噬菌體展示技術(shù)的原理和方法一、本文概述噬菌體展示技術(shù)是一種強(qiáng)大的分子生物學(xué)工具，它允許科學(xué)家在噬菌體表面展示各種外源蛋白。這種技術(shù)不僅為研究者提供了在體外模擬和研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的機(jī)會(huì)，還在生物醫(yī)藥、疫苗開發(fā)和蛋白質(zhì)工程等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。本文將對噬菌體展示技術(shù)的原理和方法進(jìn)行詳細(xì)的介紹，包括其基本概念、技術(shù)原理、操作步驟以及應(yīng)用領(lǐng)域等方面，旨在為讀者提供全面而深入的理解，并激發(fā)其在這一領(lǐng)域的探索和創(chuàng)新。二、噬菌體展示技術(shù)的原理噬菌體展示技術(shù)是一種分子生物學(xué)技術(shù)，它利用噬菌體表面蛋白與外來DNA片段的融合表達(dá)，將外來DNA編碼的蛋白質(zhì)或多肽片段展示在噬菌體表面。這一技術(shù)的核心原理主要基于兩個(gè)方面：噬菌體生命周期中的基因表達(dá)和蛋白質(zhì)定位，以及DNA重組技術(shù)的運(yùn)用。噬菌體在感染宿主菌后，會(huì)經(jīng)歷吸附、注入、復(fù)制、組裝和釋放等生命周期階段。在復(fù)制和組裝過程中，噬菌體的基因會(huì)被轉(zhuǎn)錄和翻譯，生成相應(yīng)的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)中，有一部分是噬菌體的外殼蛋白，它們負(fù)責(zé)構(gòu)成噬菌體的外殼，并保護(hù)內(nèi)部的遺傳物質(zhì)。噬菌體展示技術(shù)利用了DNA重組技術(shù)，將外來DNA片段插入到噬菌體的基因組中，使其與編碼外殼蛋白的基因融合。當(dāng)這個(gè)重組噬菌體在宿主菌中復(fù)制時(shí)，融合基因會(huì)被轉(zhuǎn)錄和翻譯，生成融合蛋白。這個(gè)融合蛋白既包含了噬菌體外殼蛋白的序列，又包含了外來DNA編碼的蛋白質(zhì)或多肽片段。由于噬菌體的外殼蛋白具有定位到噬菌體表面的特性，因此融合蛋白也會(huì)被定位到噬菌體表面。這樣，外來DNA編碼的蛋白質(zhì)或多肽片段就被展示在了噬菌體表面，形成了噬菌體展示。噬菌體展示技術(shù)通過將蛋白質(zhì)或多肽片段與噬菌體表面蛋白融合，實(shí)現(xiàn)了對這些片段的高效展示和篩選。這使得該技術(shù)在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物工程等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。例如，它可以用于研究蛋白質(zhì)之間的相互作用、篩選藥物靶標(biāo)、開發(fā)新型疫苗等。噬菌體展示技術(shù)也為蛋白質(zhì)工程和基因工程提供了新的思路和方法。三、噬菌體展示技術(shù)的方法噬菌體展示技術(shù)是一種強(qiáng)大的分子生物學(xué)工具，它允許我們將外源蛋白或多肽片段與噬菌體表面蛋白融合表達(dá)，從而通過噬菌體的繁殖和篩選實(shí)現(xiàn)對外源蛋白的高通量、高特異性研究。以下將詳細(xì)介紹噬菌體展示技術(shù)的基本方法。構(gòu)建噬菌體展示載體：我們需要構(gòu)建一個(gè)噬菌體展示載體。這個(gè)載體通常是一個(gè)改造過的噬菌體基因組，它包含了一個(gè)或多個(gè)外源基因插入位點(diǎn)，這些位點(diǎn)位于噬菌體表面蛋白的編碼序列中。這樣，當(dāng)噬菌體繁殖時(shí)，外源基因就會(huì)與表面蛋白一起表達(dá)在噬菌體表面。插入目標(biāo)基因：然后，我們將目標(biāo)基因（編碼我們感興趣的蛋白或多肽片段的基因）插入到展示載體中。這一步通常需要使用限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶，將目標(biāo)基因與載體進(jìn)行精確的拼接。轉(zhuǎn)化宿主菌：接下來，我們將構(gòu)建好的展示載體轉(zhuǎn)化入適當(dāng)?shù)乃拗骶小＿@些宿主菌通常是經(jīng)過改造的大腸桿菌，它們能夠容納并復(fù)制噬菌體基因組。噬菌體繁殖與純化：在宿主菌中，噬菌體會(huì)進(jìn)行繁殖，產(chǎn)生大量的子代噬菌體。這些噬菌體表面都帶有我們插入的目標(biāo)基因編碼的蛋白或多肽片段。我們可以通過離心、過濾等方法純化這些噬菌體。篩選特異性噬菌體：我們可以使用特定的配體（如抗體、受體等）對噬菌體進(jìn)行篩選，以找到那些表面蛋白能夠與配體結(jié)合的噬菌體。這些噬菌體就攜帶了我們感興趣的目標(biāo)基因。通過噬菌體展示技術(shù)，我們可以高效地篩選和鑒定與目標(biāo)配體有特異性結(jié)合的蛋白或多肽片段，為藥物研發(fā)、疾病診斷和治療等領(lǐng)域提供強(qiáng)大的工具。四、噬菌體展示技術(shù)的應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)作為一種強(qiáng)大的分子工具，在生物學(xué)研究和應(yīng)用中發(fā)揮著重要的作用。它的核心在于通過噬菌體表面展示特定蛋白或肽鏈，從而實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)分子的篩選和識(shí)別。