南通大學生命科學學院主講:常燕微生物檢驗實驗實驗一食品微生物學檢驗菌落總數測定

Foodmicrobiologicalexamination：Aerobicplatecount一、實驗目的1、掌握食品中菌落總數（Aerobicplatecount）的測定的基本程序和要點。2、掌握菌落的計數原則3、學會對不同樣品稀釋度確定的原則二、實驗設備和材料

恒溫培養箱、冰箱、恒溫水浴箱、天平、均質器、振蕩器、無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸頭、無菌錐形瓶：容量250mL、500mL、無菌培養皿、pH計或pH比色管或精密pH試紙、放大鏡或/和菌落計數器、培養基和試劑：平板計數瓊脂培養基、磷酸鹽緩沖液、無菌生理鹽水三、實驗原理按食品安全國家標準的規定，食品中菌落總數（aerobicplatecount）是指食品檢樣經過處理，在一定條件下（如培養基、培養溫度和培養時間等）培養后，所得每g（mL）檢樣中形成的微生物菌落總數。國家標準菌落總數的測定采用標準平板培養計數法，根據檢樣的污染程度，做不同倍數稀釋，選擇其中的2—3個適宜的稀釋度，與培養基混合，在一定培養條件下，每個能夠生長繁殖的細菌細胞都可以在平板上形成一個可見的菌落。由此根據平板上生長的菌落數計算出計數稀釋度（稀釋倍數）和樣品中的細菌含量。五、實驗步驟（一）檢驗程序

（二）操作步驟

1、樣品的稀釋稱取25g樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質杯內，8000r/min～10000r/min均質1min～2min制成1:10的樣品勻液。并用梯度離心法稀釋成10-2—10-5。吸取1mL樣品勻液于無菌平皿內，每個稀釋度做兩個平皿。同時，分別吸取1mL空白稀釋液加入兩個無菌平皿內作空白對照。15mL～20mL冷卻至46℃的平板計數瓊脂培養基（可放置于46±1℃恒溫水浴箱中保溫）傾注平皿，并轉動平皿使其混合均勻。2、培養

待瓊脂凝固后，將平板翻轉，36±1℃培養48h±2h。水產品30±1℃培養72h±3h。3、菌落計數

可用肉眼觀察，必要時用放大鏡或菌落計數器，記錄稀釋倍數和相應的菌落數量。菌落計數以菌落形成單位（colony-formingunits，CFU）表示。五、結果與報告注意事項：計數原則（1）選取菌落數在30CFU～300CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計數菌落總數。低于30CFU的平板記錄具體菌落數，大于300CFU的可記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數應采用兩個平板的平均數。（2）其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘以2，代表一個平板菌落數。（3）當平板上出現菌落間無明顯界線的鏈狀生長時，則將每條單鏈作為一個菌落計數。（3）若所有稀釋度的平板上菌落數均大于300CFU，則對稀釋度最高的平板進行計數，其他平板可記錄為多不可計，結果按平均菌落數乘以最高稀釋倍數計算。（4）若所有稀釋度的平板菌落數均小于30CFU，則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。（5）若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數計算。（6）若所有稀釋度的平板菌落數均不在30CFU～300CFU之間，其中一部分小于30CFU或大于300CFU時，則以最接近30CFU或300CFU的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。菌落總數的計算方法（1）若只有一個稀釋度平板上的菌落數在適宜計數范圍內，計算兩個平板菌落數的平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數，作為每g（mL）樣品中菌落總數結果。（2）若有兩個連續稀釋度的平板菌落數在適宜計數范圍內時，按下列公式計算：式中：N——樣品中菌落數；∑C——平板（含適宜范圍菌落數的平板）菌落數之和；n1——第一稀釋度（低稀釋倍數）平板個數；n2——第二稀釋度（高稀釋倍數）平板個數；d——稀釋因子（第一稀釋度）。菌落總數的報告（1）菌落數小于100CFU時，按“四舍五入”原則修約，以整數報告。（2）菌落數大于或等于100CFU時，第3位數字采用“四舍五入”原則修約后，取前2位數字，后面用0代替位數；也可用10的指數形式來表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數字。（3）若所有平板上為蔓延菌落而無法計數，則報告菌落蔓延。（4）若空白對照上有菌落生長，則此次檢測結果無效。（5）稱重取樣以CFU/g為單位報告，體積取樣以CFU/mL為單位報告。實驗二、食品中金黃色葡萄球菌檢驗

