ICS07.100

B46

備案號(hào)：62090-2019DB21

遼寧省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB21/T3062—2018

微生物飼料添加劑質(zhì)量控制技術(shù)規(guī)范

Technicalspecificationonqualitycontrolofmicrobialfeedadditives

DB21/T3062—2018

微生物飼料添加劑質(zhì)量控制技術(shù)規(guī)范

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了微生物飼料添加劑及混合型微生物飼料添加劑生產(chǎn)、采樣、檢驗(yàn)、鑒定、包裝、保存、

運(yùn)輸過(guò)程中的質(zhì)量控制和技術(shù)要求，描述了菌種檢驗(yàn)、鑒定及產(chǎn)品性能驗(yàn)證的通用方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于微生物飼料添加劑及混合型微生物飼料添加劑，不適用于轉(zhuǎn)基因微生物飼料添加劑。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB10648飼料標(biāo)簽

GB13078飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)

GB/T23181微生物飼料添加劑通用要求

NY/T1444微生物飼料添加劑技術(shù)通則

JJF1070定量包裝商品凈含量計(jì)量檢驗(yàn)規(guī)則

《中華人民共和國(guó)獸藥典》

《中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第2045號(hào)飼料添加劑品種目錄》

《伯杰氏細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》

《伯杰氏細(xì)菌命名手冊(cè)》

3術(shù)語(yǔ)和定義

3.1微生物飼料添加劑Microbialfeedadditives

微生物飼料添加劑是指在飼料中添加或直接飼喂給動(dòng)物的微生物或微生物及其培養(yǎng)物，參與調(diào)節(jié)胃

腸道內(nèi)微生態(tài)平衡或者刺激特異性或非特異性免疫功能、具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和提高飼料轉(zhuǎn)化效率的微生

物制劑。

3.2混合型微生物飼料添加劑Mixedmicrobialfeedadditives

由一種或一種以上的微生物飼料添加劑與載體或稀釋劑按一定比例混合，但不屬于添加劑預(yù)混合飼

料的飼料添加劑產(chǎn)品。

3.3目的菌Targetmicroorganisms

系指直接用于生產(chǎn)的菌種。

3.4種子批Seedlot

系指特定菌株的貯存物，通常包括原始種子、主種子批和工作種子批，建立種子批系統(tǒng)旨在保證原

粉生產(chǎn)的一致性。

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3.5原始種子Primaryseed

系指細(xì)菌分離株經(jīng)適應(yīng)性培養(yǎng)、傳代后，經(jīng)生物學(xué)特性、免疫原性和遺傳穩(wěn)定性等特性研究鑒定，

可用于微生物飼料添加劑生產(chǎn)的種子。原始種子用于主種子批的制備。

3.6主種子Mainseed

系由原始種子傳代擴(kuò)增至特定代次，并經(jīng)一次制備獲得的同質(zhì)和均一的懸液或干粉分裝于容器制備

而成。主種子用于制備工作種子。

3.7工作種子Workingseed

系由主種子傳代擴(kuò)增至特定代次，并經(jīng)一次制備獲得的同質(zhì)和均一的懸液分裝于容器制備而成。

4生產(chǎn)要求

微生物活菌的制備方法、工藝應(yīng)能保證其成品含有足夠的活菌數(shù)量，并在有效期內(nèi)保持其穩(wěn)定性，

同時(shí)應(yīng)防止外源因子的污染。

4.1生產(chǎn)用菌種

4.1.1名稱及來(lái)源

生產(chǎn)用菌種應(yīng)來(lái)自動(dòng)物體內(nèi)和人體的正常菌群;或?qū)?dòng)物體及人體無(wú)毒無(wú)害、具有促進(jìn)正常菌群生

長(zhǎng)和活性作用的外籍細(xì)菌。細(xì)菌的分離過(guò)程和傳代背景應(yīng)清晰，應(yīng)具備穩(wěn)定的生物學(xué)和遺傳學(xué)特性，并