以下是噬菌體展示技術(shù)在各個(gè)領(lǐng)域中的應(yīng)用。在藥物研發(fā)領(lǐng)域，噬菌體展示技術(shù)被廣泛應(yīng)用于新藥的發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化。通過展示與目標(biāo)藥物受體結(jié)合的肽鏈，科研人員可以快速篩選出具有生物活性的候選藥物。噬菌體展示技術(shù)還可以用于研究藥物與受體的相互作用機(jī)制，為藥物設(shè)計(jì)和優(yōu)化提供重要的理論依據(jù)。在疾病診斷和治療方面，噬菌體展示技術(shù)同樣發(fā)揮著重要作用。例如，通過展示針對特定病原體的抗體片段，噬菌體可以用于開發(fā)新型的診斷試劑和治療方法。噬菌體展示技術(shù)還可以用于研究病原體與宿主細(xì)胞的相互作用，為疾病的預(yù)防和治療提供新的思路。在疫苗研發(fā)領(lǐng)域，噬菌體展示技術(shù)為疫苗設(shè)計(jì)提供了新的方法。通過展示病原體表面的關(guān)鍵抗原表位，噬菌體可以作為疫苗候選物，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。與傳統(tǒng)的疫苗相比，噬菌體展示技術(shù)制備的疫苗具有更高的安全性和有效性。在基礎(chǔ)生物學(xué)研究中，噬菌體展示技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)相互作用、基因表達(dá)和調(diào)控等領(lǐng)域。例如，通過展示特定的蛋白質(zhì)片段，科研人員可以研究蛋白質(zhì)之間的相互作用和信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。噬菌體展示技術(shù)還可以用于構(gòu)建基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為研究基因功能和調(diào)控機(jī)制提供有力的工具。噬菌體展示技術(shù)在藥物研發(fā)、疾病診斷和治療、疫苗研發(fā)以及基礎(chǔ)生物學(xué)研究等多個(gè)領(lǐng)域都具有廣泛的應(yīng)用前景。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，噬菌體展示技術(shù)將在未來為生命科學(xué)研究和人類健康事業(yè)做出更大的貢獻(xiàn)。五、噬菌體展示技術(shù)的優(yōu)勢和局限性噬菌體展示技術(shù)自問世以來，憑借其獨(dú)特的優(yōu)勢在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)等領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用。該技術(shù)的主要優(yōu)勢體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：高通量篩選能力：噬菌體展示技術(shù)允許研究人員在短時(shí)間內(nèi)篩選大量候選分子，從而快速識(shí)別和鑒定具有特定功能的蛋白質(zhì)或肽段。直觀性和靈活性：該技術(shù)能夠直接將基因型與表型聯(lián)系起來，使得研究者能夠直觀地觀察到基因表達(dá)的產(chǎn)物，并且可以通過簡單的操作對展示分子進(jìn)行改造和優(yōu)化。廣泛的應(yīng)用范圍：噬菌體展示不僅適用于蛋白質(zhì)，還可以用于展示多肽、抗體片段等生物活性分子，因此在藥物研發(fā)、疫苗設(shè)計(jì)、疾病診斷和治療等方面具有廣泛的應(yīng)用前景。展示容量的限制：由于噬菌體顆粒的大小有限，其能夠展示的外源分子大小也受到限制，這可能會(huì)限制某些大型蛋白質(zhì)或多肽的應(yīng)用。展示穩(wěn)定性問題：在某些情況下，外源分子與噬菌體衣殼蛋白的結(jié)合可能不夠穩(wěn)定，導(dǎo)致在篩選過程中分子丟失或結(jié)構(gòu)改變。背景干擾：噬菌體展示系統(tǒng)中可能存在非特異性結(jié)合或交叉反應(yīng)，這可能會(huì)影響篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。技術(shù)操作復(fù)雜性：雖然噬菌體展示技術(shù)在理論上相對簡單，但在實(shí)際操作中需要一定的專業(yè)知識(shí)和技術(shù)經(jīng)驗(yàn)，且實(shí)驗(yàn)步驟相對繁瑣，可能會(huì)影響其廣泛應(yīng)用。盡管存在這些局限性，但隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和優(yōu)化，噬菌體展示技術(shù)仍然具有巨大的潛力和廣泛的應(yīng)用前景。未來，通過改進(jìn)展示系統(tǒng)、優(yōu)化篩選方法和提高實(shí)驗(yàn)操作的簡便性，噬菌體展示技術(shù)有望在更多領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。六、結(jié)論噬菌體展示技術(shù)作為一種強(qiáng)大的分子生物學(xué)工具，已經(jīng)在多個(gè)領(lǐng)域展現(xiàn)出了廣泛的應(yīng)用前景。其基本原理通過基因工程手段將外源蛋白或多肽的DNA序列與噬菌體表面蛋白基因相連，使外源蛋白或多肽以融合蛋白的形式表達(dá)在噬菌體表面。這種技術(shù)不僅為研究者提供了直觀、簡便的方式來篩選和鑒定蛋白質(zhì)相互作用，還為藥物研發(fā)、疫苗制備以及疾病診斷等領(lǐng)域提供了有力的技術(shù)支持。