位是二核苷酸而不是單核苷酸；而且Z-DNA只有一個螺旋溝，它相當于B構象中的小溝，它狹而深，大溝則不復存在。進一步的分析還證明，Z-DNA的形成是DNA單鏈上出現嘌呤與嘧啶交替排列所成的， 比如CGCGCGCG或者CACACACA。Z-DNA構象的特點A-DNA和Z-DNA當DNA處于轉錄狀態時，DNA模板鏈與由它轉錄所得的RNA鏈間形成的雙鏈就是A-DNA。Z-DNA構象在轉錄區上游離轉錄區近時，抑制轉錄。只有當Z－DNA變成B－DNA后，轉錄才被活化。

Z－DNA構象有轉錄起始的調節活性。DNA雙螺旋結構的多樣性三種DNA雙螺旋構象比較ABZ外型粗短適中細長螺旋方向右手右手左手螺旋直徑2.55nm2.37nm1.84nm堿基直升0.23nm0.34nm0.38nm每圈堿基數1110.412堿基傾角1901090糖苷鍵構象反式反式C、T反式，G順式大溝很窄很深很寬較深平坦小溝很寬、淺窄、深較窄很深回文結構和鏡像重復DNA堿基順序相關的特殊二級結構:1)回文序列:是指DNA某一片段旋轉1800后,順序不變的序列，回文序列中的單鏈可形成發夾結構。雙鏈可形成十字架結構。這種發夾結構或十字架結構在大腸桿菌細胞DNA中已有發現.核酸分子中的回文序列

回文序列中的單鏈可形成發卡結構

雙鏈回文序列可形成十字架結構*鏡像重復存在于同一股上的某些DNA區段的反向重復序列。

AATTCAAGGGAGAAGTATAGAAGAGGGAAGGATCTTAAGTTCCCTCTTCATATCTTCTCCCTTCCTAG三鏈DNA既可以是B-DNA與另一條DNA鏈結合成的鏈間的三鏈DNA，又可以是B-DNA與其自身的一條鏈結合形成的鏈內的三鏈DNA。

三鏈DNA分子內三鏈DNA于1987年由Mirkin在超螺旋中發現。其形成要求雙螺旋中存在連續的嘌呤或嘧啶序列，而且必須是鏡像重復序列。DNA分子內的三鏈結構

多聚嘌呤多聚嘧啶DNA分子間的三鏈結構DNA三鏈間的堿基配對T-A-TC-G-C

三螺旋DNA可能參與基因轉錄及復制的調控，其作用仍待進一步證實。由于基因調控部位常富含多聚嘌呤-多聚嘧啶區，如果另一單鏈DNA結合到這些區域形成三鏈DNA，在一定條件下可能會阻止一些序列特異性蛋白質的結合，如轉錄起始因子等，從而影響基因的表達。這也為腫瘤等疾病提供新的潛在的治療手段，如設計針對特定DNA靶位的人造寡核苷酸片斷或其衍生物，和這些靶位點特異結合后調節某些基因的表達，抑制細胞分裂或殺死這些非正常細胞。三鏈DNA的生物學功能四.DNA的三級結構

在DNA二級結構基礎上，雙螺旋的扭曲或再次螺旋就構成了DNA的三級結構，包括不同二級結構單元間的相互作用、單鏈與二級結構單元間的相互作用以及DNA的拓撲特征。常見的三級結構有：1.超螺旋

2.染色體和核小體DNA超螺旋結構

超螺旋

當DNA分子的兩端是固定的，或是環狀分子，則這種額外的張力就不能釋放掉，DNA分子就會發生扭曲，用以抵消張力。這種扭曲稱為超螺旋，即雙螺旋的螺旋。

在生物體內，絕大多數的DNA是以超螺旋的形成存在的。螺旋和超螺旋電話線螺旋超螺旋環狀DNA形成的超螺旋超螺旋結構的特點：致密性

所有細菌、某些病毒以及真核細胞中的線粒體或葉綠體中的DNA都是環形分子。正超螺旋(positivesupercoil)盤繞方向與DNA雙螺旋方同相同負超螺旋(negativesupercoil)盤繞方向與DNA雙螺旋方向相反DNA超螺旋結構形成的意義

使DNA形成高度致密狀態從而得以裝入核中；

推動DNA結構的轉化以滿足功能上的需要。如負超螺旋分子所受張力會引起互補鏈分開導致局部變性，利于復制和轉錄。DNA雙螺旋染色單體超螺線管螺線管串珠狀多核小體核小體染色體與DNA的關系染色體與DNA的關系