能保持穩(wěn)定的活菌狀態(tài)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室和臨床試驗(yàn)證明安全、有效。并獲得具有資質(zhì)的微生物鑒定機(jī)構(gòu)出具

的菌種鑒定報(bào)告。

4.1.2種子批的建立

種子批分為三級(jí)，分別為原始種子、主種子和工作種子。

4.1.3種子批的檢定

菌種的屬、種型分類鑒定，應(yīng)依據(jù)最新版伯杰氏細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)（Bergey＇sManualofSystematic

Bacteriology）和伯杰氏細(xì)菌命名手冊(cè)（Bergey＇sManualofDeterminativeBacteriology）的有關(guān)規(guī)定進(jìn)

行，包括形態(tài)、生長(zhǎng)代謝特性檢查。

4.1.3.1培養(yǎng)特性

將菌種接種于特異性培養(yǎng)基，置有氧或厭氧環(huán)境中培養(yǎng)，觀察其生長(zhǎng)情況，確定菌種的好氧條件；

以劃線法觀察在瓊脂平皿上生長(zhǎng)的單個(gè)菌落的形狀、大小、表面、邊緣、透明度、色澤等特征；也可觀

察菌種在不同溫度、pH值或不同濃度的氯化鈉溶液等條件下的生長(zhǎng)特性等。

4.1.3.2染色鏡檢

取菌種的新鮮培養(yǎng)物涂片做革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌體的染色反應(yīng)、形態(tài)、大小和排列等，

有芽孢的細(xì)菌應(yīng)同時(shí)觀察芽孢的形狀、大小和位置（也可增做芽孢染色）。檢查結(jié)果均應(yīng)符合原始菌種

的特性。

4.1.3.3生化反應(yīng)

按特異的方法進(jìn)行，應(yīng)包括目的菌的關(guān)鍵生化反應(yīng)，結(jié)果應(yīng)符合原始菌種的特性。

4.1.3.4遺傳特性分析

采用16SrRNA序列測(cè)定，應(yīng)符合原始菌種的遺傳特性。

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4.1.3.5種子批的保存

原始種子和主種子應(yīng)凍干保存于4℃或-20℃，工作種子應(yīng)置于2℃～8℃保存。

種子批傳代應(yīng)限定傳代次數(shù)，原始種子批和主種子批啟開(kāi)后傳代次數(shù)不得超過(guò)10代，工作種子批

啟開(kāi)后至發(fā)酵培養(yǎng)傳代次數(shù)不得超過(guò)5代。

4.1.3.6安全性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)

4.1.3.6.1毒性試驗(yàn)

可選用靶標(biāo)動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)或采用常規(guī)方法進(jìn)行。

常規(guī)方法:用體重18～22g小鼠5只，每只腹腔注射0.3mL新鮮菌液，連續(xù)觀察3天，小鼠均應(yīng)健

康存活；或每只小鼠經(jīng)口灌胃0.5mL新鮮菌液，每天1次，連續(xù)3天，從第1天至第7天連續(xù)觀察，

小鼠均應(yīng)健康存活。注：新鮮菌液濃度為不少于推薦常規(guī)菌種使用時(shí)濃度。

4.1.3.6.2抗生素敏感性試驗(yàn)

采用瓊脂擴(kuò)散紙片法或微量稀釋法進(jìn)行菌株的抗生素敏感性檢查，應(yīng)符合原始菌種的特性。

4.1.3.6.3穩(wěn)定性試驗(yàn).