在方法上，噬菌體展示技術(shù)通過構(gòu)建噬菌體展示文庫、篩選陽性噬菌體、克隆與測序等步驟，實(shí)現(xiàn)了對外源蛋白或多肽的高效表達(dá)和篩選。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，噬菌體展示技術(shù)已經(jīng)從最初的單一蛋白展示發(fā)展到了現(xiàn)在的多蛋白復(fù)合體展示，從而進(jìn)一步拓展了其應(yīng)用范圍。然而，噬菌體展示技術(shù)也面臨著一些挑戰(zhàn)和限制。例如，某些蛋白質(zhì)在噬菌體表面的表達(dá)可能會(huì)影響其天然構(gòu)象和功能，從而影響篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性。噬菌體展示文庫的構(gòu)建也需要耗費(fèi)大量的時(shí)間和資源。因此，在未來的研究中，我們需要進(jìn)一步優(yōu)化噬菌體展示技術(shù)，提高其表達(dá)效率和篩選準(zhǔn)確性，以更好地滿足科研和實(shí)際應(yīng)用的需求。噬菌體展示技術(shù)作為一種強(qiáng)大的分子生物學(xué)工具，已經(jīng)在多個(gè)領(lǐng)域展現(xiàn)出了廣泛的應(yīng)用價(jià)值。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和優(yōu)化，我們有理由相信噬菌體展示技術(shù)將在未來的科研和實(shí)際應(yīng)用中發(fā)揮更加重要的作用。參考資料：噬菌體展示技術(shù)(phagedisplaytechnology)是將外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，使外源基因隨外殼蛋白的表達(dá)而表達(dá)，同時(shí)，外源蛋白隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面的生物技術(shù)。到2017年為止，人們已開發(fā)出了單鏈絲狀噬菌體展示系統(tǒng)、λ噬菌體展示系統(tǒng)、T4噬菌體展示系統(tǒng)等數(shù)種噬菌體展示系統(tǒng)。噬菌體展示技術(shù)是將多肽或蛋白質(zhì)的編碼基因或目的基因片段克隆入噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，在閱讀框正確且不影響其他外殼蛋白正常功能的情況下，使外源多肽或蛋白與外殼蛋白融合表達(dá)，融合蛋白隨子代噬菌體的重新組裝而展示在噬菌體表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相對獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，以利于靶分子的識(shí)別和結(jié)合。肽庫與固相上的靶蛋白分子經(jīng)過一定時(shí)間孵育后，洗去未結(jié)合的游離噬菌體，然后以競爭受體或酸洗脫下與靶分子結(jié)合吸附的噬菌體，洗脫的噬菌體感染宿主細(xì)胞后經(jīng)繁殖擴(kuò)增，進(jìn)行下一輪洗脫，經(jīng)過3輪～5輪的“吸附-洗脫-擴(kuò)增”后，與靶分子特異結(jié)合的噬菌體得到高度富集。所得的噬菌體制劑可用來做進(jìn)一步富集有期望結(jié)合特性的目標(biāo)噬菌體。（1）PⅢ展示系統(tǒng)。絲狀噬菌體是單鏈DNA病毒，PⅢ是病毒的次要外殼蛋白，位于病毒顆粒的尾端，是噬菌體感染大腸埃希菌所必須的。每個(gè)病毒顆粒都有3個(gè)～5個(gè)拷貝PⅢ蛋白，其在結(jié)構(gòu)上可分為NN2和CT3個(gè)功能區(qū)域，這3個(gè)功能區(qū)域由兩段富含甘氨酸的連接肽G1和G2連接。其中，N1和N2與噬菌體吸附大腸埃希菌菌毛及穿透細(xì)胞膜有關(guān)，而CT構(gòu)成噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)的一部分，并將整個(gè)PⅢ蛋白的C端結(jié)構(gòu)域錨定于噬菌體的一端。PⅢ有2個(gè)位點(diǎn)可供外源序列插入，當(dāng)外源的多肽或蛋白質(zhì)融合于PⅢ蛋白的信號(hào)肽(SgⅢ)和N1之間時(shí)，該系統(tǒng)保留了完整的PⅢ蛋白，噬菌體仍有感染性；但若外源多肽或蛋白直接與PⅢ蛋白的CT結(jié)構(gòu)域相連，則噬菌體喪失感染性，這時(shí)重組噬菌體的感染性由輔助噬菌體表達(dá)的完整PⅢ蛋白來提供。PⅢ蛋白很容易被蛋白水解酶水解，所以有輔助噬菌體超感染時(shí)，可以使每個(gè)噬菌體平均展示不到一個(gè)融合蛋白，即所謂“單價(jià)”噬菌體。（2）PⅧ及其他展示系統(tǒng)。PⅧ是絲狀噬菌體的主要外殼蛋白，位于噬菌體外側(cè)，C端與DNA結(jié)合，N端伸出噬菌體外，每個(gè)病毒顆粒有2700個(gè)左右PⅧ拷貝。PⅧ的N端附近可融合五肽，但不能融合更長的肽鏈，因?yàn)檩^大的多肽或蛋白會(huì)造成空間障礙，影響噬菌體裝配，使其失去感染力。但有輔助噬菌體參與時(shí)，可提供野生型PⅧ蛋白，降低價(jià)數(shù)，此時(shí)可融合多肽甚至抗體片段。尚有絲狀噬菌體PⅥ展示系統(tǒng)的研究報(bào)道。PⅥ蛋白的C端暴露于噬菌體表面，可以作為外源蛋白的融合位點(diǎn)，可以用于研究外源蛋白C端結(jié)構(gòu)區(qū)域功能。