細胞周期

染色質和染色體

染色體（chromosome）是細胞在有絲分裂時遺傳物質存在的特定形式，是間期細胞染色質結構緊密包裝的結果。

染色質（chromatin）是細胞間期細胞核內能被堿性染料染色的物質。基本化學成分為脫氧核糖核酸核蛋白，它是由DNA、組蛋白、非組蛋白和少量RNA組成的復合物。

染色體的化學成分及組成DNA

組蛋白非組蛋白

少量RNA化學成分核小體核心DNA組蛋白H2A、H2B、H3、H4連接段DNA180-200bp組蛋白：Hl、H2A、H2B、H3及H4染色體中的蛋白質6.8:140:11000:18000:1DNAdoublehelixNucleosome(10nmfiber)30nmFiberLoopsILoopsIIchromosome組蛋白的一般特性①進化上的極端保守性②無組織特異性③肽鏈上氨基酸分布的不對稱性④組蛋白的修飾作用⑤富含賴氨酸的組蛋白H5

非組蛋白

一般特性：

①非組蛋白的多樣性非組蛋白的量大約是組蛋白的60%～70%，但它的種類卻很多，約在20-100種之間，其中常見的有15-20種。

②非組蛋白的組織專一性和種屬專一性。

影響DNA高級結構的酶

L值的改變需要至少一條DNA鏈斷裂一次。斷裂造成的DNA自由末段的一斷可繞著另一端旋轉，隨后被重新連接，DNA拓撲異構酶通過催化此類反應將DNA從一種拓撲結構轉變成另一種。（一）I型DNA拓撲異構酶（二）II型DNA拓撲異構酶（三）DNA拓撲異構酶催化反應的實質原核生物兩類拓撲異構酶

拓撲異構酶I

通過使DNA的一條鏈發生斷裂和再連接，能使超螺旋DNA轉變成松弛型環狀DNA，每催化一次可消除一個負超螺旋，反應無需供給能量。

拓撲異構酶II

則剛好相反，可使松弛型環狀DNA轉變成負超螺旋DNA，可引入負超螺旋。拓撲異構酶II亦稱促旋酶，它可以使DNA的兩條鏈同時斷裂和再連接，當它引入超螺旋時需要ATP提供能量。

細胞內兩類拓撲異構酶的含量受嚴格的控制，使細胞內DNA保持在一定的超螺旋水平。拓撲異構酶Ι通過使DNA的一條鏈發生斷裂和再連接，能使超螺旋DNA轉變成松弛型環狀DNA，每催化一次可消除一個負超螺旋，反應無需供給能量

原核拓撲異構酶I的作用機制連接數=n連接數=n+1穿越斷口和使兩端連接切割abcd拓撲異構酶Ⅱ可使松弛型環狀DNA轉變成負超螺旋DNA，可引入負超螺旋。拓撲異構酶II亦稱促旋酶，它可以使DNA的兩條鏈同時斷裂和再連接，當它引入超螺旋時需要ATP提供能量。（三）DNA拓撲異構酶催化反應的實質：

其本質是先切斷DNA的磷酸二酯鍵，改變DNA的鏈環數后再連接，兼具DNA內切酶和DNA連接酶的功能。然而這些酶并不能連接事先已經存在的斷裂DNA，即其斷裂及連接反應是相互偶聯的。DNA的變性和復性

變性（Denaturation)

DNA雙鏈的氫鍵斷裂，最后完全變成單鏈的過程稱為變性。

增色效應(Hyperchromaticeffect)在變性過程中，260nm紫外線吸收值先緩慢上升，當達到某一溫度時驟然上升，稱為增色效應。融解溫度（MeltingtemperatureTm)

變性過程紫外線吸收值增加的中點稱為融解溫度。生理條件下為85-95℃影響因素：G+C含量，pH值，離子強度，尿素，甲酰胺等復性（Renaturation)熱變性的DNA緩慢冷卻，單鏈恢復成雙鏈。減色效應（Hypochromaticeffect)

