2022膽囊腫瘤臨床病理學特征研究進展摘要因獨特的流行病學特征、女性傾向、難以早期診斷以及缺乏有效治療手段等特點，膽囊癌備受關注。隨著膽囊癌前病變的診斷標準和專家共識逐漸成熟完善，膽囊癌過度診斷已逐漸被避免，同時一些浸潤性癌也得到了更準確的定義。病理學診斷是確定腫瘤性質和進展程度的關鍵證據，關系到病人的預后及綜合治療方案的評估。準確的病理學診斷對膽囊癌治療至關重要，尤其是規范化的取材。膽囊癌在全球所有惡性腫瘤中占1.2%［1］。基于“中國膽囊癌研究小組”(CRGGC)的一項全國性多中心回顧性隊列研究(No.NCT04140552)中發現，3528例膽囊癌病人的5年總體生存率為23.0%，其中可切除腫瘤病人的5年生存率為39.6%，晚期未手術病人為5.4%，姑息性手術病人為4.7%［2］。膽囊癌在所有膽道腫瘤中最常見，女性比男性更易發病，伴有慢性炎癥的膽囊結石是膽囊癌的危險因素，癥狀與膽絞痛及慢性膽囊炎的臨床表現相似，容易被忽視［3］。根據TNM分期制定最佳的手術方案對提高病人生存率和改善病人預后具有重要指導意義［4］。2021年的一項多中心回顧性研究中發現，全國26家醫院病理學報告中存在“浸潤全層”、“侵及全層”、“達全層”等模糊描述［5］。這些病例在膽囊癌根治性切除的病人中占19.86%，腫瘤是否突破漿膜層的不確定性導致該研究難以明確腫瘤T分期［5］。同時研究中還發現，對于手術切除標本中腫瘤在膽囊中的相對位置、是膽管切緣還是肝臟切緣、區域淋巴結分組和數量，很多報告中也未明確描述［5］。病理學診斷是確定腫瘤性質和進展程度的關鍵證據，關系到病人的預后及綜合治療方案的評估。因此，早期、準確的診斷對于潛在的膽囊癌治療至關重要。本文將重點對膽囊癌前病變和惡性上皮性腫瘤的臨床病理學特征及最新進展進行綜述。1癌前病變癌前病變的診斷具有重要意義，其不僅為理解腫瘤發生提供重要依據，而且為高危人群的篩查并防止腫瘤早期進展提供機會。第5版WHO消化系統腫瘤分類在良性腫瘤和癌前病變中，把膽管上皮內瘤變（biliaryintraepithelialneoplasiaBillN）分高級別和低級別兩類，囊內（膽囊）或導管內（膽管）乳頭狀腫瘤也被分為低級別和高級別兩類，去除了黏液性囊性腫瘤伴低或中級別，以及高級別上皮內瘤變及與其相對應的相關性浸潤性癌，新增了囊內或導管內乳頭狀腫瘤伴浸潤性癌。由于在癌前病變的診斷中存在主觀性，近十年，智利、美國以及韓國等該領域的病理學家在多次國際多學科共識會議中，建立了統一標準［8-9］。以下對常見癌前病變進行介紹。1.1低級別BillNBillN見于膽道系統［10］及膽囊［11］；但大多數病理醫生仍習慣用“異型增生”作為術語。傳統的“平坦型異型增生”，也稱為膽囊的BilIN,是膽囊癌最常見的癌前病變。“低級別異型增生”的定義和特征是模糊的。1.1Roa等［11］對低級別異型增生組織學特征達成共識，即細胞結構輕度異型，主要是平坦型生長模式，典型的細長核，假復層和核深染；細胞核增大且不規則，但仍局限于細胞的基底部分；低級別異型增生的病例通常沒有潰瘍。診斷低級別異型增生，至少4?6個蠟塊，因為它可能伴隨高級別異型增生［11］。1.2高級別BilIN第5版WHO消化系統腫瘤分類中指出該類病變腫瘤細胞局限于上皮細胞，類似高級別異型增生/膽管上皮內瘤變3級（BilIN-3）。這些病變形態結構復雜，侵襲性高，普遍稱為“早期膽囊癌”。該類病變未侵犯肌層（pT2）的病人10年生存率＞90%［9,12］。高級別上皮內瘤變的組織學特征是上皮細胞的極性喪失，核漿比顯著增加，以及呈不規則核。通常，高級別不典型增生/原位癌累及上皮全層。形態上包括平坦型，波狀、微乳頭、高乳頭、管狀或齒狀上皮［11］。因此，息肉和病變的大小是主要的診斷標準（見1.3膽囊內腫瘤部分）［13］。高級別BilIN有多種細胞表型，包括膽道型、腸道型和胃型［14］。大多數病例為膽道型，其特征是大的立方細胞，具有豐富的細胞質，中央或基底核，大核仁，染色質相對較少。