從所掌握的文獻(xiàn)來看，該系統(tǒng)主要用于cDNA表面展示文庫的構(gòu)建，并取得了不錯(cuò)的篩選效果。（1）PV展示系統(tǒng)。λ噬菌體的PV蛋白構(gòu)成了它的尾部管狀部分，該管狀結(jié)構(gòu)由32個(gè)盤狀結(jié)構(gòu)組成，每個(gè)盤又由6個(gè)PV亞基組成。PV有兩個(gè)折疊區(qū)域，C端的折疊結(jié)構(gòu)域（非功能區(qū)）可供外源序列插入或替換。用PV系統(tǒng)已成功展示了有活性的大分子蛋白β-半乳糖苷酶（5ku）和植物外源凝血素BPA（120ku）等。λ噬菌體的裝配在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，故可以展示難以分泌的肽或蛋白質(zhì)。該系統(tǒng)展示的外源蛋白質(zhì)的拷貝數(shù)為平均1個(gè)分子/噬菌體，這表明外源蛋白質(zhì)或多肽可能干擾了λ噬菌體的尾部裝配。（2）D蛋白展示系統(tǒng)。D蛋白的分子質(zhì)量為11ku，參與野生型λ噬菌體頭部的裝配。低溫電鏡分析表明，D蛋白以三聚體的形式突出在殼粒表面。當(dāng)突變型噬菌體基因組小于野生型基因組的82%時(shí)，可以在缺少D蛋白的情況下完成組裝，故D蛋白可作為外源序列融合的載體，而且展示的外源多肽在空間上是可以接近的。病毒顆粒的組裝可以在體內(nèi)也可以在體外，體外組裝即是將D融合蛋白結(jié)合到λD-噬菌體表面，而體內(nèi)組裝是將含D融合基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入λD-溶源的大腸埃希菌菌種中，從而補(bǔ)償溶源菌所缺的D蛋白，通過熱誘導(dǎo)而組裝。該系統(tǒng)有一個(gè)很好的特點(diǎn)，噬菌體上融合蛋白和D蛋白的比例可以由宿主的抑制tRNA活性加以控制，這對于展示那些可以對噬菌體裝配造成損害的蛋白質(zhì)時(shí)特別有用。T4噬菌體展示系統(tǒng)是20世紀(jì)90年代中期建立起來的一種新的展示系統(tǒng)。它的顯著特點(diǎn)是能夠?qū)煞N性質(zhì)完全不同的外源多肽或蛋白質(zhì)，分別與T4衣殼表面上的外殼蛋白SOC（9ku）和HOC（40ku）融合而直接展示于T4噬菌體的表面，因此它表達(dá)的蛋白不需要復(fù)雜的蛋白純化，避免了因純化而引起的蛋白質(zhì)變性和丟失。T4噬菌體是在宿主細(xì)胞內(nèi)裝配，不需通過分泌途徑，因而可展示各種大小的多肽或蛋白質(zhì)，很少受到限制。吳健敏等成功地將大小約215aaSOC/mE2融合蛋白展示于T4噬菌體衣殼表面。令人值得關(guān)注的是，SOC與HOC蛋白的存在與否，并不影響T4的生存和繁殖。SOC和HOC在噬菌體組裝時(shí)可優(yōu)于DNA的包裝而裝配于衣殼的表面，事實(shí)上，在DNA包裝被抑制時(shí)，T4是雙股DNA噬菌體中能夠在體內(nèi)產(chǎn)生空衣殼的噬菌體（SOC和HOC也同時(shí)組裝）。因此，在用重組T4做疫苗時(shí)，它能在空衣殼表面展示目的抗原，這種缺乏DNA的空衣殼苗，在生物安全性方面具有十分光明的前景。（1）在噬菌體展示過程中必須經(jīng)過細(xì)菌轉(zhuǎn)化、噬菌體包裝，有的展示系統(tǒng)還要經(jīng)過跨膜分泌過程，這就大大限制了所建庫的容量和分子多樣性。常用的噬菌體展示文庫中含有不同序列分子的數(shù)量一般限制在109。（2）不是所有的序列都能在噬菌體中獲得很好的表達(dá)，因?yàn)橛行┑鞍踪|(zhì)功能的實(shí)現(xiàn)需要折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)、膜插入和絡(luò)合，導(dǎo)致在體內(nèi)篩選時(shí)需外加選擇壓力。例如，在噬菌體展示文庫試驗(yàn)中，由于部分未折疊的蛋白在細(xì)菌中很容易被降解，因此，必須小心控制條件，以保證在噬菌體表面展示的文庫沒有降解。另外，鼠源抗體在噬菌體中表達(dá)差，也是體內(nèi)選擇壓力的一個(gè)例子。真核細(xì)胞蛋白在細(xì)菌中表達(dá)差是因?yàn)樗鼈兊牡鞍踪|(zhì)合成與折疊機(jī)制不同的緣故。（3）噬菌體展示文庫一旦建成，很難再進(jìn)行有效的體外突變和重組，進(jìn)而限制了文庫中分子遺傳的多樣性。（4）由于噬菌體展示系統(tǒng)依賴于細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)，所以，一些對細(xì)胞有毒性的分子如生物毒素分子，很難得到有效表達(dá)和展示。確定抗原表位，包括表位的序列和構(gòu)象，是免疫學(xué)家感興趣的一個(gè)問題。表位的確定不僅可以了解有關(guān)免疫反應(yīng)的眾多信息，為進(jìn)一步人工控制免疫反應(yīng)奠定基礎(chǔ)，而且對藥物合成、疫苗設(shè)計(jì)等也具有指導(dǎo)意義。確定表位常用的方法有：還原法、蛋白印跡法、肽掃描、突變分析等，后兩種方法還同時(shí)解決了蛋白分子一級(jí)序列問題。但這些方法大多困難而繁瑣。00年以后，噬菌體展示技術(shù)成為探測蛋白空間結(jié)構(gòu)、探索受體與配體之間相互作用結(jié)合位點(diǎn)、尋找高親和力和生物活性的配體分子的有利工具，在蛋白分子相互識(shí)別的研究、新型疫苗的研制以及腫瘤治療等研究領(lǐng)域產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。