隨著DNA的復性，260nm紫外線吸收值降低的現象。

C值反常現象（C-valueparadox)C值是一種生物的單倍體基因組DNA的總量。

真核細胞基因組的最大特點是它含有大量的重復序列，而且功能DNA序列大多被不編碼蛋白質的非功能DNA所隔開，這就是著名的“C值反常現象”。

C值矛盾第二節基因組的結構與功能

基因（gene）：是核酸的中貯存遺傳信息的遺傳單位，是貯存有功能的蛋白質多肽鏈或RNA序列信息及表達這些信息所必需的全部核苷酸序列。

從生物化學上來說指的是一段DNA或RNA（病毒）順序，該順序可以產生或影響某種表型，可以由于突變生成等位基因變異體。

從遺傳學上來說代表1個遺傳單位、1個功能單位、1個交換單位或1個突變單位。

基因組（gencme）：細胞或生物中，一套完整單倍體遺傳特質的總和（包括一種生物所需的全套基因及間隔序列）稱為基因組。

基因組的結構主要指不同的基因功能區域在核酸分列中的分布和排布情況，基因組的功能是貯存和表達遺傳信息。

原核生物的染色體及其基因

原核生物染色體特征：原核生物DNA一般位于核區里（擬核）。細菌DNA是一條共價、閉合雙鏈分子，通常也稱為染色體。一般情況下含有一條染色體。原核細胞都是單倍的。大都帶有單拷貝基因；整個染色體DNA幾乎全部由功能基因與調控序列所組成；幾乎每個基因序列都與它所編碼的蛋白質序列呈線性對應狀態。（無內含子）原核細胞原核細胞染色體上的DNA存在形式原核生物基因組結構與功能的特點1.基因組通常僅由一條環狀雙鏈DNA分子組成。2.基因組中只有1個復制起點。3.具有操縱子結構。4.基因序列是連續的，無內含子結構。5.編碼區和非編碼區（主要是調控序列）在基因組中約各占50%。（5%，95%）6.基因組中的重復序列很少。7.具有編碼同功酶的基因（isogene）8.細菌基因組中存在可移動的DNA序列，包括插入序列和轉座子。9.原核基因的基本結構特點：

●基因組很小，大多只有一條染色體●

結構簡煉●存在轉錄單元(trnascriptionaloperon)

多順反子(polycistron)X174D-E-J-F-G-HmRNA蛋白J、F、GHDEE.coli色氨酸操縱子9個順反子9個酶(第六章)1、原核生物基因組結構特點原核生物和真核生物基因組結構特點比較

●有重疊基因（Sanger發現）基因內基因部分重疊基因一個堿基重疊

真核生物的染色體及其基因

真核細胞染色體特征：真核細胞的體細胞染色體都是二倍體，而性細胞的染色體為單倍體。

1、分子結構和數目相對穩定;

2、能夠自我復制;

3、能夠指導蛋白質的合成，從而控制整個生命過程;

4、能夠產生遺傳的變異。真核細胞真核細胞染色體上的DNA存在形式

真核生物基因組的結構

(一)真核基因的基本結構

1.結構基因、內含和外顯子、斷裂基因。

（1）結構基因（structuralgene）指能轉錄成為mRNA、rRNA或tRNA的DNA順序。

（2）內含子和外顯子真核生物的結構基因是不連續的，編碼序列被非編碼序列打斷，在編碼序列之間的序列稱為內含子（intron），編碼序列稱為外顯子（extron）。

（3）斷裂基因（splitgene）在真核類結構基因組中，編碼順序被許多稱為內含子的非編碼區分割成幾段稱之。順式調控元件

順式調控元件（cis—actingelements）指與結構基因表達調控相關，能夠被基因調控蛋白特異性識別和結合的DNA序列。能與順式作用元件結合調節基因轉錄活性的蛋白質因子稱為反式作用因子（trans—actingfactors）。順式調控元件有：（1）啟動子（promoter）（2）上游啟動子元件（upstreampromoterelementsups）（3）反應元件（responseelements）（4）增強子（enhancer）和沉默子（silencer）（5）加尾信號真核生物基因組結構特點●真核基因組結構龐大3×109bp、染色質、核膜●單順反子●基因不連續性斷裂基因（interruptedgene）、內含子(intron)、外顯子(exon)●非編碼區較多多于編碼序列(9:1)●含有大量重復序列■不重復序列/單一序列：在基因組中有一個或幾個拷貝。真核生物的大多數基因在單倍體中都是單拷貝的。如：蛋清蛋白、血紅蛋白等功能：主要是編碼蛋白質。

■中度重復序列：在基因組中的拷貝數為101~104。如：rRNA、tRNA

一般是不編碼蛋白質的序列，在調控基因表達中起重要作用

■

高度重復序列：拷貝數達到幾百個到幾百萬個。

●衛星DNA：A?T含量很高的簡單高度重復序列。第三節DNA的復制“DNA復制機構”的研究思路：命題→提出假說：半保留復制→研究方案、選材、研究路線、技術方法→進行試驗→得出結論。定義：由親代DNA生成子代DNA時，每個新形成的子代DNA中，一條鏈來自親代DNA，而另一條鏈則是新合成的，這種復制方式稱半保留復制。DNA的半保留復制（semi-conservativereplication）DNA的半保留復制

DNA復制的三種假設DNA復制的三種假設實驗證據（1958Meselson和Stahl）：

MatthewMesselsonFranklinStahl1958年，Meselson和Stahl的著名實驗：同位素標記，密度梯度離心。CsCI密度梯度離心實驗測定半保留DNA復制的結果DNA的半保留復制“Heavy”DNA“Hybrid”