腸型發育不良具有與結腸腺瘤相似的特征，如嗜堿性和假復層狀、雪茄狀的細胞核。BilIN-3在切緣陰性的膽囊切除術后可達臨床治愈。如果在膽囊切除術標本中發現BilIN-3病例無浸潤性癌成分，則需要廣泛和完整的取材。1.3膽囊內腫瘤膽囊內腫瘤（intracholecysticneoplasms,ICN）是上皮內腫瘤（腫塊或息肉形成前的侵襲性癌前病變）。本質上，是胰膽道“導管內腫瘤”的膽囊部分。在第5版WHO消化系統腫瘤分類中，被分為“幽門腺腺瘤”和“膽囊囊內乳頭狀腫瘤”［11］。該類病例有以下特點：易發生在老年人，通常60歲左右，女性是男性的2倍。與其他類型的膽囊腫瘤相比，膽囊結石在ICN中較少見。在臨床上約10%被漏診，可能是因為被誤診為膽結石或淤泥［13］。大體形態上，ICN的特征是顆粒狀、疣狀或外生性生長。多是彌漫性的，而有些腫瘤很容易從表面脫落。腫瘤中位大小為2.2cm［13］。鏡下，病變部位與鄰近黏膜結構明顯不同，由乳頭狀、管狀或管狀乳頭狀上皮構成，有時，ICN延伸至R-A竇（Rokitansky-Aschoffsinuses），類似浸潤性癌，鄰近黏膜常表現為平坦型異型增生［13］。根據上皮細胞異型性程度，ICN分為低級別和高級別［15］。低級別ICN僅顯示輕至中度異型。高級別的特點是結構復雜、多形性核和極性的喪失［13］。在超過一半的ICN中發現浸潤性癌，特別是在乳頭狀生長（囊內乳頭狀腫瘤）和高級別異型增生的病變中［13,16-17］，浸潤性癌通常是普通管狀（胰膽型）腺癌，少數為黏液性、腺鱗狀或神經內分泌癌（neuroendocrinecarcinoma,NEC）[18]o非浸潤性ICN病人的5年生存率為78%,浸潤性癌病人5年生存率為60%[13]oICN可能會增加其余膽道發生腫瘤的風險，因此，此類病人手術后需要長期臨床隨訪[19]o2惡性上皮性腫瘤第5版WHO消化系統腫瘤分類較第4版在膽囊惡性上皮性腫瘤分類中改動不大，第5版中腺癌亞型保留非特殊類型、腸型、透明細胞癌、黏液腺癌，新增了低黏附性癌，并把黏液性囊性癌伴浸潤性癌、囊內乳頭狀癌伴浸潤性癌列入腺癌；去除了杯狀細胞類癌和管狀類癌[6-7]（表3、4）。90%以上的膽囊癌是腺癌[11]o大多數膽囊癌腺癌起源于膽囊底（60%），其次是體（30%）和頸（10%）[20]o大體形態腫瘤類型不同形態結構也不同。大多數腺癌表現為潰瘍或菜花型外觀。ICN引起的癌表現為息肉樣/乳頭狀管腔狀，主要鑒別標準是息肉樣或乳頭狀腫塊結構[13]o玻璃樣變性膽囊炎引起的腫瘤通常表現為硬化萎縮，有時在膽囊壁中形成珠狀結節[21]黏液性癌常是凝膠性的[22]o肉瘤樣癌常為息肉樣[23]opT1或pT2病例，取材應為整個膽囊，并體現在病理學報告中[24]因為pT1病人通常是可治愈的[9]，病灶淺表或未穿透漿膜的pT2病人也有相當好的預后，而侵及肝臟面的肌周結締組織，未進入肝臟即pT2b則侵襲性更強[11]o對于pT2b病例，需要多取材來確定是否侵犯肝表面，若已侵入肝臟和或一個鄰近器官或結構，則已達到pT3分期［11］。組織學特征腺癌（非特殊類型）在顯微鏡下，腺癌的特征是惡性腺體彌漫在致密的纖維增生性間質中（圖1）。根據腺體分化程度，將腺癌分為:高分化（1級，>95%的腺體成分），中分化（2級，50%?95%的腺體成分）和低分化（3級，5%?<50%的腺體成分），以及未分化的無腺體結構（4級）。典型的免疫組化（immunohistochemical,IHC）檢查結果為：CK7、MUC1、CEA、CA19-9和CK20表達［25］。突觸素和嗜鉻粒蛋白陽性的神經內分泌細胞在腺癌中很常見，但不同于神經內分泌瘤（neuroendocrinetumor,NET）［25］。研究發現腺癌細胞失去了抗原提呈的MHCII分子，可轉化為鱗癌細胞［26］（圖2）。胰膽管型腺癌大多數膽囊癌屬于這一類型，因為其在顯微鏡下與胰腺和膽管腺癌相似，所以被稱為胰膽管型。