肽庫（peptidelibrary）的應(yīng)用為確定表位序列以至其構(gòu)象提供了另一有力工具。噬菌體展示肽庫是以噬菌體外殼蛋白PⅢ或PⅧ基因?yàn)檩d體，插入一段編碼外源短肽的基因片段，噬菌體的浸染能力不受到影響，而外源短肽亦可在噬菌體表面PⅢ或PⅧ蛋白N末端形成一定的空間構(gòu)象。1990年Scott將隨機(jī)短肽與絲狀噬菌體的表面蛋白PⅢ融合，并展示在噬菌體表面，首次建立了噬菌體隨機(jī)肽庫。從噬菌體展示隨機(jī)肽庫中篩選抗原表位的基本原理是生物淘選（biopanning）。以單克隆抗體篩選蛋白質(zhì)抗原表位為例，其基本技術(shù)流程如下：將單抗包被聚乙烯平皿后，再加入噬菌體展示肽庫，使其充分與單抗反應(yīng)后，洗去未結(jié)合的游離噬菌體，再用洗脫液將結(jié)合狀態(tài)的噬菌體洗脫下來。將其浸染宿主大腸桿菌擴(kuò)增后回收，再進(jìn)行下一輪篩選。通常經(jīng)過4輪的篩選，并且每次增加篩選強(qiáng)度，這樣就可獲得與單抗結(jié)合較緊密的噬菌體克隆。通過序列測定和分析，就能推知該噬菌體克隆所攜帶的外源短肽序列，從而確定該單抗所針對的抗原表位。借助于噬菌體展示肽庫技術(shù)，已經(jīng)成功分析了多種蛋白質(zhì)抗原的表位，如HIV（Kelleretal.,1993；杜勇等，2000）、HBV、HCV（杜勇等，1999；Francescaetal.,2001；潘衛(wèi)等，2001）、日本血吸蟲（歐陽理等，2002）等，說明完全可以利用隨機(jī)肽庫鑒定抗原的線性和構(gòu)象表位，大大簡化了重組免疫原的克隆、鑒定和表達(dá)等過程，為表位鑒定研究增添了新的手段。絲狀噬菌體具有免疫原性，無須佐劑即可產(chǎn)生抗體，這意味著噬菌體展示系統(tǒng)可以作為候選疫苗抗原表位的遞呈工具。利用展示肉毒梭菌中和表位的噬菌體不加佐劑直接免疫小鼠，血清ELISA檢測顯示，免疫小鼠是對照小鼠的OD值的2~10倍。表明噬菌體展示的表位具有明顯的抗原性。噬菌體展示技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)噬菌體展示技術(shù)作為一種新興的研究方法和工具，在研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上已被廣泛應(yīng)用。它具有很多顯著的優(yōu)點(diǎn)，如：A.高通量的淘選將靶標(biāo)分子（抗體）固定在固相載體上，加入噬菌體展示肽庫（噬菌體的數(shù)量可達(dá)1011PFU），利用抗原-抗體的特異性親和力將與抗體結(jié)合的噬菌體吸附在固相載體上，不能結(jié)合的噬菌體仍在溶液中，可以通過洗滌去除，再將特異結(jié)合的噬菌體洗脫下來，如此反復(fù)數(shù)輪擴(kuò)增、淘選，即可將有用的基因從多達(dá)百萬以上的噬菌體克隆中分離出來。B.可用于模擬表位的篩選利用噬菌體展示技術(shù)得到模擬表位的報(bào)道較多（Giuseppe,2001；Seshietal.,2002；Ouyangetal.,2003）。李全喜等（1997）利用單抗9E10篩選噬菌體隨機(jī)肽庫，結(jié)果獲得了兩個(gè)陽性克隆，其中一個(gè)與抗原天然序列同源，而另一個(gè)則完全不同（即為模擬表位）。模擬表位同樣可誘發(fā)與天然表位相似的特異性免疫反應(yīng)，例如利用乙肝病毒的模擬表位免疫小鼠可誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的乙肝病毒抗體。C.易于純化重組噬菌體的純化步驟簡單、不要求昂貴的試劑與設(shè)備，在一般的實(shí)驗(yàn)室條件下就可以完成。用于鑒定表位和受體所用的噬菌體載體為13單鏈?zhǔn)删w。由于M13噬菌體是溫和型噬菌體，不裂解宿主菌，成熟的噬菌體可分泌到培養(yǎng)基中，通過離心收集培養(yǎng)上清，再向其中加入沉淀劑即可將上清中大量噬菌體粒子沉淀下來，從而富集得到含外源基因產(chǎn)物的重組噬菌體。盡管如此，在噬菌體展示技術(shù)中仍然存在一些不足。所建的肽庫容量只能達(dá)到109，要想構(gòu)建大片段的肽庫很困難。需要解決肽庫的多樣性問題。第三，少數(shù)多肽由于疏水性過強(qiáng)，或由于影響外膜蛋白的折疊而不能展示在噬菌體表面。作為一種新技術(shù)，類似的具體問題還很多。但這些暫時(shí)的缺點(diǎn)并不能掩蓋其巨大應(yīng)用潛力。1985年，SmithGP第一次將外源基因插入絲狀噬菌體f1的基因Ⅲ，使目的基因編碼的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌體表面，從而創(chuàng)建了噬菌體展示技術(shù)。該技術(shù)的主要特點(diǎn)是將特定分子的基因型和表型統(tǒng)一在同一病毒顆粒內(nèi)，即在噬菌體表面展示特定蛋白質(zhì)，而在噬菌體核心DNA中則含有該蛋白的結(jié)構(gòu)基因。另外，這項(xiàng)技術(shù)把基因表達(dá)產(chǎn)物與親和篩選結(jié)合起來，可以利用適當(dāng)?shù)陌械鞍讓⒛康牡鞍谆蚨嚯奶暨x出來。隨著噬菌體展示技術(shù)的日益完善，該技術(shù)在眾多基礎(chǔ)和應(yīng)用研究領(lǐng)域產(chǎn)生的影響已日漸明顯。噬菌體展示技術(shù)(phagedisplaytechnology)是將外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，使外源基因隨外殼蛋白的表達(dá)而表達(dá)，同時(shí)，外源蛋白隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表面的生物技術(shù)。