DNA“light”DNA“Hybrid”DNADNA半保留復制的生物學意義：

DNA的半保留復制表明DNA在代謝上的穩定性，保證親代的遺傳信息穩定地傳遞給后代。

DNA的半不連續復制（semidiscontinuousreplecation)

Okazaki（岡崎）于1968年通過H3–脫氧胸苷（H3–dT）標記實驗證實了半不連續復制。

1.實驗材料：T4感染的E.coli野生型phage–T4mutantT4（連接酶突變）

2.實驗系統：H3–dT標記E.coli；phage–T4感染；密度梯度離心。檢測標記DNA在不同時間合成的情況。

3.實驗結果：

⑴短時間內，首先合成較短的DNA（岡崎片段），接著出現較大分子DNA。

⑵突變型連接酶T4中，大片段DNA很少或無。

⑶半不連續合成，放射性標記一半出現于短片段（岡崎片段），另一半出現在長片段DNA中。結論：DNA復制是半保留半不連續復制。DNA復制的連續的、半不連續的和不連續的模型邊解鏈邊復制

DNA的復制是邊解鏈邊合成

⑴實驗證據：SV40復制的早期電鏡照片，復制部分和未復制部分。⑵復制從原點（origin)的特定位點開始，形成復制眼eplicationeye),逐步向未復制部分擴大。復制叉（reolixationfork)在非復制DNA的旁邊復制的DNA被看成是復制眼⑶單向或雙向復制放射活性標記的不同密度可被用于區別不定向和雙向復制復制可能是不定向或雙向的，這決定于在起始點形成1或2個復制叉。

實驗：SV40為環形分子，5224bp，上有1個ECORⅠ切點。復制中，用ECORⅠ切復制中的SV40，得到復制眼大小不同的系列DNA分子，可看到隨復制眼擴大，兩側DNA變短，說明復制從原點開始：①雙向進行大多數DNA分子如此，兩側對稱，雙向不對稱。②單向進行兩側不對稱，滾筒式也屬單向復制。③真核一般為多起點復制。起始點的位置和復制叉的數量決定復制的限制性片段的種類，通過它的電泳途徑分開。復制單位

1.復制子：由一個原點（origin)引發的復制，稱為一個復制子，即一個復制單位。包含一個origin和一個terminus。

原核，只有一個復制原點，因此只有一個復制子。

真核，具有多個復制原點，因此有多個復制子。

2.染色體DNA復制子一般只復制一次。

3.染色體外遺傳元件的復制子

染色體外遺傳元件包括：

原核生物細胞中的質粒，噬菌體。

真核生物細胞中的線粒體、葉綠體、病毒。

染色體外遺傳元件一般為單復制子（只有一個origin),但為多次復制，為多拷貝。

4.染色體DNA與染色體外元件復制是否同步

真核生物的線粒體和葉綠體復制一般與核DNA同步或稍滯后，原核生物的染色體DNA和質粒（噬菌體）一般不同步，但整合后同步。

整合前質粒為θ式或滾筒式復制，整合后為一個復制子。質粒為雙向復制。

實驗：E.coli溫敏型突變體。

30℃復制正常，42℃時，E.coli復制起動受阻，代之以質粒origin開始的單向復制。

說明復制起始是受調控的。DNA復制系統的酶和蛋白因子

DNA復制系統涉及多種酶和蛋白因子，真核生物復制系統組分更復雜，原核生物復制系統組分如下：

DNA聚合酶（校正功能的酶）

引物酶（多組分）

解鏈蛋白

拓撲異構酶（解旋）

連接酶

除去引物的酶拓撲異構酶（topoisomerase)

⑴拓撲異構體：具有不同螺旋數的同一DNA分子兩種異構體（topoisomer)

⑵拓撲異構酶：可使DNA的兩種拓撲異構體互變的酶。

功能：

與DNA形成共價結合中間體，使DNA磷酸二酯鍵斷裂，形成DNAnick，DNA的一條鏈進行解旋旋轉而改變DNA分子的拓撲狀態。

參與復制、轉錄、重組。效應：拓撲異構酶可使DNA發生：

連環化（catenate)

脫連環化(decatenate)

打結（knot)

解結（unknot)拓撲異構酶的種類：Ⅰ型和Ⅱ型。

Ⅰ型：MW=100kD，單肽鏈，含3–4個Zn。作用：每次改變一個連環數。

結合DNA，使該處熔解。

形成酶－DNA復合物。

切割雙鏈中的一股，使DNA中的一股鏈穿越切割點。

斷裂單鏈連接。

Ⅱ型：也稱旋轉酶。廣泛存在于各種生物中。

作用：使正超螺旋轉化為負超螺旋，每次改變兩個連接數I型拓撲異構酶作用機理示意圖拓撲異構酶Ⅱ的作用機制拓撲異構酶Ⅱ的作用機制

DNA鏈解旋，解鏈的酶和蛋白

1.DnaB：解旋酶，引發體成員，使復制叉形成，并在以后結合于一個復制叉，推動復制叉向前延伸（helicase)。需ATP。

生物體內的解旋酶有多種，有些解旋酶還參與DNA修復，重組等非復制過程。

2.SSB：單鏈結合蛋白（single–strandbindingprotein)