菌種在特異性培養(yǎng)基中，連續(xù)傳代30代次后，將第30代培養(yǎng)物做種子批檢查、鑒定，全部結(jié)果應(yīng)

與原始菌種的特性一致。

4.1.3.6.4選擇性特性試驗(yàn)

應(yīng)根據(jù)原始菌種的特性進(jìn)行耐熱性、耐酸性、耐堿性、耐膽鹽等相關(guān)特性考察。

4.1.4菌種保藏與管理

4.1.4.1管理制度

建立菌種管理制度，對(duì)菌種實(shí)行全流程管理。對(duì)菌種的保管應(yīng)有專人負(fù)責(zé)，單獨(dú)保藏，實(shí)行雙人雙

鎖管理。應(yīng)有程序和措施以保證菌種的安全，防止污染、丟失或損壞。

4.1.4.2菌種檔案

應(yīng)建立菌種檔案，涵蓋來(lái)源、鑒定、特性、保存、傳代、使用等信息，確保溯源性和穩(wěn)定性。菌種

信息應(yīng)完整、準(zhǔn)確、清晰的標(biāo)識(shí)于菌種保藏管。

4.2菌粉制備

應(yīng)包括種子液制備、大罐培養(yǎng)、收獲菌體（或芽孢）和菌體干燥制成菌粉等。

4.2.1生產(chǎn)用種子

使用主種子批菌種，接種于特異性培養(yǎng)基進(jìn)行多級(jí)種子擴(kuò)增，應(yīng)涂片做革蘭氏染色，在顯微鏡下觀

察5～10個(gè)視野，細(xì)菌的染色反應(yīng)、形態(tài)應(yīng)一致并符合原始菌種的特征。制備過(guò)程應(yīng)防止污染，菌種傳

代次數(shù)應(yīng)符合規(guī)定。

4.2.2生產(chǎn)車間或?qū)嶒?yàn)間

生產(chǎn)車間或?qū)嶒?yàn)間符合相應(yīng)實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌級(jí)別要求。生產(chǎn)設(shè)備和管路應(yīng)經(jīng)過(guò)嚴(yán)格滅菌，滅菌后檢測(cè)合

格方可使用，避免交叉污染。

4.2.3培養(yǎng)基

采用經(jīng)批準(zhǔn)的培養(yǎng)基用于生產(chǎn)，培養(yǎng)基應(yīng)經(jīng)過(guò)高壓蒸汽滅菌。

4.2.4培養(yǎng)

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采用液體培養(yǎng)。將種子液置于特異性條件下培養(yǎng)（包括厭氧或需氧、溫度、時(shí)間等），培養(yǎng)過(guò)程中

取樣涂片做革蘭氏染色鏡檢、pH值檢測(cè)等，芽孢菌需要進(jìn)行芽孢形成率的檢測(cè)，均應(yīng)符合該菌種的規(guī)

定。培養(yǎng)結(jié)束后，取樣做純菌檢查，如發(fā)現(xiàn)污染應(yīng)予廢棄。

4.2.5收獲菌體

液體菌培養(yǎng)結(jié)束后直接分裝收獲。

菌粉培養(yǎng)結(jié)束后采用分離技術(shù)收獲濕菌體，與分散劑、穩(wěn)定劑混合后制成干粉。

4.3微生物飼料添加劑

同一工作種子批菌種生產(chǎn)的最多2批單一菌粉，可按批準(zhǔn)的比例與輔料混合均勻后制成微生物飼料

添加劑，配制過(guò)程應(yīng)防止污染。微生物飼料添加劑濃度為每千克全價(jià)料中不低于106cfu。

4.4混合型微生物飼料添加劑

混合型微生物飼料添加劑包括固態(tài)型、液態(tài)型和半固態(tài)型。

4.4.1菌體組成要求

生產(chǎn)混合型微生物飼料添加劑時(shí)，應(yīng)每種菌分別培養(yǎng)制備單一菌粉。混合型微生物飼料添加劑應(yīng)選

擇附錄A.1中所列菌種，且菌種數(shù)目不宜超過(guò)5種。使用一種以上菌時(shí)，不同菌之間應(yīng)通過(guò)協(xié)同關(guān)系試驗(yàn)。

4.4.2分批

同一批號(hào)，原料應(yīng)來(lái)源一致、質(zhì)量均一，按規(guī)定要求抽樣檢驗(yàn)后，能對(duì)整批產(chǎn)品作出評(píng)定。