Foodmicrobiologicalexamination:Staphylococcusaureus一、實驗目的1、了解食品中金黃色葡萄球菌檢驗的安全學意義2、掌握食品中金黃色葡萄球菌定性和定量檢驗的原理和方法。3、學會測定面包中的金黃色葡萄球菌二、實驗材料和設備除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：

恒溫培養箱、冰箱、恒溫水浴箱、天平、均質器、振蕩器、無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸頭、無菌錐形瓶：容量100mL、500mL、無菌培養皿、注射器：0.5mL、pH計或pH比色管或精密pH試紙、培養基和試劑：氯化鈉胰酪胨大豆肉湯、氯化鈉肉湯、血瓊脂平板、Baird-Parker瓊脂平板、腦心浸出液肉湯(BHI)、兔血漿、磷酸鹽緩沖液、營養瓊脂小斜面、革蘭氏染色液、無菌生理鹽水三、實驗原理

國家保準金黃色葡萄球菌檢驗的原理如下：金黃色葡萄球菌耐鹽性強，在100—150g/L的氯化鈉培養基中能生長，適宜生長的鹽含量為5%—7.5%，可以利用這特性對金黃色葡萄球菌增菌，抑制雜菌。金黃色葡萄球菌可以生產溶血素，在血平板上生長，菌落周圍有透明的溶血環，可產生卵磷脂酶，分解卵磷脂，產生甘油脂和可溶性磷酸膽堿，所以在B—P平板上生長，菌落為黑色，周圍有一混濁帶，在其外層有一透明圈，利用此特性可分離金黃色葡萄球菌。金黃色葡萄球菌還可以產生凝固酶，凝固酶可使血漿中的血漿蛋白酶原變成血漿蛋白酶，使血漿凝固，這是鑒定致病性金黃色葡萄球菌的重要的指標，是不是致病的金黃色葡萄球菌主要看它是否產生凝固酶。四、實驗步驟（一）金黃色葡萄球菌定性檢驗程序（二）操作步驟1、樣品的處理

稱取25g樣品至放入盛有225mL7.5%氯化鈉肉湯或10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1min～2min。2、增菌和分離培養（1）將上述樣品勻液于36℃±1℃培養18h～24h。金黃色葡萄球菌在7.5%氯化鈉肉湯中呈混濁生長，污染嚴重時在10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯內呈混濁生長。（2）將上述培養物，分別劃線接種到Baird-Parker平板和血平板，血平板36℃±1℃培養18h～24h。Baird-Parker平板36℃±1℃培養18h～24h或45h～48h。（3）金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直徑為2mm～3mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落有似奶油至樹膠樣的硬度，偶然會遇到非脂肪溶解的類似菌落；但無混濁帶及透明圈。在血平板上，形成菌落較大，圓形、光滑凸起、濕潤、金黃色（有時為白色），菌落周圍可見完全透明溶血圈。挑取上述菌落進行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗。3、鑒定（1）染色鏡檢：金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，排列呈葡萄球狀，無芽胞，無莢膜，直徑約為0.5μm～1μm。（2）血漿凝固酶試驗：挑取、Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落1個或以上，分別接種到5mLBHI和營養瓊脂小斜面，36±1℃培養18h～24h。

取新鮮配置兔血漿0.5mL，放入小試管中，再加入BHI培養物0.2mL～0.3mL，振蕩搖勻，置36±1℃溫箱或水浴箱內，每半小時觀察一次，觀察6h，如呈現凝固（即將試管傾斜或倒置時，呈現凝塊）或凝固體積大于原體積的一半，被判定為陽性結果。同時以血漿凝固酶試驗陽性和陰性葡萄球菌菌株的肉湯培養物作為對照。結果如可疑，挑取營養瓊脂小斜面的菌落到5mLBHI，36±1℃培養18h～48h，重復試驗。五、結果與報告1、結果判定：可疑微生物可判定為或不為金黃色葡萄球菌。2、結果報告：在25g（mL）樣品中檢出或未檢出金黃色葡萄球菌。實驗三、食品中大腸菌群計數

Foodmicrobiologicalexamination:Enumerationofcoliforms一、試驗目的1、了解大腸菌群在食品安全檢驗中的意義2、學習并掌握食品中大腸菌群的測定方法二、試驗材料與設備除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：