SSB結合于解旋的DNA雙鏈的單股鏈上。SSB的作用：

使DNA單鏈保持一種伸展構象，能作為模板；

使解開的單鏈不形成發卡結構；

保護DNA單鏈不受Dnase水解。SSB特性：

結合DNA單鏈有協同性（coperativity)；

SSB可重復使用，在滯后鏈上不斷擺動，使岡崎片段合成。

引物酶及引發體

1.DNA合成以RNA為引物

實驗：Reiji以α–32P–NTP標記＋未標記TP為底物。

引發合成后，用稀堿處理，32P在DNA中出現，證明RNA為引物。

2.引物酶（primerase)

DnaG

RNA引物由引物酶合成。

意義：減少致死突變。DNA合成中最初幾個核苷酸正確性遠比其后的低。引物RNA隨后被降解，從而減少了復制錯誤。

3.引發體（primosome)

引物酶不能單獨合成RNA引物，必須與其它蛋白因子形成引發體才能引發RNA引物合成。

DNA聚合酶（DNApolymerase)

原核DNA聚合酶有三種：DNApolymerase

Ⅰ

DNApolymeraseⅡ

DNApolymeraseⅢDNApolymeraseⅢ全酶組成：

①在復制叉處為一二聚體

②核心酶（coreenzyme)：α、ε、θα：聚合作用ε：3′→5′外切θ：與亞基結合有關

③DNApolymeraseⅢ的亞基γ、δ、δ′、χ、ψ提高反應速率和持續性。

④β-亞基：使DNApol能結合在DNA上。

β-亞基結合于DNA時消耗ATP：ATP→ADP＋Pi

β-亞基如同一個夾子（clamp)，使DNApolⅢ結合于DNA。

⑤τ亞基：使兩個DNApol單體形成二聚體，分別在復制叉的兩個鏈上作用。在若干階段，DNApolⅢ全酶被裝配，產生一個酶復合體，它合成兩個新鏈的DNA。polⅢ的每一個催化中心合成一個子鏈。DnaB負責在復制叉上向前移動。引發體拖著一條DNA鏈通過。連接酶（ligase)

DNA隨后鏈上的復制是不連續的，各合成的片段需要連接酶連接，連接酶的反應條件：

被連接的兩鏈必須與另一鏈（模板鏈）互補；

兩鏈相鄰；

每次只能連接一個切口；

使一條鏈的5′-P與另一鏈的3′-OH形成磷酸二酯鍵。T4Ligase特性：

可連接DNA與DNA，也可連接RNA與RNA。

可連接DNA中的單鏈切口，也可連接粘性末端切口和平齊末端切口。原核DNA的復制

原核生物DNA的復制過程是復雜的順序性過程，涉及多種酶和蛋白因子，復制過程是多種酶和蛋白因子協同作用的結果。

復制的過程DNA復制起始DNA鏈的延伸切除RNA引物，填補缺口，連接相鄰的DNA片段復制的起始

E.coli的DNA復制起始指從origin（原點）開始的起始過程，這一過程不同于隨后鏈上岡崎片段的起始。

E.coli的DNA復制起始包括：

起始位點識別－解鏈－解旋－引發體組裝

1.復制原點（origin)

E.coli復制原點（oriC）位于天冬氨酸合成酶和ATP合成酶操縱子間，共245bp。組成：

含有2個系列的重復單位，3×13bp4×9bp均富含A/ToriC在不同原核生物中有同源性細菌的復制原點A為構成DnaA蛋白識別位點的9bp重復單位，箭頭表示富含AT的重復單位；n代表任何核苷酸。9bp（A位點）為DnaA蛋白識別位點。復制起始

⑴DnaA識別并結合于oriC的9bp的重復單位，每20－40個DnaA形成大的復合物，負超螺旋oriC包裹在外，HU蛋白參與并促進這一過程。

⑵上述復合體使13bp重復單位熔解。用核酸酶P1（可作用于ssDNA）證明解鏈部分約為45bp。

⑶DnaB（解螺旋酶）和DnaC（引發體成員）蛋白進入熔解區形成前引物復合體。

⑷引發體其他成員，主要是DnaG（引物酶）參入成引物體。

⑸SSB和旋轉酶（拓撲異構酶）參入。

⑹引發體合成先導鏈的RNA引物。

⑺DNApolymeraseⅢ組裝和復制叉上二聚體形成。

⑻在RNA引物3′端DNA開始聚合。DNA復制的延伸

1.復制體（replisome）的形成。起始復制形成的復制酶和相關蛋白在復制叉形成的超分子結構，在不同系統（噬菌體、E.coli、動物、動物病毒）中的復制體組分雖有差異，但功能十分相似。