胰膽管型腺癌由管狀結構組成，細胞呈立方體或柱狀排列，周圍是豐富的膠原化纖維增生性間質。一些胰膽管型腺癌分化非常好，而另一些表現為大的腺管，有實質性乳頭狀和（或）篩狀結構的病例難以診斷［11］。胞質可能存在黏液和泡沫細胞［27］。2.2.3腸型腺癌腸型是一種腺癌變體，其組織學外觀與結腸腺癌相同，由管腔壞死的腺體、杯狀細胞和結腸型上皮細胞組成。腸型腺癌常表現為管狀結構、高柱狀細胞和細長的假復層核，類似結腸腺癌，但在膽囊中非常罕見［13,22-23,28-29］。有文獻報道大多數具有這種形態的病例往往是從管狀胃腸道轉移而來［11］。2.2.4透明細胞癌透明細胞腺癌(clearcelladenocarcinoma，CCA)是由透明細胞構成，這些細胞含豐富糖原的透明胞漿、細胞核深染和明確的細胞界限。細胞可呈巢狀、實心片狀和小梁狀排列。該類型需要與轉移性腎透明細胞癌(clearcellrenalcellcarcinomQRCC)、透明細胞癌和副神經節瘤進行鑒別診斷［30-31］。與膽囊的CCA不同，CRCC是CK7-/CEA-和Vimentin+/CD10+。膽囊的透明細胞癌是一種異常罕見的腫瘤，主要發生在希佩爾-林道(VonHippelLindau，VHL)綜合征中，其中抑制素蛋白彌漫陽性，神經內分泌標記物呈陽性。而表達于支持細胞的S1蛋白，副神經節瘤的神經內分泌腫瘤細胞陽性［32］。黏液腺癌只有2.5%的膽囊癌符合黏液腺癌(細胞外黏液占腫瘤細胞的50%)［22］(圖3)。黏蛋白中可能存在印戒細胞。黏液癌有獨特的臨床病理學特征：女性少見，臨床表現為“急性”癥狀，多為晚期腫瘤(87%為T3)和侵襲性高［29］。而且，大多數黏液癌是混合型，合并其他亞型的細胞結構，如膽道型腺癌或低黏附性癌。IHC結果表達：CK7(57%)、MUC1(57%)、MUC2(86%)、MUC5AC(86%)、E-cadherin缺失(86%)、CK20(29%)、CDX2(14%)和MUC6(0%)。該亞型不同于膽囊腺癌（MUC2,1%），胰腺膠體瘤（CDX2-/MUC1+）,乳腺膠體瘤（MUC6-），腸道的黏液腺癌（CDX2-/CK20-/CK7+，微衛星穩定）［29］。腺鱗癌在膽囊癌中有5%以上發現了局灶性鱗狀細胞分化［29］。如果鱗狀成分占腫瘤細胞25%以上，則該腫瘤可被歸類為腺鱗癌［29］（圖4）。鱗狀成分小于25%的腫瘤被認為是具有局灶性鱗狀分化的腺癌。任何以鱗癌為主的病變中存在腺體分化都屬于腺鱗癌的范圍。腺鱗狀癌并不常見，占所有膽囊癌的4%［33］。然而，單純性鱗狀細胞癌極為罕見，僅占所有膽囊癌的1%［11］。鱗狀成分常表達p63和高分子量角蛋白，而腺癌成分常產生黏蛋白，表達CEA和B72.3。腺鱗癌或鱗狀細胞癌的總體預后比普通型膽囊癌更差［34］。腫瘤的早期肝臟或鄰近器官侵犯率增加［33,35］。筆者團隊前期研究發現KRTDAP和FAT2可作為膽囊癌中腺鱗癌的診斷性生物標記物［36］。未分化癌未分化癌是一類侵襲性的膽囊癌，在組織學上缺乏明確的分化方向（圖5）。膽囊未分化癌可分為兩類［11］。但都合并腺癌成分：（1）上皮樣。實性（非腺性）上皮樣結構。可能有髓樣、肝樣或橫紋肌樣模式。前兩種情況可能存在錯配修復蛋白的表達缺失，而后者可能存在INI/BAF-47的表達缺失和（或）SMARC基因的突變［11］。（2）肉瘤樣或紡錘體細胞。其中一些上皮樣結構多見，而另一些則由更多的梭形細胞組成。也會出現血管肉瘤樣病變。在胰腺中，大多數肉瘤樣癌顯示破骨細胞樣巨細胞，而在膽囊肉瘤樣癌中出現破骨細胞樣巨細胞是極其罕見的。通常這類病例腫瘤直徑較大或多為晚期［11］。有研究表明，該類腫瘤侵襲性強、死亡率高［23］。低黏附性癌低黏附性“印戒”）癌的特征是黏附性差（單個細胞或索狀浸潤，有或無印戒細胞），腫瘤細胞占50%以上［11］。＜5%的膽囊癌被診斷為低黏附性癌。這類腫瘤在診斷時往往是晚期（PT3+）腫瘤，預后差，較普通膽囊癌更具侵襲性［37］。