結直腸癌RAS檢測指南主要內容結直腸癌是英國發生率最高的癌癥之一，每年新診斷4萬例，5年生存率55%，只有23%轉移病人有治療前分期數據，15%的病人雖然接受了手術治療，但是仍然會出現復發轉移。結直腸癌治療的一個重要發展步驟是單克隆抗體的出現，它能靶向抑制EGFR。單克隆抗體治療包括西妥昔單抗、貝伐單抗和帕尼單抗。現有數據明確表明KRAS突變結直腸癌抗EGFR治療無效。早期數據限于KRAS密碼子12和13,能夠預測西妥昔單抗治療是否無效，NICE推薦該研究結果用于實際工作中。西妥昔單抗只能用于肝轉移性結直腸癌，在確定病人是否適合該治療時應進行KRAS密碼子12和13突變檢測。本指南里沒有推薦一線化療后進展的轉移性結直腸癌病人使用EGFR抑制劑，雖然已有結果支持這樣使用°KRAS檢測已成為常規項目，幫助分層病人是否適合抗EGFR治療。英國之外的其它組織也推薦結直腸癌治療時要進行KRAS基因的檢測。Wong醫生在JCP雜志上發文，文章主要用于指導英國的臨床實踐工作，文中還涉及結直腸癌NRAS的檢測，對影響結直腸癌RAS檢測的技術和研究內容也進行了回顧，文中特別強調的是檢測的實用意義。文章內容順序按照RAS標本檢測程序進行。病例選擇常規檢測還是按需檢測結直腸癌癥RAS檢測是常規檢測還是按需檢測仍有爭議。常規檢測模式指所有手術切除標本都常規行基因檢測，在病理報告上描述結果。未來某個時候如果病人需要抗EGFR治療，這些分子數據立刻可以使用。常規檢查可以很好解決過長的KRAS基因檢測時間。檢測時間過長并不是分析方法造成的，大部分時間用于篩選合適的組織。常規檢測還會避免出現因組織塊丟失、組織塊保存不當受損或者因用于其它檢查而不能進行RAS檢查。常規檢查缺點是對那些永遠不發展為轉移的病人，做這種檢查是不必要的。減少不必要檢查的方法就是找出具有高危轉移因素的結直腸癌標本進行檢測，例如存在血管侵犯、淋巴結轉移或者是病理T4分期。常規檢查最大缺點是，新數據表明RAS不只是KRAS密碼子12和13突變。如果病人擬接受抗EGFR治療，之前曾經接受過KRAS密碼子12和13檢查，那么現在這個病人還要接受NRAS突變和附加KRAS突變檢測。近期研究表明，更多基因與抗EGFR治療耐藥有關，新靶向治療不斷出現。按需檢查是病例經過多學科組討論后決定接受相關治療時才會進行的檢查。撰寫本文時，英國的實驗室給結直腸癌轉移病人做RAS檢測保險才給予賠付，這意味著在英國按需檢測已經成為主流實踐方式。為了在英國能夠更好地實現RAS檢測，應該對現有資源進行合理分布，建立更合理的檢測系統，改善結直腸癌組織送檢途徑，確保及時送達標本進行按需檢測。原發還是轉移組織很多研究都在探討KRAS突變在原發或是轉移的結直腸癌組織中是否一致。一項meta分析顯示一致性非常高，達94.1%。然而也有一些數據表明這種一致性與解剖位置有關，肺和淋巴結轉移灶與原發灶一致性較差。上述的meta分析中也表明淋巴結轉移和原發結直腸癌的一致性是81.3%。由于原發灶與轉移灶缺少絕對的遺傳學一致性，如果可以獲取轉移結直腸癌組織，并能將組織盡快送達檢測實驗室，那么對轉移組織進行檢測是優先的。如果轉移組織很不容易獲取，就送檢原發位置的組織，因為截至目前為止沒有充足證據說明轉移灶組織RAS基因檢測更具特異性。標本類型組織病理學或細胞學標本都可以用作RAS檢測，包括使用HE染色或是免疫組化染色的切片標本。一些標本例如內鏡或粗針活檢標本，由于標本獲取技術導致標本有限，如果是切除標本就可以有多個腫瘤組織標本可用，但通常只選擇一個具有代表性的組織標本進行檢查。有限的標本引發了一些需要思考的內容。只含有腺瘤的活檢標本第一種是如果病人臨床和影像學證據清楚顯示患有結直腸癌，但內鏡活檢標本卻只有腺瘤，而且該標本是唯一可用于RAS檢測標本。這時應怎么做？有人認為不應檢測腺瘤標本，應對原發或轉移灶重新活檢；另一些人認為應檢測腺瘤，一旦鑒定突變應報告，若沒有突變，也不能證明腫瘤沒有突變，仍需重新活檢。第二種方法是基于RAS基因突變通常發生在腫瘤形成早期階段，且是關鍵驅動突變，證明腺瘤中存在RAS突變，表明從腺瘤發展來的結直腸癌也可能有該突變。然而RAS突變也可能是結直腸癌發生晚期事件，也就是說腺瘤可能是RAS野生型，而腺癌則可能是RAS突變型。