基因工程制藥基因工程的基礎知識

第一節基因的概念與特性一、基因的概念:

DNA分子中含有特定遺傳資訊的一段核苷酸序列,是遺傳物質的最小功能單位。早期認為遺傳物質是蛋白質，1944年Avery從肺炎鏈球菌轉化實驗證明是DNA。A：S有夾膜致病菌，B：R突變非致病菌，C：加熱殺死S菌，D：活R死S二、基因的一般特性：①基因可自我複製，②基因決定蛋白質結構，③基因可突變。基因按功能分為：①結構基因②調控基因三、DNA的結構與性能⒈DNA的結構：四種核苷酸（ATCG）連接。DNA二級結構雙螺旋結構。⒉DNA的性質與功能①吸收光譜260②電場中泳動③變性複性雜交第二節DNA的複製與表達一、DNA的複製：半保留複製

二、基因表達⒈轉錄：在RNA聚合酶的催化下以DNA為範本合成mRNA的過程。

轉錄後加工：剪切：除去內含子加帽：5’加m7Gppp

加尾：3’加poly（A）

二、翻譯：以mRNA為範本,tRNA作為運載工具,將活化的氨基酸在核糖體上合成蛋白質的過程。⒈分為三個階段：①起始②延長③止

基因表達真核細胞的翻譯過程⒉翻譯後的肽鏈加工肽鏈切斷①羥基化②糖基化③磷酸化④乙醯化

基因工程制藥第一節概述20世紀70年代基因工程誕生最先應用在醫藥科學領域。

1982年第一個基因工程產品--人胰島素在美國問世。優點:大量生產、應用臨床、深入研究、擴大應用、改造不足。第二節基因工程藥物生產的基本過程

基因工程技術是將重組對象的目的基因插入載體，拼接後轉入新的宿主細胞，構建成工程菌(或細胞），實現遺傳物質的重新組合，並使目的基因在工程菌內進行複製和表達的技術。基因工程基本過程

基因工程藥物制藥的主要程式:⒈目的基因的克隆，⒉構建DAN重組體，⒊DAN重組體轉入宿主菌，⒋構建工程菌，⒌工程菌發酵，⒍表達產物的分離純化，⒎產品的檢驗等。基因工程藥物制藥的主要程式獲得目的基因組建重組質粒構建工程菌（或細胞）培養工程菌產物分離純化除菌過濾半成品檢定成品檢定包裝第三節目的基因的獲得

克隆真核基因常用方法：逆轉錄法和化學合成法。

一、逆轉錄法逆轉錄法就是先分離純化目的基因的mRNA，在反轉錄成cDNA，然後進行cDNA的克隆表達。⒈mRNA的純化⒉cDNA第一鏈的合成⒊cDNA第二鏈的合成⒋cDNA的克隆⒌將重組體導入宿主細胞⒍cDNA文庫的鑒定⒎目的cDNA克隆的分離和鑒定

二、化學合成法較小的蛋白質或多肽的編碼基因可以用化學合成法合成。必須知道目的基因的核苷酸順序或目的蛋白質的氨基酸順序。

用化學法合成目的基因DNA不同部位的兩條鏈的寡核苷酸短片段，再退火成為兩端形成粘性末端的DNA雙鏈片段，然後將這些雙鏈片段按正確的次序進行退火使連接成較長的DNA片段，再用連接酶連接成完整的基因。

人工化學合成基因的限制有：⒈不能合成太長的基因。目前DNA合成儀所合成的寡核苷酸片段僅為50～60bp，因此只適用於克隆小分子肽的基因。

最佳的基因表達體系：目的基因的表達產量高、表達產物穩定、生物活性高和表達產物容易分離純化。一、宿主細胞的選擇

適合目的基因表達的宿主細胞應滿足以下要求:

容易獲得較高濃度的細胞；能利用易得廉價原料；不致病、不產生內毒素；

發熱量低、需氧低、適當的發酵溫度和細胞形態；容易進行代謝調控；容易進行DNA重組技術操作；產物的產量、產率高，產物容易提取純化。

宿主細胞分為兩大類：第一類為原核細胞：常用有大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、鏈黴菌等；第二類為真核細胞：常用有酵母、絲狀真菌、哺乳動物細胞等。⒈原核細胞⑴大腸桿菌因為大腸桿菌的分子遺傳學研究深入，生長迅速，所以目前仍是基因工程研究中採用最多的原核表達體系。

表達基因產物形式多樣:細胞內不溶性表達(包含體)、細胞內可溶性表達、細胞周質表達等。大腸桿菌中的表達不存在信號肽，產品多為胞內產物，提取困難。

因分泌能力不足，真核蛋白質常形成不溶性的包含體，表達產物需經變性複性才恢復活性。蛋白質不能糖基化。產物蛋白質N端多餘一個蛋氨酸殘基。其內毒素很難除去。⑵枯草芽胞桿菌分泌能力強，蛋白質不形成包含體。產物蛋白質不能糖基化。有很強的胞外蛋白酶對產物降解。⑶鏈黴菌作為外源性基因表達受到重視。不致病、使用安全、分泌能力強、表達產物可糖基化。⒉真核細胞⑴酵母酵母菌是研究基因表達最有效的單細胞真核微生物。其基因組小，世代時間短，有單倍體雙倍體兩種形式，繁殖迅速，無毒性。能外分泌，產物可糖基化。已有不少真核基因成功表達⑵絲狀真菌優點：分泌能力強，能正確進行翻譯後加工（肽剪切糖基化）有成熟的發酵和後處理工藝。

⑶哺乳動物細胞優點：表達產物可由重組轉化細胞分泌到培養液中，純化容易。產物是糖基化的接近天然物。缺點：生長慢，生產率低，培養條件苛刻，費用高，培養液濃度稀。

目前使用最廣泛的宿主菌是大腸桿菌和釀酒酵母,已建立了許多適合它們的克隆載體和DNA導入方法。許多外源基因已獲得成功表達。二、大腸桿菌中的基因表達

載體基因工程的目的和基本手段，是選用合適的載體把供體DNA（外源基因）運載到受體細胞內，從而複製擴增大量的目的DNA分子或轉錄表達為相應的產物。

基因工程載體分為：克隆載體轉錄載體表達載體克隆載體轉錄載體

DNADNARNA蛋白質表達載體原核細胞的基因組特點：①染色質為環狀雙股DNA分子②具有操縱子結構③結構基因多為單拷貝④特定區域分佈特異DNA順序因此外源DNA分子可以插入原核細胞DNA複製體系的特定區段基因工程克隆載體的特點：①具有複製子②有單一限制內切酶切位點或多克隆位點③有選擇性遺傳標記如抗藥基因④拷貝數高⑤生物安全性好目前使用的載體按特性可分為：①質粒②λ噬菌體③黏性質粒④M13噬菌體⑤酵母⑥真核細胞病毒載體

細菌質粒的生物學特性質粒的定義：質粒是存在於細菌等微生物細胞染色質以外的共價閉環的雙股DNA分子，具有獨立自主複製和調控能力，可賦予宿主細胞一定的生物性狀。質粒的生物學特性①大小小型質粒1.5～15kb,大型質粒60～120kb②複製類型:嚴緊型質粒,鬆弛型質粒③拷貝數④電泳特點⑤不相容性

質粒的分類:⒈按複製型式①嚴緊型②鬆弛型⒉按基因轉移性①傳遞性質粒②非傳遞性質粒⒊按遺傳性狀產物分類:①抗生素抗性②限制酶修飾酶系統⒈真核基因在原核細胞中表達載體必須具備條件：⑴載體能夠獨立複製。載體本身是一個複製子，具有複製起點。⑵應具有靈活的克隆位點和方便的篩選標記，以利於外源基因的克隆鑒定和篩選。⑶應具有很強的啟動子，能為大腸桿菌RNA聚合酶所識別。⑷應具有阻遏子，使啟動子受到控制，只有當誘導時才能進行轉錄。⑸應具有很強的終止子，只轉錄克隆的基因，所產生的mRNA較為穩定。⑹所產生的mRNA必須具有翻譯的起始信號AUG和SD序列，以便轉錄後順利翻譯。常用表達載體⑴pBV220系統

