———附件5光反應性活性氧（ROS）測定試驗方法ReactiveOxygenSpecies(ROS)AssayforPhotoreactivity1范圍本方法規定了化妝品用化學原料光反應性活性氧（ROS）測定試驗的基本要求和方法。本方法適用于預測化妝品用化學原料的潛在光毒性。2試驗目的預測化妝品用化學原料是否具有潛在光毒性。3定義下列術語和定義適用于本方法。3.1光反應性Photoreactivity化學物質由于吸收光子而與另一個分子發生反應的性質。3.2光毒性Phototoxicity皮膚一次接觸化學物質后，繼而暴露于紫外線照射下所引發的一種皮膚毒性反應，或者全身應用化學物質后，暴露于紫外線照射下發生的類似反應。本方法所述光毒性包括光刺激性、光過敏性和光遺傳毒性。3.3輻照度Irradiance照射到某一表面的紫外線或可見光的強度，單位為瓦每平方米（W/m2）或毫瓦每平方厘米（mW/cm2）。3.4光照劑量Doseoflight照射到某一表面的紫外線或可見光的量[=強度×時間（秒）]，單位為焦耳每平方米（J/m2）或焦耳每平方厘米（J/cm2）。3.5活性氧種類ReactiveOxygenSpecies，ROS活性氧種類，包括單線態氧和超氧陰離子。3.6單線態氧SingletOxygen，SO由光輻照化學物質通過Ⅱ型光化學反應產生的一種自由基。3.7超氧陰離子SuperoxideAnion，SA由光輻照化學物質通過I型光化學反應產生的一種自由基。4試驗原理一些具有光反應性的化學物質暴露于紫外線時，吸收某一波長光子，誘導發色團激發，激發能量轉移到氧分子上，發生光化學反應，產生活性氧（包括單線態氧SO和超氧陰離子SA），活性氧是光毒性反應中的重要中間物質。單線態氧和咪唑反應生成的過氧化物中間體對N,N-二甲基-4-亞硝基苯胺（RNO）具有漂白作用，使其在440nm下的吸光度降低。超氧陰離子與氯化硝基四氮唑藍（NBT）反應生成NBT+，其在560nm波長下具有光吸收。本試驗方法通過分光光度法測定化學物質經紫外線照射后對RNO在440nm下吸光度的減少及對NBT+在560nm下吸光度的增加來判斷該化學物質是否具有光反應性。5試劑和材料除另有規定外，本方法所用試劑均為分析純或以上規格，水為GB/T6682規定的一級水。所有試劑應在配制后1個月內使用，并且在使用前應超聲處理，以免物質析出、沉淀對試驗造成影響。主要試劑配制方法如下：5.1磷酸二氫鈉。5.2磷酸氫二鈉。5.3N,N-二甲基-4-亞硝基苯胺（RNO）。5.4咪唑。5.5氯化硝基四氮唑藍（NBT）。5.6pH7.4的20mmol/L磷酸鈉緩沖液（NaPB）稱取593mgNaH2PO4·2H2O（CAS：13472-35-0）和5.8gNa2HPO4·12H2O（CAS:10039-32-4），加入約900mL水，混勻，用1mol/L的HCl將pH值調節為7.4，定容至1000mL后混勻。于2℃~8℃冰箱或室溫保存。5.70.2mmol/LN,N-二甲基-4-亞硝基苯胺（RNO，CAS：138-89-6）稱取3mgRNO，溶于100mL20mmol/L的磷酸鈉緩沖液中，充分混勻。于2℃~8℃冰箱避光保存。5.80.2mmol/L咪唑（CAS：288-32-4）稱取13.6mg咪唑，溶于10mL20mmol/L的磷酸鈉緩沖液中，充分混勻，得到20mmol/L咪唑溶液。用20mmol/L的磷酸鈉緩沖液將20mmol/L咪唑溶液稀釋100倍，充分混勻。于2℃~8℃冰箱避光保存。5.90.4mmol/L氯化硝基四氮唑藍（NBT，CAS：298-83-9）稱取32.7mgNBT，溶于100mL20mmol/L的磷酸鈉緩沖液中，充分混勻。于2℃~8℃冰箱避光保存。5.10溶劑的選擇優先使用分析級二甲基亞砜（DMSO）。對于不溶于DMSO的受試物，可使用20mmol/L的磷酸鈉緩沖液作為溶劑。如果受試物在DMSO和磷酸鈉緩沖液中不溶或不穩定，也可使用其他溶劑，但應保證受試物在所選溶劑中穩定，且參考化學物質的SO值和SA值應在附錄A規定的范圍內。