恒溫培養箱、冰箱、恒溫水浴箱、天平、均質器、振蕩器、無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸頭、無菌錐形瓶：容量500mL、無菌培養皿、pH計或pH比色管或精密pH試紙、菌落計數器、培養基和試劑：月桂基硫酸鹽胰蛋白胨、煌綠乳糖膽鹽（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB）肉湯、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VioletRedBileAgar，VRBA、）磷酸鹽緩沖液、無菌生理鹽水、無菌1mol/LNaOH、無菌1mol/LHCl三、實驗原理

國家標準中食品大腸菌群的檢測有兩種方法：MPN計數法和平板計數法。

MPN計數法是基于泊松分布的一種間接計數方法。樣品經過處理與稀釋后用月桂基硫酸鹽蛋白胨肉湯（LST）進行初發酵，是為了證實樣品或其稀釋液中是否存在符合大腸菌群的定義，即“在37℃分解乳糖產酸產氣”，而在培養基中加入的月桂基硫酸鹽能抑制革蘭氏陽性菌（但有些芽孢菌、腸球菌能生長），有利于大腸菌群的生長和挑選。初發酵后觀察LST肉湯管是否產氣。初發酵產氣管，不能肯定就是大腸菌群，經過復發酵試驗后，有時可能成為陰性。有數據表明，食品中大腸菌群檢驗步驟的符合率，初發酵和證實試驗相差較大。因此，在實際檢測工作中，證實試驗時必需的。而復發酵時培養基中的煌綠和膽鹽能抑制產芽孢細菌。從規定的反應呈陽性管數的出現率，用概率論來推算樣品中菌數最近似的數值。MPN檢索表只給了三個稀釋度，如改用不同的稀釋度，則表內數字應相應降低或增加10倍。該法適用于目前食品衛生標準中大腸菌群限量用MPN/100g(mL)表示的情況。四、操作步驟（一）檢驗程序

（二）操作步驟1、樣品的稀釋（1）固體和半固體樣品：稱取25g樣品,放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質杯內,8000r/min～10000r/min均質1min～2min，制成1:10的樣品勻液。并用梯度離心法稀釋成10-2—10-5。吸取1mL樣品勻液于無菌平皿內，每個稀釋度做兩個平皿。同時，分別吸取1mL空白稀釋液加入兩個無菌平皿內作空白對照。15mL～20mL冷卻至46℃的平板計數瓊脂培養基（可放置于46±1℃恒溫水浴箱中保溫）傾注平皿，并轉動平皿使其混合均勻。2、初發酵試驗

每個樣品，選擇3個適宜的連續稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯），36℃±1℃培養24h±2h，觀察倒管內是否有氣泡產生，24h±2h產氣者進行復發酵試驗，如未產氣則繼續培養至48h±2h，產氣者進行復發酵試驗。未產氣者為大腸菌群陰性。3、復發酵試驗用接種環從產氣的LST肉湯管中分別取培養物1環，移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）管中，36℃±1℃培養48h±2h，觀察產氣情況。產氣者，計為大腸菌群陽性管。4、大腸菌群最可能數（MPN）的報告按3、確證的大腸菌群LST陽性管數，檢索MPN表（見附錄B），報告每g（mL）樣品中大腸菌群的MPN值。試驗四、菌落總數快速檢驗紙片一、試驗目的學會使用快速檢驗紙片測定菌落總數二、實驗材料菌落總數快速檢驗紙片，微量移液器，槍頭（1mL），250mL三角瓶，無菌試管（15mL）三、實驗原理

菌落總數快速檢驗紙片可用于各類食品及飲用水中菌落總數的測定，由細菌營養培養基和酶顯色劑等組成。與傳統方法相比，省去了配制培養基、消毒和培養器皿的清洗處理等大量輔助性工作，隨時可以開始進行抽樣檢測，而且操作簡便，通過酶顯色劑的放大作用，使菌落提前清晰地顯現出來，培養十幾小時就開始出現紅色菌斑，非常適合于食品衛生檢驗部門和食品生產企業使用。四、操作步驟

1、取樣品25g（或mL）放入含有225mL無菌水的玻璃瓶內，經充分振搖做成1:10的稀釋液，用1ml滅菌吸管吸取1:10稀釋液1mL，注入含有9mL滅菌水的試管內，用1mL滅菌吸管反復吸吹做成1:100的稀釋液，以此類推，每次換一支吸