第三種方法與第二種相似，對具有高級別異型增生的腺瘤進行檢測，高級別異型增生是更接近癌癥的一種狀態。腫瘤內突變的異質性另一個問題是若有多個切除標本供選擇，究竟選哪一個？這個主題涉及腫瘤突變異質性，即同一結直腸癌中不同克隆的基因表型可能不一致。內鏡標本通常是有限和表淺標本，若突變克隆位于腫瘤深部，可能檢測不到；如果是切除標本，突變克隆只存在于某個特定組織塊內，也可能檢測不到。根據最新KRAS和NRAS數據，通常認為只要存在任何一種RAS突變，就足以預測抗EGFR治療耐藥。如果超過一種以上RAS突變共存于同一結直腸癌內，也不會有更多的臨床意義。更具臨床意義的是同一腫瘤內既有RAS突變型克隆又有野生型克隆，特別是突變克隆比例很低的時候。后者指的是一種低水平突變，原因可能是結直腸癌DNA抽提物中只有一小部分RAS突變基因，這需要與組織塊中惡性腫瘤細胞含量低導致非惡性腫瘤細胞DNA稀釋突變基因這種情況鑒別。一些數據顯示，同一結直腸癌組織內還存在KRAS基因型變化。小部分結直腸癌是野生型和KRAS外顯子2和3突變克隆的混合，這種基因型的變化很小：10/13標本中，某一特定KRAS突變克隆超過腫瘤80%。最近一項研究使用高分辨率溶解曲線分析檢查30例配對內鏡標本和切除標本的KRAS突變，結果發現每對標本基因型完全一致。更敏感方法回顧分析野生型結直腸癌是否有更低水平KRAS突變，此水平突變對抗EGFR治療是否有影響。Sanger測序或realtime-PCR鑒定的野生型結直腸癌，7%-20%病例經焦磷酸測序、Therascreen檢查包、鎖定核酸PCR或突變擴增PCR再次檢查，發現KRAS密碼子12和13突變，此種水平KRAS突變結直腸癌抗EGFR治療是否有效仍需研究。更敏感檢查方法出現后，腫瘤內突變異質性研究可能會有特別進展，目前臨床工作可按指南規定進行。如果既有切除標本又有活檢標本可用，檢測時應優選組織塊；如果只有活檢組織可用，結果是野生型基因型，現在沒有充足證據支持再次活檢排除低水平突變。突變檢查不僅僅影響治療選擇，更重要的是低水平突變的存在可能是預測未來抗EGFR治療耐藥的標志。通常認為這些突變克隆開始時量少，但抗EGFR治療促使突變克隆過度生長，當量足夠充足時表現為對治療耐藥。準備工作中的影響因素已有綜述文章詳細描述組織標本制備過程中哪些因素會影響后續的分子檢測結果，以下內容與結直腸癌的RAS檢測關系特別密切。大部分用作RAS突變檢測的結直腸癌組織來自福爾馬林固定的活檢標本或是手術切除的原發腫瘤。后者標本固定通常會延遲或固定效果不好，主要由于大腸沒有被完全剖開或是沒有沖洗干凈，或是只取材了部分固定的標本。延遲或固定效果不好，導致DNA因為凋亡或是壞死而降解，福爾馬林浸泡過長也使DNA由于過度交聯而降解。DNA質量不合格，降低了檢測突變敏感性，增加失敗幾率。福爾馬林固定還可以致胞嘧啶脫氨基，導致檢測到人為因素所致的突變。在英國Bouin固定液通常不再使用，較早期的組織塊可能由Bouin固定。需要小心的信號是組織塊內組織完全變成黃色或是組織中含有DNA抽提過程中的洗脫液。以Bouin固定的組織行分子檢測時失敗幾率較高，部分由于組織保存時間過長，還有就是Bouin固定液中一些成分能加速核酸降解。一些醫院固定內鏡活檢標本前習慣先將標本錨定在醋酸帶上，如果不去除醋酸帶會導致DNA產量更低。記錄腫瘤細胞含量對分子學分析來說是恰當的。組織被做成切片或是直接切取用于DNA抽提，沒有技術差別，切取后組織應盡快DNA提取以減少DNA氧化。惡性腫瘤細胞含量當體突變組織中既包含有惡性細胞又含有非惡性細胞時，精確定量惡性腫瘤細胞含量很關鍵。在最后的DNA提取物中惡性腫瘤細胞DNA所占的比例能很好地反應組織病理學惡性核酸占所有核酸的比例，優于用腫瘤所占面積的比例進行衡量。這一點對結直腸癌特別重要，壞死和無細胞區域不應該被計算在內，應當將其盡可能去除。腫瘤中非整倍染色體很常見，可能潛在增加或減少檢測敏感性。本文推薦，用于檢測突變的最少腫瘤細胞含量應是檢測最低腫瘤細胞含量的二倍。例如某種方法檢測要求腫瘤細胞最低含量5%，突變檢查時最少需要組織中含有10%的惡性細胞比較合適。觀察者評估結直腸癌中腫瘤細胞含量時會有變化，所以實驗室希望使用一個安全的最小腫瘤細胞含量進行分析，但這個比例仍需進一步驗證。