大腸桿菌DNA聚合酶1的作用與應(yīng)用資料_第1頁
大腸桿菌DNA聚合酶1的作用與應(yīng)用資料_第2頁
大腸桿菌DNA聚合酶1的作用與應(yīng)用資料_第3頁
大腸桿菌DNA聚合酶1的作用與應(yīng)用資料_第4頁
大腸桿菌DNA聚合酶1的作用與應(yīng)用資料_第5頁
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文檔簡介

大腸桿菌DNA聚合酶I生物08220814151008肖樂第一頁，共十四頁。大腸桿菌DNA聚合酶I的活性5’-3’DNA聚合酶活性15’-3’外切核酸酶活性23’-5’外切核酸酶活性3第二頁，共十四頁。5’-3’DNA聚合酶活性

在引物RNA'-OH末端，以dNTP為底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ使DNA鏈沿5‘→3‘方向延伸。3'Mg2+,dNTP5'

5'3'

DNA聚合酶I第三頁，共十四頁。5’-3’外切核酸酶活性從5'→3'方向水解DNA生長鏈前方的DNA鏈，主要產(chǎn)生5'-脫氧核苷酸。這種酶活性只對DNA上配對局部(雙鏈)磷酸二酯鍵有切割活力作用，方向是5'→3'。3'Mg2+5'

5'3'DNA聚合酶I第四頁，共十四頁。3’-5’外切核酸酶活性由3’端水解DNA鏈，反響底物是帶3'-OH的雙鏈DNA或單鏈DNA，其活性從3'-OH端降解ds-DNA，可被5'3'聚合活性封閉，也可被帶5'磷酸的dNMP抑制5'Mg2+Mg2+,dNTP3'3'5'DNA聚合酶IDNA聚合酶I第五頁，共十四頁。活性能發(fā)生的反響切口平移置換反應(yīng)活性第六頁，共十四頁。置換反響如果只有一種dNTP存在，3'5'外切核酸活性將從3'-OH端降解DNA，而5'3'聚合酶活性又在合成DNA，然后在該位置發(fā)生一系列的合成和外切反響，直到露出與該dNTP互補的堿基。3'5'外切酶活性5'3'

5'3'聚合酶活性第七頁，共十四頁。切口平移首先在鎂離子存在下用少量DNaseI處理雙鏈DNA模板，產(chǎn)生少量切口。在切口處利用大腸桿菌DNA聚合酶I的5’-3’外切核酸酶活性是切口沿5’-3’方向移動，同時5’-3’DNA聚合酶活性又不斷合成DNA。

5'

Mg2+DNaseI

3'

5'

dNTP大腸桿菌DNA聚合酶I

3'

第八頁，共十四頁。應(yīng)用13’-端的末端標記2切口平移法標記DNA3合成cDNA的第二鏈第九頁，共十四頁。3’-端的末端標記先用此酶的3’→5’核酸外切酶活性，切除凸出的3’-粘端，形成5’-凸出粘端；在以其5’→3’聚合酶活性使其使其補平，在高濃度dNTP的條件下，3’-端的外切反響與dNTP的攙入反響到達平衡。假設(shè)dNTP中有放射性標記的核苷酸，即可使產(chǎn)物成為3’-末端的帶標記的DNA。第十頁，共十四頁。切口平移法標記DNA在Dnase的作用的根底上產(chǎn)生連內(nèi)切口，應(yīng)用此酶的5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性的同步聯(lián)合反響，使切口沿DNA鏈從5’-端向3’-端移動。假設(shè)用聚合反響的原料dNTP帶有放射性核素α-32P，就能使生成的雙鏈帶有標記物。根據(jù)此原理可做DNA雜交探針。第十一頁，共十四頁。合成cDNA的第二鏈

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