復制體包括兩種：

1.Ori的復制體復制起始后延伸過程的復制體。

2.延伸過程的復制體

非對稱的DNApolⅢ二聚體

DnaB

隨從鏈上的SSB和引發體

3.延伸過程

前導鏈和滯后鏈由同一polⅢ二聚體延伸

主導鏈(leadingstrand)：以親代DNA3′－5′鏈為模板，不連續合成

滯后鏈（laggingstrand)：以親代的5′－3′鏈為模板，不連續合成。

DNA滯后鏈合成與主導鏈不同步。

⑴位于滯后鏈的引發體，在合成引物后DnaG（引物酶）可將模板鏈提起（或成環）。使RNA引物3′端位于DNApolⅢ處polⅢ的每一個催化中心合成一個子鏈。DnaB負責在復制叉上向前移動。引發體拖著一條DNA鏈通過。

⑵DNApolⅢ在RNA引物3′端延伸DNA隨從鏈。

⑶解鏈的滯后模板鏈被SSB結合，保持模板為單鏈狀態，并保護其不被核酸酶水解。

⑷隨岡崎片段的延伸，SSB被priA除去，此過程需ATP供能。核心聚合酶與β–卡箍在岡崎片段完成時是分離的，在開始時重新締合。復制叉處前導鏈和隨后鏈同時復制的工作模型復制的終止

關于復制終止的研究，無論真核或原核都有不少研究資料，但也有很多細節未搞清。

E.coliDNA的復制終止機制：

1.E.coliDNA的復制終止終點

AATTAGTATGTTGTAACTAAAGT

TTAATCATACAACATTGATTTCA在E.coli中復制終止點遠離復制叉真正相遇的位置

復制叉在此位點相遇（forksmeet）。

終止序列可被tus蛋白（tus基因編碼）識別，并結合于其上。

2.終止的調節：在終止點Forksmeet兩側各有幾個短序列，如：terE.D.A.terC.B。當一側復制叉前進的快，而另一側前進的慢時，快側復制酶則會在ter位點停止，等待直到慢側跟上時。以上似乎構成一個“replicationforktrap”。

上述ter大約相距100kb3.二個復制叉相距約100kb時速度放慢，通過ter來協調兩復制叉到達終點的時間。Tus不對稱地結合在ter上和只在一個方向上阻止復制。DNA復制的保真機制

長期進化過程中，使生物體DNA復制過程形成了一系列保真機制，保證復制準確，遺傳穩定。

1.DNApolⅠ和Ⅲ的3′－5′活性DNApolⅠ有兩個結構域：

⑴大結構域含一個荷正電，直徑2nm的裂縫，是DNA結合部分。DNA一旦結合，裂縫即被關閉，這時，DNA只能在裂縫中前后滑動。

⑵小結構域含核苷酸結合部位，兩結構域相距3nm。

⑶當新合成的DNA中含錯配核苷酸對時，雙螺旋發生變形，因而不能在裂縫中向前滑動，只能后移，這時3′－5′外切酶激活，切除錯配核苷酸。

⑷錯配核苷酸切除后，聚合反應繼續進行。3′外切核酸酶對復制的校對作用

2.RNA引物起始復制，引物最終除去，減少錯配。開始合成錯配率高，短核苷酸序列中的錯配不易校正。

3.修復系統有多種機制和酶

真核生物的DNA復制

真核生物的復制子

復制時期S期細胞周期四個時相多個復制起始點

多個復制子（replicon)復制起點復合物

在酵母中，與ARS結合的是MW～400kD的蛋白ORC。ORC（originrecognitioncomplex）。

ORC由6個蛋白組成，其結合于A1和鄰近的B1元件上，識別了ori的同時保護了ori區。ORC在整個細胞周期中都與ARS結合。

轉錄因子ABF1結合到B3位點，上述促進和增強了起始作用。極小的原點在由13mer和9mer重復區之間的距離確定真核的復制酶及蛋白因子

1.真核生物DNA聚合酶

對真核DNApol了解較少，其原因是：

研究材料突變體少。

酶純化困難。真核DNApol種類

DNApolα：含量最高，負責合成RNA引物和iDNA（initiatorDNA,起始DNA）。形成RNA–iDNA引物，無3′－5′活性。

∴錯配頻率高，具引物酶活性。

DNApolδ：無合成引物功能，有3′－5′外切活性，負責合成延伸前導鏈和滯后鏈的岡崎片段（延伸）。

DNApolβ和ε：可能與修復有關。

DNApolγ：是存在于線粒體中的DNA復制酶。與復制有關的細胞因子

PCNA(proliferatingcellnuclearantigen；增殖細胞核抗原)同源三聚體復合物，結構為環形。功能類似于E.coliDNApolⅢβ(clamp)，使DNApolδ有持續合成能力。