質粒pBV220的結構pBV220系統國內使用最多的載體,其組成:①來源於pUC8多克隆位點②核糖體rrnB基因終止信號③pBR322第4225～3735位④pUC18第2066～680位⑤λ噬菌體cIts857抑制子基因及PR啟動子⑥pRC23的PL啟動子及SD序列pBV220系統優點：①cIts857抑制子基因PL啟動子同在一個載體上，可以轉化任何菌株，以便選用蛋白酶活性較低的宿主細胞，使表達產物不易降解。②SD序列緊跟多克隆位點，便於插入帶起始ATG的外源基因，可表達非融合蛋白；③強的轉錄終止信號可防止出現“通讀”現象，有利於質粒-宿主系統的穩定；④整個質粒僅為3.66kb，有利於增加其拷貝數及容量，可以插入大片段外源基因；⑤PR和PL啟動子串聯，可以增強啟動作用；

本系統宿主菌可以是大腸桿菌HB101、JM103、C600，質粒拷貝數較多，因此小量簡便快速提取即可滿足需要。本系統為溫度誘導，外源基因表達量可達細胞總蛋白的20%～30%；產物以包含體形式存在不易降解均一性好；

pBG-2是由pBV220系統衍生的便於產物純化的融合表達載體。該質粒在PRPL啟動子下游插入proteinG的IgGFc結合區基因片段180個堿基對，下游是多克隆位點，引入剪切融合蛋白具有與IgG結合的活性，可用親和層析。簡化下游工藝。融合表達質粒pBG-2的結構⒉影響目的基因在大腸桿菌中表達的因素

外源基因表達產量與細胞濃度和細胞表達產量呈正相關。單個細胞產量取決於：

⑴外源基因的拷貝數⑵

外源基因的表達效率①啟動子的強弱②核糖體接合位點的有效性③SD序列和起始密碼ATG的間距④密碼子組成

⑶表達產物的穩定性

⑷細胞代謝負荷

⑸工程菌的培養條件⒊真核基因在大腸桿菌中的表達形式

⑴以融合蛋白的形式表達藥物基因以原核多肽和真核蛋白結合在一起稱融合蛋白。優點：操作簡便，表達蛋白在菌體內穩定，易實現高效表達；缺點：只能作抗原用。⑵以非融合蛋白的形式表達藥物基因非融合蛋白指在大腸桿菌中表達的蛋白質以真核蛋白的mRNA的AUG為起始，在其氨基端不含細菌多肽序列。優點：保持原有蛋白活性；缺點：易被蛋白酶破壞。⑶分泌型表達藥物基因優點：在周質中穩定，有活性，不含蛋氨酸殘基；缺點：產量不高，信號肽不被切割。三、酵母中的基因表達⒈載體

酵母載體可以攜帶外源基因在酵母細胞內保存和複製，並隨酵母分裂傳遞到子代DNA和RNA單位。⑴載體的複製系列可分四類：①Yep類（yeastepisomalplasmid，

酵母附加體質粒）②YRp類（yeastreplicationplasmid，

酵母複製型質粒）③YCp類（yeastcentromericplasmid，

酵母著絲粒質粒）④YIp類（yeastintegrativeplasmid，

酵母整合型質粒）⑵克隆載體⑶表達載體①普通表達載體②精確表達載體α-因數分泌型表達載體

H：HindⅢ位點B:BamHI位點

T:酵母主要蛋白酶加工位點⒉影響目的基因在酵母菌中表達的因素⑴外源基因的拷貝數⑵外源基因的表達效率①啟動子②分泌信號的效率③終止序列的影響⑶外源蛋白的糖基化⑷宿主菌株的影響①菌體生長力強②菌體內源蛋白酶要較弱③菌體性能穩定④分泌能力強四、動物細胞中的基因表達