5.11待測化學物質溶液的配制待測化學物質的分子量應是已知的。測試終濃度為200μmol/L，如果在200μmol/L濃度下的反應混合物有沉淀、著色或其他干擾等現象，則可以使用20μmol/L為終濃度進行測試。當待測化學物質在20μmol/L的終濃度下得到陽性結果，表示該物質具有光反應性；但在濃度低于20μmol/L下得到陰性結果，不能表示該物質無光反應性。待測化學物質溶液應現用現配，所有操作均應避免在強紫外線和強可見光照射（例如頭頂燈下或在自然光暴露的窗戶附近工作），以避免在試驗前待測化學物質發生光激活或光降解。待測化學物質在試管中稱重，加入5.10項溶劑，渦旋混勻，超聲5-10min，配制成10mmol/L（終濃度200μmol/L）。當終濃度200μmol/L的反應混合物在光照前觀察到沉淀、著色或其他干擾等現象時，需將10mmol/L的溶液用DMSO稀釋成1mmol/L溶液（終濃度20μmol/L）。對于不溶于DMSO的化學物質，使用其他溶劑（如磷酸鈉緩沖溶液）時，須使得反應混合物中含有20μLDMSO（2%，v/v）。5.12陰性對照及陽性對照以奎寧鹽酸鹽二水合物（CAS：6119-47-7）作為陽性對照，以二苯甲酮-4（CAS：4065-45-6）作為陰性對照。用DMSO按與受試物相同的方法將陽性對照和陰性對照配制成10mmol/L的儲備溶液，分裝后于-20℃冰箱凍存，于使用當天解凍，避免反復凍融，1個月內使用完畢。6儀器和設備6.1太陽光模擬器6.1.1選擇合適的光源用于提供紫外線和可見光的照射，通過濾光片減少波長小于290nm的UVC，使光源盡量接近室外日光。推薦的測試條件如下：配備濾光片的太陽模擬器（減少紫外線波長<290nm）（見附錄B）—輻照度：1.8mW/cm2至2.2mW/cm2，照射1小時（例如，AtlasSuntestCPS+的指標設置值為250W/m2），—UVA光照劑量：6.5J/cm2至7.9J/cm2（見附錄B）。配備濾光片的太陽模擬器（減少紫外線波長<300nm）（見附錄B）—輻照度：3.0mW/cm2至5.0mW/cm2，照射1小時（例如，SericSXL-2500V2），—UVA光照劑量：11J/cm2至18J/cm2（見附錄B）。6.1.2測試條件根據實際選擇合適具體條件。6.1.3ROS的產生受溫度影響，太陽光模擬器應配備溫度控制裝置，光照期間溫度在20℃~29℃。6.2反應容器推薦使用石英反應容器（規格見附錄C），避免液體蒸發以及由于塑料蓋造成的UV損失。也可使用其他UV透射率大于95%的蓋子或密封件替代。實驗室使用其他容器時，應使用附錄A中的參考化學物質（序號1-17號）確定合適的儀器輻照度及光劑量。6.3酶標儀。6.4UVA紫外照度計。6.5顯微鏡。7分析步驟7.1將下列成分在避光條件下混合：7.1.1溶劑為DMSO的受試物：單線態氧SO超氧陰離子SA20mmol/LNaPB480μL0.2mmol/L咪唑250μL0.2mmol/LRNO250μL10或1mmol/L受試物20μL20mmol/LNaPB855μL0.4mmol/LNBT125μL10或1mmol/L受試物20μL7.1.2溶劑為NaPB的受試物：單線態氧SO超氧陰離子SA20mmol/LNaPB460μL0.2mmol/L咪唑250μL0.2mmol/LRNO250μLDMSO20μL10或1mmol/L受試物20μL20mmol/LNaPB835μL0.4mmol/LNBT125μLDMSO20μL10或1mmol/L受試物20μL以20μL溶劑替代受試物，作為空白對照。渦旋或超聲5~10min后，將200μL反應混合物加入到96孔板中，每組設置3個平行。96孔板加樣詳見附錄D。7.2在100倍顯微鏡下檢查反應混合物中各組分溶解情況。如有沉淀、析出等現象，需降低受試物濃度重新檢測或停止檢測。將96孔板震蕩5s后，使用分光光度計或酶標儀測定光照前SO檢測孔在440nm下的吸光度及SA檢測孔在560nm下的吸光度。7.3將96孔板置于石英反應器中，或蓋上其他具有高UV透射率的蓋子或密封件，置于太陽光模擬器中照射1h。