RFC（復制因子C；ReplicationfactorC）功能：⑴依賴于DNA的ATPase，其ATP酶活性由PCNA激活。

⑵引物合成后取代polα，使polδ繼續延伸DNA。

RNaseHⅠ/FEN1(flapendonuclease；RNaseHI：內切酶切除5′端RNA引物，但剩余引物最后一個N。FEN1：5′－3′外切酶，切去引物最后一個N。

④Dna2：解旋酶/FEN1（內切酶活性）Dna2解旋酶：依賴DNA的ATPase活性，使δ合成的片段從模板DNA上置換下前一個岡崎片段的引物，形成flap，再由FEN1內切酶活性切除引物。

⑤連接酶I：連接兩個岡崎片段。

真核生物DNA復制

1.起始：Polα→RFC→組裝PCNA·polδ·RFC復合物

2.RNA－iDNA引物

3.DNApolα/δ轉換

4.岡崎片段的引物切除和片段連接

SV40的前導鏈至少能連續合成5～10kb。

滯后鏈：新的岡崎片段合成時，在遇到前一個岡崎片段時停止。RNaseHI/FEN1切除引物。由DNApolα合成的iDNA在Dna2解旋作用后被新生的岡崎片段置換，再被FEN1切除，形成的空隙由DNApolδ（或ε）負責填補。（實際合成中，后一個岡崎片段和前一個岡崎片段引物后是連續的？）。

連接酶I連接岡崎片段。真核生物端粒的復制

1.端粒（telomere)

端粒是真核染色體的末端序列。

端粒的生物學功能是保持染色體的穩定，它決定著細胞的壽命。

2.在DNA復制中線性DNA末端可能變短的問題

DAN復制需要引物，而RNA引物最終被降解，可能導致DNA端部不斷變短，信息丟失。

3.端粒的結構

⑴DNA端粒由簡單而串聯重復的序列組成

人和其他脊椎動物：AGGGTT

纖毛原生動物四膜蟲：GGGGTTGGGGTTTT面包酵母：G1－3TG1－5A

富含G；

長度可達幾百到幾千堿基對。

⑵端粒DNA序列有取向性：染色體末端，富含G的單鏈為5′－3′延伸，并長于富含C的單鏈12－16net。

⑶染色體末端與特定蛋白形成復合物。

⑷端粒的不尋常結構：vInvitro(體外，實驗室條件下）可產生G－G配對。

3′端12～16bp突出序列形成回折結構，甚至形成4鏈結構，其中G形成G四聯體，并為K+或Na+穩定，且四聯體上、下堆積。

端粒的復制：

端粒酶：端粒酶攜有一短的RNA分子，AccccAAc，可與G重復序列配對。

端粒酶的作用機制：酶的RNA分子與端粒DNA配對，以RNA為模板，進行類似逆轉錄合成DNA→酶解離，再配對→延伸端粒，反復可達數百次。

端粒酶活性：在生殖細胞中有活力，在體細胞中無活性或活性低。

端粒酶在細胞永生化和腫瘤增殖的維持中起重要作用。

原癌蛋白，雌激素等很多因子可激活端粒酶。四膜蟲中端粒的形成真核生物中DNA的復制特點1、真核生物每條染色體上有多個復制起點，多復制子2、真核生物染色體在全部復制完之前,各個起始點不再重新開始DNA復制；而在快速生長的原核生物中，復制起點可以連續開始新的復制(多復制叉)。真核生物快速生長時，往往采用更多的復制起點。3、真核生物有多種DNA聚合酶。

DNA復制的其它方式

1.線性雙鏈

2.環狀DNA復制

θ型，雙向

滾筒式，單向

D型，單向，在動物線粒體中有。

滾動循環產生一個多聚單鏈尾巴。滾動循環可用于不同的目的，這依賴于移出尾巴的命運……φX174RF是一個合成單鏈病毒圓環的模板腺病毒DNA的復制是分別從分子的兩端起始并通過鏈的移動繼續進行雙鏈環狀、θ型復制、雙向等速DNA損傷的來源DNA突變DNA修復第四節DNA的損傷、突變、修復1.DNA損傷的來源⑴物理因素：如，電離輻射⑵化學因素：