哺乳動物細胞外源基因表達產物可由重組轉化的細胞分泌到培養液中，使產物易純化。基因產物糖基化接近天然產物。

細胞生長慢，生產率低，條件刻苛，費用高，培養液濃度較小。表達的外源細胞均為傳代細胞表達產物是否致癌尚有疑問。分裂不穩定：指工程菌分裂時出現一定比例不含質粒子代菌的現象。結構不穩定：指外源基因從質粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變一、質粒不穩定產生的原因常見分裂不穩定的兩個因素：⑴含質粒菌產生不含質粒子代菌的頻率；⑵這兩種菌比數率差異的大小。

對同一工程菌控制不同的比生長數率可改變質粒的拷貝數：低拷貝質粒工程菌產生不含質粒子代菌頻率高如增加工程菌質粒拷貝數可提高穩定性；高拷貝質粒工程菌產生不含質粒子代菌頻率低但對穩定性不利。

菌體生長數率對質粒拷貝數和質粒穩定性有一影響。高生長數率時質粒拷貝數下降，但穩定性增加。生長數率/h0.20.4質粒拷貝數10.5×10950400β-半乳糖苷酶工程菌的連續養3質粒穩定性的分析方法樣品不含抗性標記抗生素

平板培養基10-12h100個菌落含抗性標記抗生素平板培養基

10-12h統計生長菌落數重複三次,計算比值

(穩定性stability)二、提高質粒穩定性的方法

為了提高質粒穩定性，工程菌培養採用兩階段培養法：⑴先使菌體生長至一定密度；⑵再誘導外源基因的表達

由於第一階段外源基因未表達，減小了重組菌與質粒丟失菌的生長速率的差別，增加了質粒穩定性。在培養基中加入抗菌素抑制質粒丟失菌的生長，提高質粒穩定性。調控環境參數如溫度、pH、培養基組分和溶解氧濃度

有些含質粒菌對發酵環境的改變比不含質粒菌反應慢，間歇改變培養條件以改變兩種菌比生長速率，可改善質粒穩定性。通過間歇供氧和改變稀釋數率，都可以提高質粒穩定性。第六節基因工程菌生長代謝的特點

菌體的生長通常用比生長速率來表示。工程菌培養可通過選用不同的碳源控制補料和稀釋速率等方法來控制菌體的生長。控制菌體的生長對提高質粒的穩定性、減少代謝副產物積累、提高外源蛋白產率有重要意義。

大腸桿菌的蛋白/菌體量的比值是基本恒定的，因而菌體的生長速度反映了蛋白質的合成速度。培養條件的改變，都會改變菌體的能量代謝和小分子前體的供應，影響生物大分子的和成和菌體的生長。一、菌體的生長與能量的關係

碳源物質是組成培養基的主要成分。碳源物質為細胞提供能量，當菌體生長所需能量大於菌體有氧代謝提供的能量時，菌體會產生乙酸，導致培養基的pH值下降，從而影響菌體的生長。適當提高pH，可減少乙酸的抑制作用

分批培養中選擇不同的碳源，連續培養中控制稀釋速率等都能一定範圍內控制菌體的生長，從而控制乙酸的產生，減少它的抑制作用。加入蛋氨酸和酵母提取物都能減少乙酸的產生。

大腸桿菌中克隆攜帶氧能力的VHB蛋白的基因可提高菌體生長速率。採用磷酸乙醯化酶缺陷株作為宿組主細胞，阻止乙酸產生，可提高產量。二、菌體生長與前體供應的關係

在基礎培養基中加入氨基酸（小分子前體）能使菌體比生長率提高，蛋白合成增加。基因工程菌質粒的表達需與宿主細胞競爭共同的前體和催化結構，致工程菌生長速率降低。

質粒存在對菌體代謝的影響：中等拷貝質粒（56拷貝）的工程菌中與前體合成有關的酶增加，這些酶的基因大多受終產物的回饋調節。高拷貝質粒的工程菌（240拷貝）中，生長速率和菌體總蛋白合成均減少。這與工程菌大量前體被利用引起前體不足，從而產生“嚴緊反應”有關。