神經內分泌腫瘤神經內分泌腫瘤（neuroendocrineneoplasms，NEN）是一組異質性的罕見腫瘤，約占所有惡性腫瘤的2%，占所有新診斷惡性腫瘤的0.5%［38-39］。NEN通常起源于神經內分泌細胞，這是一種特殊的細胞，接收神經元的輸入，合成和分泌激素，從而連接機體的神經和內分泌系統。神經內分泌細胞位于身體各個部位，主要在下丘腦和腦垂體，以及胃腸道和呼吸道；因此，NEN可以起源于身體的任何器官［40］。NEN的分類、分級和分期可因原發腫瘤部位、增殖、侵襲和轉移程度而有所不同［40］。膽囊的NEN最新分類是基于WHO，將NEN分為NET和NEC。分化良好的腫瘤被稱為NET，可以是低級別（G1），有絲分裂計數＜2/10個高倍視野（highpowerfield,HPF）和Ki-67指數＜3%；中等級別（G2），有絲分裂活性為2~20/10個HPF，Ki-67指數3%~20%；高級別（G3），Ki-67指數＞20%［40］（圖6）。低分化神經內分泌癌（poorlydifferentiatedneuroendocrinecarcinomaPDNEC)可以進一步分為小細胞、大細胞或混合NEC。神經內分泌和非神經內分泌成分＞30%的腫瘤被稱為混合性神經內分泌-非神經內分泌腫瘤(mixedneuroendocrine-non-neuroendocrineneoplasms，MiNEN)［41］。大細胞神經內分泌癌(largecellneuroendocrinecarcinomas,LCNEC)是NEC的高級別亞群的一部分，是極其罕見和具侵襲性的。組織學上，這些腫瘤與分化良好的NET相似，具有小梁或類器官生長模式，“鹽和胡椒”染色質，和(或)柵欄狀，以及高有絲分裂活性和大面積壞死的特征［42-44］。與小細胞神經內分泌癌(smallcellneuroendocrinecarcinomas，SCNEC)不同，LCNEC中的細胞通常要大2~3倍，具有明顯的核仁和較低的核漿比［45-47］。診斷通常依賴IHC檢測神經內分泌標記物，最常見的是突觸素、嗜鉻粒蛋白A或CD56表達，但也可包括蛋白基因產物9.5、神經元特異性烯醇化酶(NSE)和Leu7表達［45-46］。另外，筆者團隊2021年應用全外顯子組測序(WES)技術檢測了15例膽囊NEC和22例普通膽囊癌的基因突變和體細胞單核苷酸突變(SNV)［48］。研究發現膽囊NEC中顯著突變的基因具有TP53和RB1的驅動作用［48］。3思考與展望膽囊癌治療的突破需要依賴于新藥的開發和基因治療，而這一點必將依賴于對膽囊癌發病機制的認識和分子生物學研究［49］。筆者團隊首次構建膽囊癌微環境單細胞轉錄圖譜，從獲得的114927個細胞中鑒定出16種細胞類型，其中上皮細胞、M2巨噬細胞和調節性T淋巴細胞在ErbB通路突變的腫瘤中占優勢［36］。另外2019年對157對膽囊癌樣本進行全基因外顯子組測序，發現ERBB2/ERBB3基因高頻突變明顯促進膽囊癌細胞的增殖和轉移，并與膽囊癌的預后呈正相關，機制研究顯示ERBB2/ERBB3基因突變可以通過上調程序性死亡配體-1(PD-L1)表達促進膽囊癌免疫逃逸［50］。針對PD-L1免疫檢查點和其他信號分子，已經開展多中心臨床II期試驗(NCT03768375)，旨在評估晚期或復發性膽囊癌病人不同療程的療效［51］。腫瘤微環境和免疫譜在膽囊癌的發生中發揮重要作用，在未來的臨床研究中可結合突變譜進行評估［52］。除ERBB2/ERBB3基因，研究還發現SIRT3在大多數膽囊癌病人中表達降低，與高表達SIRT3的病人相比，這些病人表現出較差的總生存期［53］;YAP1靶點AXL在膽囊癌組織中過表達，YAP1和AXL的高表達與較差的預后有顯著相關性［42］。隨著新技術的應用可更加系統全面地開展膽囊基礎研究，但是也帶來了不確定性，成本比較高，科研門檻提高等［43］，因此，未來相關研究應趨向