①烷化劑

硫酸二甲酯、甲烷磺酸甲酯（MMS）

使堿基烷基化，如產生7－甲基G、m7G、m3A。導致復制時堿基錯配。

②堿基類似物5－BrU－T轉換。

③黃曲霉素B1·2－2－酰－氨基芴、苯并芘插入移碼

④亞硝酸鹽使A、C、G脫氨基形成U、I、X。

⑶堿基的自發改變和損傷

復制堿基錯配堿基互變異構：酮式→醇式

DNApol、核酸酶、其他復制因子突變。

DNA的自發損傷。

⑷氧自由基傷害

3.堿基缺失和插入4.嘧啶二聚體T－T5.DNA鏈斷裂電離輻射或博萊霉素2.DNA突變1.點突變：突變由單一堿基改變產生缺失轉換（transition)

PY1→PY2顛換（transversion)

Py(Pn)→Pn(Py)基因突變的類型2.移碼突變3.校正突變4.點突變的結果

⑴沉默突變

⑵致死突變

⑶滲漏突變

⑷進化突變DNA修復系統功能錯配修復糾正錯配堿基切除修復切除突變的堿基核甘酸切除修復修復被破壞的DNADNA直接修復修復嘧啶二體或甲基化DNADNA的修復1、錯配修復●Dam甲基化酶使母鏈位于5’GATC序列中腺甘酸甲基化●甲基化緊隨在DNA復制之后進行●根據復制叉上DNA甲基化程度，切除尚未甲基化的子鏈上的錯配堿基

根據母鏈甲基化原則找出錯配堿基的示意圖發現錯配堿基在水解ATP的作用下，MutS，MutL與堿基錯配點的DNA雙鏈結合MutS-MutL在DNA雙鏈上移動，發現甲基化DNA后由MutH切開非甲基化的子鏈

甲基化指導的錯配修復示意圖錯配堿基位于切口3’下游端，錯配堿基位于切口5’上游端，（1）堿基切除修復一些堿基在自發或悠變下會發生脫酰胺，然后改變配對性質，造成氨基轉換突變腺嘌呤變為次黃嘌呤與胞嘧啶配對鳥嘌呤變為黃嘌呤與胞嘧啶配對胞嘧啶變為尿嘧啶與腺嘌呤配對2.切除修復胞嘧啶去氨基生成尿嘧啶如果復制發生就會產生一個突變.糖甘水解酶識別改變了的堿基，把堿基從N-β-糖苷鍵處切下來，在DNA鏈上形成去嘌呤或去嘧啶位點，統稱為AP位點。由AP磷酸內切酶將受損核甘酸的糖甘-磷酸鍵切開。DNA連接酶連接利用DNA聚合酶I切除損傷部位，補上核苷酸（2）核苷酸切除修復1）通過特異的核酸內切酶識別損傷部位2）由酶的復合物在損傷的兩邊切除幾個核苷酸3）DNA聚合酶以母鏈為模板復制合成新子鏈4）DNA連接酶將切口補平識別損傷部位損傷的兩邊切除幾個核苷酸DNA聚合酶以母鏈為模板復制合成新子鏈DNA連接酶將切口補平3、重組修復和sos修復4、DNA的直接修復（光修復）在DNA光解酶的作用下將環丁烷胸腺嘧啶二體和6-4光化物還原成為單體甲基轉移酶使O6-甲基鳥嘌呤脫甲基生成鳥嘌呤，防止G-T配對第五節

DNA的轉座（一）基本概念：DNA的轉座：由可移位因子介導的遺傳物質重排現象。轉座子（transposon）：存在與染色體DNA上可自主復制和位移的基本單位。（二）轉座子的類型和結構特征原核生物轉座子的類型：1、插入序列(insertionalsequence,IS)2、復合轉座子(compositetransposon)3、TnA家族1、插入序列(IS)IS是最簡單的轉座子，不含有任何宿主基因，它們是細菌染色體或質粒DNA的正常組成部分。

λ：：IS1轉座子在序列末端有倒置重復序列。在這個例子中靶位點有5bp堿基，轉座子末端有9bp。復合轉座子是一類帶有某些抗藥性基因（或其他宿主基因）的轉座子，其兩翼往往是兩個相同或高度同源的IS序列2、復合轉座子(compositetransposon)(三）轉座作用的機制復制性轉座子非復制性轉座子反轉錄病毒整合入宿主DNA中的分子機制，其本質是轉座。反轉錄轉座子（retrotransposon）：指通過RNA為中介，反轉錄成DNA后進行轉座的可動元件第六節RNA的結構與功能StructureofRNARNA的一般結構特征1）主要存在于細胞質中。2）單鏈分子，堿基組成不遵守Chargaff規則。3）堿基U代替了T。4）不如DNA穩定。RNA上C2’-OH是游離的，易發生不良反應。RNA的一級結構

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