“嚴緊反應”是當氨醯tRNA不足時,核糖體在密碼子上停留,並合成被稱為魔點的ppGpp的結果。

ppGpp是一個重要的調控分子。它通過影響RNA鏈的延深過程減少轉錄。

它的濃度增加會導致在合成mRNA和rRNA時RNA聚合酶在範本上的移動產生停頓，RNA鏈延長速度減慢，使游離的RNA聚合酶濃度降低，嚴緊控制的啟動子如rrnA等的轉錄減少。也可能ppGpp是通過干擾RNA聚合酶與PL啟動子專一識別反應。第七節基因工程菌發酵

基因工程菌的培養過程包括:⑴通過搖瓶操作基因工程菌生長的基礎條件,如溫度、pH、培養基各種組分、碳氧比，分析表達產物的合成、積累對受體細胞的影響;⑵通過培養罐操作確定培養參數和控制方案以及順序。菌種一級種子搖瓶二級種子罐培養擴大培養

原料發酵培養滅菌發酵生產代謝產物分離基配製

微生物工業發酵過程簡圖一、基因工程菌的培養方式基因工程菌的培養方式：補料分批培養、連續培養、透析培養、固定化培養。⒈補料分批培養補料分批培養是將種子接入發酵反應器中進行培養,經過一段時間後間歇或連續地補加新鮮培養基，使菌體進一步生長的方法。二、基因工程菌的發酵工藝

基因工程菌的發酵與傳統的微生物發酵不同,基因工程菌帶外源基因,發酵的目的是使外源基因高效表達。它不僅涉及宿主載體和克隆基因之間的相互關係還和環境有關。

工藝要求：外源基因既高效表達，又有利於產品分離純化。對發酵影響較大的幾個因素有：⒈培養基的影響⒉接種量的影響⒊溫度的影響⒋溶解氧的影響⒌誘導時機的影響⒍pH的影響

⒈培養基的影響培養基的組成既要提高工程菌的生長速率，又要保持工程菌的穩定性，使外源基因高效表達。常用的碳源有：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。常用的氮源有：酵母提取液、蛋白腖、酪蛋白水解物、玉米漿、氨水、硫酸銨、氯化銨等。還有無機鹽、維生素等。

不同的碳源對菌體的生長和外源基因表達有較大的影響。使用葡萄糖和甘油對菌體比生長速率及呼吸強度相差不大。但使用甘油菌體得率較大，而使用葡萄糖菌體產生的副產品較多。葡萄糖對lac啟動子有阻遏作用。乳糖對lac啟動子有利。

在氮源中，酪蛋白水解物有利於產物的合成與分泌。色氨酸對trp啟動子控制的基因有影響。無機磷在許多代謝反應中是一個效應因數，磷濃度不同，影響菌體生長。⒉接種量的影響接種量是指移入的種子液體積和培養液體積的比例。接種量的大小影響發酵的產量和發酵週期。接種量小，菌體延遲期較長，使菌齡老化，不利於外源基因表達。

接種量大，可縮短生長延遲期，菌體迅速繁衍，很快進入對數生長期，適於表達外源基因。接種量過高，使菌體生長過快，代謝物積累過多，反而會抑制後期菌體的生長。⒊溫度的影響

溫毒對基因表達的調控作用發生在複製轉錄翻譯和小分子調節分子的合成等水準上。溫度對發酵過程的影響是多方面的。它影響各種酶的反應速度，改變菌體代謝產物的反應方向，影響代謝調控機制。

適宜的發酵溫度是既適合菌體的生長，又適合代謝產物合成的溫度。高溫或低溫都會使發酵異常，影響終產物的形成並導致減產。溫度還影響蛋白質的活性和包含體的形成。⒋溶解氧的影響

對於好氧發酵,溶解氧濃度是重要的參數。好氧微生物利用溶解於培養液中的氧氣進行呼吸。若能提高溶氧速度和氧的利用率，則能提高發酵產率。

發酵時，隨DO2濃度的下降，細胞生長減慢，ST值下降，發酵後期下降幅度更大。外源基因的高效表達需要大量的能量，促進細胞的呼吸作用，提高對氧的需求。維持較高的DO2值，才能提高工程菌的生長，利於外源蛋白產物的形成。