5采樣要求

5.1采樣原則

采集的樣品要具有代表性，能反映被采樣本的總體水平，且避免引入外來(lái)污染。

5.2采樣人員

采樣應(yīng)由受過(guò)相應(yīng)培訓(xùn)的人員進(jìn)行，采樣人員應(yīng)具備對(duì)微生物生物危害及防止交叉污染的常識(shí)，采

樣時(shí)應(yīng)采取佩戴口罩、手套等措施保證自身安全及避免外來(lái)污染。

5.3采樣工具

采樣工具和取樣容器要達(dá)到無(wú)菌的要求。

5.4采樣數(shù)量

采樣數(shù)量可結(jié)合檢驗(yàn)需要量，應(yīng)考慮到樣品分布的均一性。

5.5采樣過(guò)程

采樣應(yīng)與樣品存在環(huán)境一致，對(duì)于有完整包裝的樣品，盡可能整件抽取，減少操作過(guò)程，避免污染。

對(duì)于無(wú)完整包裝或需要打開(kāi)包裝抽取的樣品，要求無(wú)菌取樣。應(yīng)對(duì)樣品信息進(jìn)行及時(shí)、準(zhǔn)確的記錄和標(biāo)

記。

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6檢定要求

6.1微生物飼料添加劑檢定

6.1.1感官要求

應(yīng)包括顏色、氣味和有無(wú)霉變。

6.1.2目的菌檢查

取菌粉加人滅菌生理鹽水或其他專屬稀釋液稀釋至1×103cfu/mL，接種在特異性瓊脂平皿上，每個(gè)

菌種的培養(yǎng)特性、染色鏡檢和生化反應(yīng)檢查，應(yīng)符合該菌種特征。

6.1.3活菌數(shù)測(cè)定

測(cè)定每克或每毫升菌粉中含有的活菌數(shù)量。活菌數(shù)測(cè)定方法按照《飼料中嗜酸乳桿菌的微生物檢

驗(yàn)》、《飼料添加劑飼用活性干酵母（釀酒酵母）》、《飼用微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測(cè)》等