到2017年為止，人們已開發(fā)出了單鏈絲狀噬菌體展示系統(tǒng)、λ噬菌體展示系統(tǒng)、T4噬菌體展示系統(tǒng)等數(shù)種噬菌體展示系統(tǒng)。噬菌體展示技術(shù)是將多肽或蛋白質(zhì)的編碼基因或目的基因片段克隆入噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，在閱讀框正確且不影響其他外殼蛋白正常功能的情況下，使外源多肽或蛋白與外殼蛋白融合表達(dá)，融合蛋白隨子代噬菌體的重新組裝而展示在噬菌體表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相對獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，以利于靶分子的識(shí)別和結(jié)合。肽庫與固相上的靶蛋白分子經(jīng)過一定時(shí)間孵育后，洗去未結(jié)合的游離噬菌體，然后以競爭受體或酸洗脫下與靶分子結(jié)合吸附的噬菌體，洗脫的噬菌體感染宿主細(xì)胞后經(jīng)繁殖擴(kuò)增，進(jìn)行下一輪洗脫，經(jīng)過3輪～5輪的“吸附-洗脫-擴(kuò)增”后，與靶分子特異結(jié)合的噬菌體得到高度富集。所得的噬菌體制劑可用來做進(jìn)一步富集有期望結(jié)合特性的目標(biāo)噬菌體。（1）PⅢ展示系統(tǒng)。絲狀噬菌體是單鏈DNA病毒，PⅢ是病毒的次要外殼蛋白，位于病毒顆粒的尾端，是噬菌體感染大腸埃希菌所必須的。每個(gè)病毒顆粒都有3個(gè)～5個(gè)拷貝PⅢ蛋白，其在結(jié)構(gòu)上可分為NN2和CT3個(gè)功能區(qū)域，這3個(gè)功能區(qū)域由兩段富含甘氨酸的連接肽G1和G2連接。其中，N1和N2與噬菌體吸附大腸埃希菌菌毛及穿透細(xì)胞膜有關(guān)，而CT構(gòu)成噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)的一部分，并將整個(gè)PⅢ蛋白的C端結(jié)構(gòu)域錨定于噬菌體的一端。PⅢ有2個(gè)位點(diǎn)可供外源序列插入，當(dāng)外源的多肽或蛋白質(zhì)融合于PⅢ蛋白的信號(hào)肽(SgⅢ)和N1之間時(shí)，該系統(tǒng)保留了完整的PⅢ蛋白，噬菌體仍有感染性；但若外源多肽或蛋白直接與PⅢ蛋白的CT結(jié)構(gòu)域相連，則噬菌體喪失感染性，這時(shí)重組噬菌體的感染性由輔助噬菌體表達(dá)的完整PⅢ蛋白來提供。PⅢ蛋白很容易被蛋白水解酶水解，所以有輔助噬菌體超感染時(shí)，可以使每個(gè)噬菌體平均展示不到一個(gè)融合蛋白，即所謂“單價(jià)”噬菌體。（2）PⅧ及其他展示系統(tǒng)。PⅧ是絲狀噬菌體的主要外殼蛋白，位于噬菌體外側(cè)，C端與DNA結(jié)合，N端伸出噬菌體外，每個(gè)病毒顆粒有2700個(gè)左右PⅧ拷貝。PⅧ的N端附近可融合五肽，但不能融合更長的肽鏈，因?yàn)檩^大的多肽或蛋白會(huì)造成空間障礙，影響噬菌體裝配，使其失去感染力。但有輔助噬菌體參與時(shí)，可提供野生型PⅧ蛋白，降低價(jià)數(shù)，此時(shí)可融合多肽甚至抗體片段。尚有絲狀噬菌體PⅥ展示系統(tǒng)的研究報(bào)道。PⅥ蛋白的C端暴露于噬菌體表面，可以作為外源蛋白的融合位點(diǎn)，可以用于研究外源蛋白C端結(jié)構(gòu)區(qū)域功能。從所掌握的文獻(xiàn)來看，該系統(tǒng)主要用于cDNA表面展示文庫的構(gòu)建，并取得了不錯(cuò)的篩選效果。（1）PV展示系統(tǒng)。λ噬菌體的PV蛋白構(gòu)成了它的尾部管狀部分，該管狀結(jié)構(gòu)由32個(gè)盤狀結(jié)構(gòu)組成，每個(gè)盤又由6個(gè)PV亞基組成。PV有兩個(gè)折疊區(qū)域，C端的折疊結(jié)構(gòu)域（非功能區(qū)）可供外源序列插入或替換。用PV系統(tǒng)已成功展示了有活性的大分子蛋白β-半乳糖苷酶（5ku）和植物外源凝血素BPA（120ku）等。λ噬菌體的裝配在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，故可以展示難以分泌的肽或蛋白質(zhì)。該系統(tǒng)展示的外源蛋白質(zhì)的拷貝數(shù)為平均1個(gè)分子/噬菌體，這表明外源蛋白質(zhì)或多肽可能干擾了λ噬菌體的尾部裝配。（2）D蛋白展示系統(tǒng)。D蛋白的分子質(zhì)量為11ku，參與野生型λ噬菌體頭部的裝配。低溫電鏡分析表明，D蛋白以三聚體的形式突出在殼粒表面。當(dāng)突變型噬菌體基因組小于野生型基因組的82%時(shí)，可以在缺少D蛋白的情況下完成組裝，故D蛋白可作為外源序列融合的載體，而且展示的外源多肽在空間上是可以接近的。病毒顆粒的組裝可以在體內(nèi)也可以在體外，體外組裝即是將D融合蛋白結(jié)合到λD-噬菌體表面，而體內(nèi)組裝是將含D融合基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入λD-溶源的大腸埃希菌菌種中，從而補(bǔ)償溶源菌所缺的D蛋白，通過熱誘導(dǎo)而組裝。該系統(tǒng)有一個(gè)很好的特點(diǎn)，噬菌體上融合蛋白和D蛋白的比例可以由宿主的抑制tRNA活性加以控制，這對于展示那些可以對噬菌體裝配造成損害的蛋白質(zhì)時(shí)特別有用。