採用調節攪拌轉速的方法,

可改變培養過程中的氧供給，提高活菌產量。⒌誘導時機的影響

對於λPL啟動子型的工程菌，使用cI阻遏蛋白的溫度敏感型突變株（clts857），在28～300C下培養時，該突變體能合成有活性的阻遏蛋白阻遏PL啟動子的轉錄；當溫度升高420C時，該阻遏蛋白失活，使啟動子啟動轉錄，提高目的基因的表達效率。一般在對數生長期或對數生長後期升溫誘導表達。

在對數生長期，細胞快速繁殖，直到細胞密度達到109/個為止，這時菌體數目倍增，對營養和氧需求量急增，營養和氧成了菌群旺盛代謝的限制因素。⒍pH的影響pH對細胞的正常生長和外源蛋白的高效表達都有影響，所以應根據工程菌的生長和代謝情況，對pH進行適當的調節。

如採取兩段培養工藝，培養前期重點是優化工程菌的生長條件，其最佳pH在6.8～7.4左右;培養後期重點是優化外源蛋白的表達條件,其最佳pH為6.0～6.5。

總之,最佳化的工藝是獲得:

最快週期、最高產量、最好質量、最低消耗、最大安全性、最周全的廢物處理效果、最佳速度和最低失敗率等。三、基因工程菌的培養設備

應用發酵罐大規模培養基因工程菌。它不同於微生物發酵，微生物發酵目的是為了獲得初級或次級代謝產物，細胞生長並非主要目標，而基因工程發酵是為了獲得最大量的基因表達產物。

發酵罐的組成有：發酵罐體、保證高傳質作用的攪拌器、精細的溫度控制和滅菌系統、空氣無菌過濾裝置、殘留氣體處理裝置、參數測量與控制系統、培養液配製和連續操作系統。

對發酵罐要求：提供菌體生長最適生長條件，培養過程不得污染，保證純菌培養，培養及消毒過程不得游離異物，不能干擾細菌代謝活動等。②含有大量細胞及代謝產物；③表達產物穩定性差，易失活變性；④表達產物的種類繁多、結構不一、活性各異；⑤對其品質要求純度高、無菌、無熱原。一、建立分離純化工藝的根據⒈含目的產物的起始料的特點基因工程菌的發酵產物其上游過程的各種因素對分離、純化工藝有影響。包括：①菌種的類型及其代謝特性。②原材料培養基的來源及其品質。③生產工藝及條件。⒉物料中雜質的種類和性質。⒊目的產物特性。⒋產品品質的要求二、分離純化的基本過程

發酵液細胞分離胞內產物胞外產物細胞破碎固液分離濃縮初步分離高度純化製劑產品包含體細胞碎片分離變性複性三、分離純化的技術分離純化的技術要求：①技術條件溫和能保持產物生物活性。②選擇性好，能從複雜的混合物中有效的將目的產物分離，達到較高的純化倍數。

③收率要高。④兩個技數間能直接銜接，不需要對物料加以處理。⑤純化過程要快，滿足高生產率的要求。⒈細胞破碎與固液分離

⑴細胞收集：離心法、膜分離法。⑵細胞破碎：機械破碎法、非機械破碎法。⑶固液分離⒉目的產物的分離純化

目的產物含有大量雜質必須進行分離純化。蛋白質分離純化方法的設計根據其分子的理化性質和生物學特性來決定。

產物特性作用

等電點決定離子交換種類及條件相對分子量選擇不同孔徑的介質疏水性與疏水、反相介質結合的程度生物特異性決定親和配基溶解性決定分離體系及蛋白濃度穩定性決定工藝採用溫度及流程時間⒉目的產物的分離純化

