組織培養HeLa細胞傳代早期的組織培養

1885年，Roux用溫生理鹽水培養雞胚組織，首次采用"Tissueculture"1903年，Jolly用蓋片懸滴法培養蠑螈白細胞1906年，Beebe蓋片懸滴培養狗淋巴細胞組織培養的建立

1907年，Harrison培養蛙胚神經成功，創建蓋片凹玻璃懸滴培養法，公認為組織培養真正的開始1910年，Carrel完善懸滴培養法，將無菌技術應用到組織培養中組織培養的進展

1943年，Earle等創建單層細胞培養法，首建長期傳代的L-細胞系1948年，Sanford創建單細胞分離培養法，獲L-細胞純系1951年，Gey首建人腫瘤細胞——HeLa細胞系1961年，Hayflick首建人二倍體細胞系25種（hayflick界限）組織培養發展概況我國組織培養的發展

30年代傳入、50年代建立實驗室60年代我國建立世上第一個肝癌細胞系(BEL16)1985年成立了中國典型培養物保藏中心1990年中科院建立了細胞庫附：組織培養在植物學界

1902年，德國植物學家Haberlandt就預言植物細胞的全能性1934年，荷蘭植物學家溫特發現生長素，并證實了對植物細胞培養的作用1937年，普林斯頓的White等實驗室獲得植物培養物的愈傷組織并長期培養成功。這是植物細胞與組織的首次成功1958年，Steward在人工條件下用胡蘿卜根部的細胞培育出了新植株優缺點及應用組織培養發展概況組織培養器官培養、組織培養、細胞培養原代培養、傳代細胞系、細胞株、克隆懸浮型、貼附型上皮細胞型細胞成纖維細胞型細胞游走型細胞不規則型細胞生存條件

基本營養物質生長刺激因子水溫度氣體和氫離子濃度無菌的環境（無菌操作）其它（濕度、光等）

無菌操作環境的滅菌器械、器皿的清洗與滅菌無菌操作操作前要洗手，并用75%酒精噴手。試劑瓶等也要以酒精擦試。點燃酒精燈，操作在火焰附近進行，耐熱物品可在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時間不能太長，并冷卻后才能使用，吸取過營養液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。操作動作要準確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動，增加污染機會。不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺面上用品要布局合理。主要儀器設備超凈工作臺培養用液的配制、滅菌與保存（一）平衡鹽緩沖液

磷酸鹽緩沖液（PBS液，無Ca2+、Mg2+離子）：8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4、0.24gKH2PO4，溶于800mL去離子水中，用鹽酸將pH值調節至7.4，然后定容至1L。過濾后121oC滅菌20min，4oC保存

培養基

主要成分（天然）：血清、血漿、胚胎浸出液、水解乳蛋白等。

主要成分（合成）：氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽、輔助物質(核酸降解物、氧化還原劑等)。如：RPMI1640、DMEM、HamF12和Mc-Coy5A以超純水配制；過濾除菌、4oC保存。工作液含有10％FBS、1%雙抗抗生素

為防止微生物污染，培養基需加入青霉素、鏈霉素、卡那霉素和慶大霉素等。常用的是青霉素和鏈霉素的混合液。終濃度：青霉素10000U/mL、鏈霉素10000ug/mL培養用液的配制、滅菌與保存（二）消化液胰蛋白酶溶液胰酶溶液在pH8.0，溫度37℃，作用能力最強。注意：鈣離子、鎂離子和血清蛋白的存在會降低胰酶活力。胰酶溶液常用PBS或者無鈣、鎂離子的D-Hanks平衡鹽溶液配制成0.25%溶液。EDTA·Na2溶液化學螯合劑，對細胞有一定的離觧作用，而且毒性小。常用工作液濃度為0.02%。

注意：使用EDTA處理細胞后，一定要用PBS沖洗干凈，殘留的EDTA會影響細胞生長。pH調整液NaHCO3

溶液

常用濃度5.6%。pH值超過后，可用高壓滅菌的10％醋酸溶液或通入CO2氣體方法調節。HEPES（N-2-羥乙基派嗪-N‘-2-乙黃酸）溶液

氫離子緩沖劑，具有較強的緩沖能力，能夠較長時間維持其緩沖作用。培養細胞的檢測常規檢查細胞生長狀況培養液污染生物學檢測形態：一般形態觀察、超微結構觀察、細胞骨架觀察生長特性：細胞生長曲線等細胞遺傳：DNA染色，DNA含量測定，染色體的核型分析

細胞轉化及惡性程度

細胞的密度細菌污染pH值變化對細胞的影響原代培養期傳代期衰退期潛伏期（貼附期）對數生長期平臺期衰退期細胞培養周期HeLa細胞傳代材料：HeLa細胞系美國霍普金斯大學GeorgeGey、MargaretGey等人，1951年來源：人宮頸癌細胞貼壁生長（能懸浮生長）形態：上皮細胞型

PBS

DMEM培養基

雙抗（100X）

消化液：0.25%胰蛋白酶－0.02%

EDTA溶液

試劑鏡檢，觀察并記錄細胞狀態吸棄培養基，加入1mlPBS溶液洗去殘余培養基向培養皿內滴加200ml消化液，37oC消化2-3min加500ml含10％血清的DMEM培養基（終止消化、懸浮細胞）

【細胞計數：取20ml細胞懸液以PBS稀釋后計數】按比例分兩盤，進行傳代。觀察：細胞分散均勻；密度：一約30%、一約60%。37oC、5％CO2培養，觀察細胞生長周期實驗步驟35mm平皿較淺，加液后移動時請拿穩，避免晃動；加消化液時，請均勻地滴加在皿底；消化時間不宜過久，以免影響細胞活性；可通過鏡檢確定是否終止消化；除加消化液時，其他加液時避免直接沖擊細胞；操作時，勿使皿蓋打開過久；勿使細胞長期處于干燥狀態；分盤后，將皿沿水平方向前后、左右各輕輕晃動幾次，使細胞分散均勻。注意事項鏡檢，觀察并記錄細胞狀態吸棄培養基加入1.5ml新鮮的完全培養基，加入150

l含有H2O2的完全培養基，至終濃度為0.8mm