分析方面分析方法選擇在英國很多分析方法用于KRAS檢測，NHS實驗室廣泛使用的分析包括house焦磷酸分析法、COBAS、Therascreen焦磷酸法或RGQ包、Sanger測序和HRM分析，已有研究比較不同分析方法的特點。各種分析方法已做詳細闡述，NICE診斷評估程序中也進行了分析，相關文章即將發表（表1）分析方法檢出限憂勢缺點.PvTMmqueucirLg5%費用某些特定較&橙刪到COBAS5%,速度「自動分析有限的突爽范圍TTierggRGQFOF、1-5^?速度有限的突寰范圍"0%廣的夾委物圍勞動強度，時間消蔻費用』速度不能區分突裹類型表1.較常應用的RAS檢查方法特征比較分析方法的選擇也許會受最新研究結果影響，即任何RAS突變足以預測抗EGFR治療耐藥。所以未來檢測方法的重點要放在RAS檢測上，而不僅僅只是KRAS。分析方法的確認RAS分析方法中的幾個方面在真正用于臨床前應進一步確證。首先要明確，檢查突變時所需最少腫瘤細胞含量。另外分析的準確性和精確性也需要進行評估和記錄。第三，確證所需要的臨床標本數量依賴于統計功效。目前推薦序列分析法用作金標準方法。檢測失敗大多數結直腸癌RAS檢測失敗都是由分析前因素所致，如DNA模板數量不足或質量較差。影響模板數量原因包括標本大小、大體切除程度、惡性組織比例。如果蠟塊中惡性組織不充足，就需要進一步獲取。矛盾的是如果有太多的模板也可能導致失敗，這時只需稀釋就可以獲得成功。影響模板質量因素包括固定相關的降解，是檢查失敗的主要原因，尤其是當擴增片段較大時。當檢測失敗時應當對分析技術進行評估，如果有可能應對標本采用其它方法進行分析。報告與解釋指導靶向治療的最小KRAS含量已有明確推薦（表2）。最近的爭論是否KRAS密碼子13突變對抗EGFR治療耐藥影響較小。報告內容舉例被巷祖貌塊參序號擬提取DXA組織中腫瘤細胞含量便用的分析方遷1包括K2T的序號和的析檢測范闈與限制4紿某如果檢測方茂可以檢徹還常報告核酸與氨基酸的夢化對結果的解釋賣驗室序號:1234-M擬進行缶析的標本腫港細胞含量約為瀚土采用R.GQPCR工具包行Py.tossquaicii?j照方法可詼分析'個央孰01a，12A*,尸A喝，痘沁,12Cy3fifal』LSAwph分析檢出限為盤弘。痛A對抗EGFR治療無反應表2.用于指導EGFR治療的最小RAS含量新數據表明KRAS密碼子12和13野生型時,KRAS密碼子59、61、117和146或NRAS密碼子12、13、59和61仍可預測抗EGFR治療耐藥。NRAS密碼子117和146突變無影響。本文推薦RAS檢測至少應包括KRAS密碼子12、13、59、61、117、146和NRAS密碼子12、13、59、61。質量控制內部因素為了驗證分析的精確性，應該向實驗室提供是否需要重復實驗。大多數RAS分析精確度高，有經驗的試驗室使用時不需要重復實驗。同樣原因，不需要使用不同方法進行驗證，當然如果一種檢測方法失敗，需要有另一種方法進行檢測，該方法和一線方法一樣提供同樣的檢測精確度。應當記錄檢測失敗的比例，并分析每一次失敗的可能原因。推薦每一批標本分析時都應設置最低陽性對照和陰性對照。檢查是為了能夠鑒定最低水平的突變，因此推薦用DNA含量已知的標本鑒定所需最低標本含量。外部因素任何一個提供RAS檢測的實驗室都應該包括外部質量保證程序，實驗室也應當有授權。另外鼓勵實驗室參與標本互換程序，允許其它實驗室對同一標本進行交叉分析，特別是當標本檢測失敗時。審計標準審計標準應當遵循既往數據，如所有結直腸癌病例中KRAS外顯子2突變應在40%，KRAS外顯子3或4突變應在6%，NRAS外顯子2或突變應在3%。上述數據來自總人群分析結果。進一步的數據如不同病人、不同腫瘤特征是否會影響結果需進一步研究。檢測時間大多數RAS檢測都是按需檢測，所以檢測時間很關鍵，通常對檢測時間有幾個定義，從檢測實驗室收到檢測組織到最后發出報告的時間是比較認可的檢測時間。本文推薦KRAS密碼子12和13檢測時間是7個工作日。但是關于RAS檢測的要求越來越多，所以時間可能也會更長。通常大部分實驗室會先檢測突變發生率最高的密碼子，如果是野生型再對其它密碼子進行檢測。還有一種方法就是對所有RAS密碼子同時進行檢測。前者通常花費的時間較長，對需要立即決定治療方案的病人可能會延遲治療，因此推薦90%以上的標本檢測時間應小于7個工作日。未