T4噬菌體展示系統(tǒng)是20世紀(jì)90年代中期建立起來的一種新的展示系統(tǒng)。它的顯著特點(diǎn)是能夠?qū)煞N性質(zhì)完全不同的外源多肽或蛋白質(zhì)，分別與T4衣殼表面上的外殼蛋白SOC（9ku）和HOC（40ku）融合而直接展示于T4噬菌體的表面，因此它表達(dá)的蛋白不需要復(fù)雜的蛋白純化，避免了因純化而引起的蛋白質(zhì)變性和丟失。T4噬菌體是在宿主細(xì)胞內(nèi)裝配，不需通過分泌途徑，因而可展示各種大小的多肽或蛋白質(zhì)，很少受到限制。吳健敏等成功地將大小約215aaSOC/mE2融合蛋白展示于T4噬菌體衣殼表面。令人值得關(guān)注的是，SOC與HOC蛋白的存在與否，并不影響T4的生存和繁殖。SOC和HOC在噬菌體組裝時(shí)可優(yōu)于DNA的包裝而裝配于衣殼的表面，事實(shí)上，在DNA包裝被抑制時(shí)，T4是雙股DNA噬菌體中能夠在體內(nèi)產(chǎn)生空衣殼的噬菌體（SOC和HOC也同時(shí)組裝）。因此，在用重組T4做疫苗時(shí)，它能在空衣殼表面展示目的抗原，這種缺乏DNA的空衣殼苗，在生物安全性方面具有十分光明的前景。（1）在噬菌體展示過程中必須經(jīng)過細(xì)菌轉(zhuǎn)化、噬菌體包裝，有的展示系統(tǒng)還要經(jīng)過跨膜分泌過程，這就大大限制了所建庫的容量和分子多樣性。常用的噬菌體展示文庫中含有不同序列分子的數(shù)量一般限制在109。（2）不是所有的序列都能在噬菌體中獲得很好的表達(dá)，因?yàn)橛行┑鞍踪|(zhì)功能的實(shí)現(xiàn)需要折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)、膜插入和絡(luò)合，導(dǎo)致在體內(nèi)篩選時(shí)需外加選擇壓力。例如，在噬菌體展示文庫試驗(yàn)中，由于部分未折疊的蛋白在細(xì)菌中很容易被降解，因此，必須小心控制條件，以保證在噬菌體表面展示的文庫沒有降解。另外，鼠源抗體在噬菌體中表達(dá)差，也是體內(nèi)選擇壓力的一個(gè)例子。真核細(xì)胞蛋白在細(xì)菌中表達(dá)差是因?yàn)樗鼈兊牡鞍踪|(zhì)合成與折疊機(jī)制不同的緣故。（3）噬菌體展示文庫一旦建成，很難再進(jìn)行有效的體外突變和重組，進(jìn)而限制了文庫中分子遺傳的多樣性。（4）由于噬菌體展示系統(tǒng)依賴于細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)，所以，一些對細(xì)胞有毒性的分子如生物毒素分子，很難得到有效表達(dá)和展示。確定抗原表位，包括表位的序列和構(gòu)象，是免疫學(xué)家感興趣的一個(gè)問題。表位的確定不僅可以了解有關(guān)免疫反應(yīng)的眾多信息，為進(jìn)一步人工控制免疫反應(yīng)奠定基礎(chǔ)，而且對藥物合成、疫苗設(shè)計(jì)等也具有指導(dǎo)意義。確定表位常用的方法有：還原法、蛋白印跡法、肽掃描、突變分析等，后兩種方法還同時(shí)解決了蛋白分子一級(jí)序列問題。但這些方法大多困難而繁瑣。00年以后，噬菌體展示技術(shù)成為探測蛋白空間結(jié)構(gòu)、探索受體與配體之間相互作用結(jié)合位點(diǎn)、尋找高親和力和生物活性的配體分子的有利工具，在蛋白分子相互識(shí)別的研究、新型疫苗的研制以及腫瘤治療等研究領(lǐng)域產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。肽庫（peptidelibrary）的應(yīng)用為確定表位序列以至其構(gòu)象提供了另一有力工具。噬菌體展示肽庫是以噬菌體外殼蛋白PⅢ或PⅧ基因?yàn)檩d體，插入一段編碼外源短肽的基因片段，噬菌體的浸染能力不受到影響，而外源短肽亦可在噬菌體表面PⅢ或PⅧ蛋白N末端形成一定的空間構(gòu)象。1990年Scott將隨機(jī)短肽與絲狀噬菌體的表面蛋白PⅢ融合，并展示在噬菌體表面，首次建立了噬菌體隨機(jī)肽庫。從噬菌體展示隨機(jī)肽庫中篩選抗原表位的基本原理是生物淘選（biopanning）。以單克隆抗體篩選蛋白質(zhì)抗原表位為例，其基本技術(shù)流程如下：將單抗包被聚乙烯平皿后，再加入噬菌體展示肽庫，使其充分與單抗反應(yīng)后，洗去未結(jié)合的游離噬菌體，再用洗脫液將結(jié)合狀態(tài)的噬菌體洗脫下來。將其浸染宿主大腸桿菌擴(kuò)增后回收，再進(jìn)行下一輪篩選。通常經(jīng)過4輪的篩選，并且每次增加篩選強(qiáng)度，這樣就可獲得與單抗結(jié)合較緊密的噬菌體克隆。通過序列測定和分析，就能推知該噬菌體克隆所攜帶的外源短肽序列，從而確定該單抗所針對的抗原表位。借助于噬菌體展示肽庫技術(shù)，已經(jīng)成功分析了多種蛋白質(zhì)抗原的表位，如HIV（Kelleretal.,1993；杜勇等，2000）、HBV、HCV（杜勇等，1999；Francescaetal.,2001；潘衛(wèi)等，2001）、日本血吸蟲（歐陽理等，2002）等，說明完全可以利用隨機(jī)肽庫鑒定抗原的線性和構(gòu)象表位，大大簡化了重組免疫原的克隆、鑒定和表達(dá)等過程，為表位鑒定研究增添了新的手段。絲狀噬菌體具有免疫原性，無須佐劑即可產(chǎn)生抗體，這意味著噬菌體展示系統(tǒng)可以作為候選疫苗抗原表位的遞呈工具。利用展示肉毒梭菌中和表位的噬菌體不加佐劑直接免疫小鼠，血清ELISA檢測顯示，免疫小鼠是對照小鼠的OD值的2~10倍。