目的產物含有大量雜質必須進行分離純化。蛋白質分離純化方法的設計根據其分子的理化性質和生物學特性來決定。

產物特性作用等電點決定離子交換種類及條件相對分子量選擇不同孔徑的介質疏水性與疏水、反相介質結合的程度生物特異性決定親和配基溶解性決定分離體系及蛋白濃度穩定性決定工藝採用溫度及流程時間

產物的特性在分離純化中的作用分離純化的方法依賴色譜分離方法

⑴離子交換層析（ionexchangechromatographyIEC）離子交換層析的基本原理是通過帶電的溶質分子與離子交換劑中可交換的離子進行交換，從而達到分離的目的。它具有解析度高容量大操作容易，該法已成為多肽蛋白質核酸分離純化的重要方法。

⑵反相色譜（reversedphasechromatography，RPC）和

疏水色譜（hydrophobicinteractionchromatography，HIC）

反相色譜和疏水色譜是根據蛋白質疏水性的差異來分離純化的。反相色譜是利用溶質分子中非極性基團與非極性固定相之間相互作用力的大小以及溶質分子中極性基團與流動相中極性分子之間在相反方向作用力的大小差異進行分離的。

常用固定相為矽膠烷基鍵合相。流動相為低離子強度的酸性水溶液，加入能與水互溶的乙腈、甲醇、異丙醇等有機溶劑。由於固定相骨架疏水性強，吸附的蛋白質需用有機溶劑才能洗脫下來。

疏水色譜的原理與反相色譜的原理相似，主要是利用蛋白質分子表面上的疏水區域和介質中的疏水基團之間的相互作用，無機鹽的存在能使相互作用力增強。固定相介質表面的疏水性比反相色譜介質表面的疏水性弱。為有機聚合物鍵合相或大孔矽膠鍵合相。流動相為pH6～8鹽水溶液。

在高鹽濃度時，蛋白質分子中疏水性部分與介子的疏水基團產生疏水性作用而被吸附；鹽濃度降低時蛋白質疏水性作用減弱，目的蛋白質被逐步洗脫下來，蛋白質疏水性越強，洗脫時間越長。與反相色譜相比，疏水色譜回收率較高，蛋白質變性可能性小。⑶親和層析（affinitychromatography，AC）

親和層析是利用固定化配基與目的蛋白質之間特異的生物親和力進行吸附，如抗體與抗原、受體與激素、酶與底物之間的作用。

配基：在親和層析中起可逆性結合的特異性物質。載體：與配基結合的支撐物。

親和層析大體可分三步：①配基固定化②吸附目的物③樣品解吸⑷凝膠過濾

凝膠過濾是以具有大小一定的多孔性凝膠作為分離介質，小分子能進入孔內，在柱中緩慢移動，而大分子不能進入孔內，快速移動，利用這種移動差別可使大分子與小分子分開。

根據蛋白質的相對分子量和蛋白質分子的動力學體積的大小差異，可以利用凝膠過濾來分離純化目的蛋白。主要應用兩個方面：①脫鹽和更換緩衝液②蛋白質分子的分級分離。在產品的形成階段前用於除去產物的多聚體及降解產物。⒊非蛋白質雜質的去除DNA、熱原質和病毒的純化方法：⑴DNA的去除DNA在pH4.0以上呈陰離子，蛋白質的pI在6.0以上,可用陰離子交換劑吸附除去。如蛋白質為強酸性，可選擇條件使其吸附在陽離子交換劑上，而DNA不吸附。親和層析和疏水層析也有效。⑵熱原質的去除熱原質是腸桿菌科產生的細菌內毒素（脂多糖）去除困難。分子量小的多肽或蛋白質中的熱原可用超濾或反滲透，脂多糖是陰離子可用陰離子交換層析除去，脂多糖是疏水性可用疏水層析法。⑶病毒的去除層析或過濾可將病毒去除。⒊非蛋白質雜質的去除DNA、熱原質和病毒的純化方法：⑴DNA的去除DNA在pH4.0以上呈陰離子，蛋白質的pI在6.0以上,可用陰離子交換劑吸附除去。如蛋白質為強酸性，可選擇條件使其吸附在陽離子交換劑上，而DNA不吸附。親和層析和疏水層析也有效。⑵熱原質的去除熱原質是腸桿菌科產生的細菌內毒素（脂多糖）去除困難。分子量小的多肽或蛋白質中的熱原可用超濾或反滲透，脂多糖是陰離子可用陰離子交換層析除去，脂多糖是疏水性可用疏水層析法。⑶病毒的去除層析或過濾可將病毒去除。四、選擇分離純化方法