記錄光照前后的溫度。7.4完成光照后，將96孔板震蕩1min，使用分光光度計或酶標儀測定光照后SO檢測孔在440nm下的吸光度及SA檢測孔在560nm下的吸光度。步驟流程圖見附錄E8分析結果表述8.1SO值和SA值的計算計算受試物及對照品的SO值和SA值，根據三個平行孔的數據計算平均值和標準偏差。1．根據光照前后SO測試孔在440nm下的吸光度計算受試物的SO值SO式中：A440(-)：光照前440nm下的吸光度A440(+)：光照后440nm下的吸光度a：光照前空白對照440nm下的吸光度（平均值）b：光照后空白對照440nm下的吸光度（平均值）2．根據光照前后SA測試孔在560nm下的吸光度計算受試物的SA值SA式中：A560(-)：光照前560nm下的吸光度A560(+)：光照后560nm下的吸光度a：光照前空白對照560nm下的吸光度（平均值）b：光照后空白對照560nm下的吸光度（平均值）8.2試驗接受標準試驗應滿足以下標準：1．光照前，反應混合物中沒有受試物沉淀。2．光照前后，受試物對反應混合物沒有顏色干擾。3．試驗過程中溫度控制在20℃~29℃范圍內。4．所有測試孔A440及A560應在0.02~1.5范圍內。5．應根據歷史數據平均值±2標準偏差建立實驗室內陰性對照與陽性對照的質控范圍。以下為根據驗證數據得出的95%置信區間：200μmol/L奎寧鹽酸鹽二水合物200μmol/L二苯甲酮-4SO：319至583SA：193至385SO：-9至11SA：-20至28.3受試物的光反應性評判標準根據以下標準評判受試物的光反應性：分類樣品濃度SOSA具有光反應性200μmol/L≥25和≥70<25和/或有干擾和≥70≥25和<70和/或有干擾具有弱光反應性200μmol/L<25和≥20，<70具有光反應性20μmol/L≥25和≥20無光反應性200μmol/L<25和<20不確定不屬于上述任何一種情況如受試物在200μmol/L和20μmol/L濃度下均有沉淀、著色或其他干擾，則認為該受試物不適用于本方法，受試物的光反應性不確定。9其他限制說明在活性氧（ROS）檢測過程中，會發生如下兩個反應：單線態氧和咪唑反應生成的過氧化物中間體對N,N-二甲基-4-亞硝基苯胺（RNO）具有漂白作用；超氧陰離子與氯化硝基四氮唑藍（NBT）反應生成NBT+。該方法不適用于對上述兩個反應產生干擾的化學品測試，例如，抗壞血酸和其他還原性化學品，它們會將四唑鹽直接還原為甲瓚，抗壞血酸還加速咪唑衍生物的氧化，在ROS測定中提供假陽性預測。

附錄A參考化學物質檢測結果可接受范圍表117種參考化學物質SO值和SA值測定數據的可接受范圍。編號化學物名稱CAS編號SOSA溶劑濃度1對氨基苯甲酸150-13-0-8~12-11~7DMSO200μmol/L2對氨基苯甲酸乙酯94-09-7-7~9-7~17DMSO200μmol/L3鹽酸多西環素10592-13-9115~429230~468DMSO200μmol/L4紅霉素114-07-8-15~11-9~21DMSO200μmol/L5非諾貝特49562-28-977~203-31~11DMSO20μmol/L6L-組氨酸71-00-1-8~128~120NaPB200μmol/L7諾氟沙星70458-96-7131~27157~161DMSO200μmol/L88-甲氧基補骨脂素298-81-731~1370~126DMSO200μmol/L9水楊酸異辛酯118-60-5-5~11-8~20DMSO20μmol/L10吖啶260-94-6182~328121~243DMSO200μmol/L11鹽酸氯丙嗪69-09-0-56~7066~106DMSO200μmol/L12雙氯芬酸鈉15307-79-634~41647~437DMSO200μmol/L13呋噻米54-31-931~225-7~109DMSO200μmol/L14酮基布洛芬22071-15-4120~34677~151DMSO200μ