方法執(zhí)行，詳見(jiàn)附錄A.2。

6.1.4雜菌檢查

方法和結(jié)果判斷按NY/T1444執(zhí)行，如不符合規(guī)定應(yīng)廢棄。

6.1.5衛(wèi)生指標(biāo)測(cè)定

常規(guī)指標(biāo)方法按表1執(zhí)行。

表1微生物添加劑衛(wèi)生指標(biāo)要求

項(xiàng)目指標(biāo)試驗(yàn)方法

黃曲霉素B1，μg/kg≤10.0GB/T17480

砷（以總砷計(jì)）的允許量，mg/kg≤2.0GB/T13079

鉛（以Pb計(jì)）的允許量，mg/kg≤5.0GB/T13080

汞（以Hg計(jì)）的允許量，mg/kg≤0.1GB/T13081

鎘（以Cd計(jì)）的允許量，mg/kg≤0.5GB/T13082

大腸菌群的允許量，個(gè)/kg≤1.0×105GB4789.3

霉菌總數(shù)的允許量，個(gè)/kg≤2.0×107GB/T13092

沙門(mén)氏菌的允許量不得檢出GB/T13091

致病菌（腸道致病菌及致病性球菌）不得檢出GB4789.3、GB4789.5和GB4789.10

6.2混合型微生物飼料添加劑檢定

6.2.1感官要求

應(yīng)包括顏色、氣味和有無(wú)霉變。

6.2.2目的菌檢查

檢査成品中所含的目的菌是否符合生產(chǎn)用菌種的特性。即按上述“4.1.3”方法進(jìn)行生長(zhǎng)特性、染色鏡

檢和生化反應(yīng)檢查，應(yīng)符合規(guī)定。對(duì)于混合型飼料添加劑，則須逐一檢查單一菌特性。

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6.2.3活菌數(shù)測(cè)定

測(cè)定每克或每毫升產(chǎn)品中的活菌數(shù)，混合型飼料添加劑應(yīng)分別測(cè)定各單一活菌數(shù)。測(cè)定方法按上述

“6.1.3”執(zhí)行。

6.2.4雜菌檢查

方法和結(jié)果判斷按NY/T1444執(zhí)行。

6.2.5衛(wèi)生指標(biāo)測(cè)定

常規(guī)指標(biāo)方法按6.1.5執(zhí)行。

6.2.6凈含量

按JJF1070執(zhí)行。

7標(biāo)簽、規(guī)格和包裝

7.1標(biāo)簽

標(biāo)簽按GB10648執(zhí)行，同時(shí)標(biāo)識(shí)活菌數(shù)的下限、雜菌數(shù)的上限。

7.2包裝

應(yīng)符合GB/T23181的有關(guān)規(guī)定，包裝材料應(yīng)無(wú)毒無(wú)菌，內(nèi)包裝物采用符合衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的材料，對(duì)產(chǎn)品

無(wú)抑制性。

8運(yùn)輸和貯存

8.1運(yùn)輸

產(chǎn)品在運(yùn)輸過(guò)程中應(yīng)避免暴曬、雨淋和受熱，不得與有毒有害物品混裝混運(yùn)。

8.2貯存

產(chǎn)品應(yīng)貯存于陰涼、通風(fēng)、干燥處，防止暴曬、雨淋和受熱，如有特殊要求應(yīng)注明。

9保質(zhì)期

自生產(chǎn)之日起，按批準(zhǔn)的有效期執(zhí)行。

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AA

附錄A

（規(guī)范性附錄）

飼料添加劑微生物品種目錄

表A.1飼料添加劑微生物品種目錄

類別通用名稱適用范圍

地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、兩歧雙歧桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌、乳

酸腸球菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、德式乳桿菌乳酸亞種（原名：乳酸

乳桿菌）、植物乳桿菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、產(chǎn)朊假絲酵母、釀酒

酵母、沼澤紅假單胞菌、嬰兒雙歧桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌、短雙歧桿菌、青春養(yǎng)殖動(dòng)物

雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、羅伊氏乳桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、黑曲霉、米曲霉、

遲緩芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、纖維二糖乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、德氏乳桿

菌保加利亞亞種（原名：保加利亞乳桿菌）

微生物

產(chǎn)丙酸丙酸桿菌、布氏乳桿菌青貯飼料、牛飼料

副干酪乳桿菌青貯飼料

肉雞、生長(zhǎng)育肥豬、水

凝結(jié)芽孢桿菌

產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物、犬和貓

側(cè)孢短芽孢桿菌(原名：側(cè)孢芽孢桿菌)肉雞、肉鴨、豬、蝦

丁酸梭菌

斷奶仔豬、肉仔雞

表A.2生產(chǎn)及質(zhì)量控制中參考標(biāo)準(zhǔn)

標(biāo)準(zhǔn)序號(hào)標(biāo)準(zhǔn)名稱

GB/T20191飼料中嗜酸乳桿菌的微生物檢驗(yàn)

GB/T22547飼料添加劑飼用活性干酵母（釀酒酵母）

GB/T26428飼料微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測(cè)

NY/T1461飼料微生物添加劑地衣芽孢桿菌

檢測(cè)方法

NY/T1969飼料添加劑產(chǎn)朊假絲酵母

NY/T2131飼料添加劑枯草芽孢桿菌

SN/T3542光合細(xì)菌菌劑中沼澤紅假單胞菌計(jì)數(shù)方法

SN/T4624.2入境環(huán)保用微生物菌劑檢測(cè)方法第2部分：短小芽孢桿菌

GB4789.34食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)雙歧桿菌檢驗(yàn)

GB8381.2飼料中志賀氏菌的檢測(cè)方法

GB/T13091飼料中沙門(mén)氏菌的檢測(cè)方法

衛(wèi)生指標(biāo)

GB/T13092飼料中霉菌總數(shù)測(cè)定方法

GB/T13093飼料中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定

GB4789.3食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)

其他GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

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