表明噬菌體展示的表位具有明顯的抗原性。噬菌體展示技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)噬菌體展示技術(shù)作為一種新興的研究方法和工具，在研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上已被廣泛應(yīng)用。它具有很多顯著的優(yōu)點(diǎn)，如：A.高通量的淘選將靶標(biāo)分子（抗體）固定在固相載體上，加入噬菌體展示肽庫（噬菌體的數(shù)量可達(dá)1011PFU），利用抗原-抗體的特異性親和力將與抗體結(jié)合的噬菌體吸附在固相載體上，不能結(jié)合的噬菌體仍在溶液中，可以通過洗滌去除，再將特異結(jié)合的噬菌體洗脫下來，如此反復(fù)數(shù)輪擴(kuò)增、淘選，即可將有用的基因從多達(dá)百萬以上的噬菌體克隆中分離出來。B.可用于模擬表位的篩選利用噬菌體展示技術(shù)得到模擬表位的報(bào)道較多（Giuseppe,2001；Seshietal.,2002；Ouyangetal.,2003）。李全喜等（1997）利用單抗9E10篩選噬菌體隨機(jī)肽庫，結(jié)果獲得了兩個(gè)陽性克隆，其中一個(gè)與抗原天然序列同源，而另一個(gè)則完全不同（即為模擬表位）。模擬表位同樣可誘發(fā)與天然表位相似的特異性免疫反應(yīng)，例如利用乙肝病毒的模擬表位免疫小鼠可誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的乙肝病毒抗體。C.易于純化重組噬菌體的純化步驟簡單、不要求昂貴的試劑與設(shè)備，在一般的實(shí)驗(yàn)室條件下就可以完成。用于鑒定表位和受體所用的噬菌體載體為13單鏈?zhǔn)删w。由于M13噬菌體是溫和型噬菌體，不裂解宿主菌，成熟的噬菌體可分泌到培養(yǎng)基中，通過離心收集培養(yǎng)上清，再向其中加入沉淀劑即可將上清中大量噬菌體粒子沉淀下來，從而富集得到含外源基因產(chǎn)物的重組噬菌體。盡管如此，在噬菌體展示技術(shù)中仍然存在一些不足。所建的肽庫容量只能達(dá)到109，要想構(gòu)建大片段的肽庫很困難。需要解決肽庫的多樣性問題。第三，少數(shù)多肽由于疏水性過強(qiáng)，或由于影響外膜蛋白的折疊而不能展示在噬菌體表面。作為一種新技術(shù)，類似的具體問題還很多。但這些暫時(shí)的缺點(diǎn)并不能掩蓋其巨大應(yīng)用潛力。1985年，SmithGP第一次將外源基因插入絲狀噬菌體f1的基因Ⅲ，使目的基因編碼的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌體表面，從而創(chuàng)建了噬菌體展示技術(shù)。該技術(shù)的主要特點(diǎn)是將特定分子的基因型和表型統(tǒng)一在同一病毒顆粒內(nèi)，即在噬菌體表面展示特定蛋白質(zhì)，而在噬菌體核心DNA中則含有該蛋白的結(jié)構(gòu)基因。另外，這項(xiàng)技術(shù)把基因表達(dá)產(chǎn)物與親和篩選結(jié)合起來，可以利用適當(dāng)?shù)陌械鞍讓⒛康牡鞍谆蚨嚯奶暨x出來。隨著噬菌體展示技術(shù)的日益完善，該技術(shù)在眾多基礎(chǔ)和應(yīng)用研究領(lǐng)域產(chǎn)生的影響已日漸明顯。噬菌體展示技術(shù)系統(tǒng)是一種強(qiáng)大的蛋白質(zhì)定向進(jìn)化工具，能夠在細(xì)菌病毒（噬菌體）的幫助下將外源基因表達(dá)為融合蛋白質(zhì)。這項(xiàng)技術(shù)已有數(shù)十年的歷史，但在最近幾十年中，隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，噬菌體展示技術(shù)系統(tǒng)的應(yīng)用已經(jīng)越來越廣泛。本文將介紹噬菌體展示技術(shù)系統(tǒng)的基本概念、研究現(xiàn)狀、未來發(fā)展趨勢和挑戰(zhàn)，以及未來的研究方向和前景。噬菌體展示技術(shù)系統(tǒng)利用了噬菌體的特性，將外源基因插入到噬菌體基因組中，并在噬菌體感染細(xì)菌時(shí)表達(dá)出融合蛋白質(zhì)。這些融合蛋白質(zhì)通常包含噬菌體外殼蛋白的N端部分和外源蛋白質(zhì)的C端部分。由于噬菌體外殼蛋白的N端部分可以與噬菌體基因組編碼的其他蛋白質(zhì)相互作用，因此這些融合蛋白質(zhì)可以在噬菌體中形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。目前，噬菌體展示技術(shù)系統(tǒng)的研究已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展。該技術(shù)在抗體藥物、疫苗、細(xì)胞因子模擬物、神經(jīng)元受體和蛋白-蛋白相互作用等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用。然而，在噬菌體展示技術(shù)系統(tǒng)的應(yīng)用中也存在一些問題，如插入外源基因的容量限制、外源蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、融合蛋白質(zhì)的正確折疊和翻譯后修飾等。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，噬菌體展示技術(shù)系統(tǒng)的未來發(fā)展趨勢和挑戰(zhàn)也在不斷變化。未來的研究將更加注重提高外源蛋白