的依據

⒈根據產物表達形式來選擇分泌型表達產物的發酵液體積很大但濃度較低純化前必須濃縮可用沉澱和超濾法。

產物在周質表達是介於細胞內可溶性表達和分泌表達的一種形式,它可以避開可溶性表達蛋白和培養基中蛋白類雜質,在一定程度上有利於分離純化.為了獲得周質蛋白經低濃度溶菌酶處理後,可採用滲透壓休克的方法來獲得。

可溶性表達產物破菌後的細胞上清，首選親和分離方法，或離子交換層析。⒉根據分離單元之間的銜接選擇

應選擇不同機制的分離單元組成一套分離工藝，儘早採用高效的分離手段。先將最多的雜質去除，將費用最高、最費時的分離單元放在最後階段，即通常先運用非特異、低分辨的操作單元（如沉澱超濾和吸附等），以儘快縮小樣品體積，提高產物濃度，去除最主要雜質（包括非蛋白類雜質）。

隨後採用高解析度的操作單元（離子交換層析和親和層析）凝膠過濾放在最後，這樣可以提高分離效果。層析分離次序的選擇同樣重要，合理的組合能提高分辨效率，並有利於各步驟間的過渡。如離子交換層析、親和層析、凝膠過濾。⒊根據分離純化工藝的要求

來選擇

分離純化工藝應遵循以下原則：⑴具有良好的穩定性和重複性⑵盡可能減少組成工藝的步驟⑶各技術步驟間要相互適應和協調第一節概述細胞學說的建立組織培養和細胞培養細胞工程學第二節動物細胞的形態

和生理特點

一、動物細胞的形態適應功能,形態各異。離體培養細胞分兩類：貼壁細胞懸浮細胞⒈貼壁細胞

生長須有貼附的支持物表面，自身分泌或培養基中提供的貼附因數才能在該表面上生長。兩種形態：成纖維細胞型上皮細胞型⒉懸浮細胞生長不依賴支持物表面，在培養液中呈懸浮狀態生長。如淋巴細胞。⒊兼性貼壁細胞生長不嚴格依賴支持物。如中國地鼠卵巢細胞，小鼠L929細胞。二、動物細胞的生理特點⒈細胞的分裂週期長細胞分裂時間為12～48h，細胞的分裂週期=間期+分裂期間期（G1+S+G2）分裂期（M）G1期：4～6h合成DNA聚合酶

RNA合成S期：6～8hDNA合成G2期：2～5hDNA量加倍,RNA合成M期：0.5～1h染色體分裂細胞代數為細胞分裂次數傳代數表示細胞培養分種傳代次數細胞代數=傳代數×分種數/2X=(logN-logNo)÷log2X代數

N培養最終細胞數

No培養起始細胞數倍增時間=培養經過時間÷代數⒉細胞生長需貼附於基質,並有接觸抑制現象。⒊正常二倍體細胞的生長壽命是有限的。原代培養有限細胞系無限細胞系⒋動物細胞對周圍環境十分敏感;

對理化因素敏感，如：滲透壓、pH、離子濃度、剪切力、微量元素等。⒌動物細胞對培養基要求高必需氨基酸、維生素、無機鹽、微量元素、葡萄糖、細胞生長因數、貼壁因數等。

⒍動物細胞蛋白質的合成途徑和修飾功能與細菌不同。動物細胞蛋白質的合成部位：游離核糖體粗面內質網的核糖體

游離核糖體合成蛋白質用於細胞質基質內。

粗面內質網的核糖體合成蛋白質是分泌的和膜中的整合蛋白多為糖蛋白。動物細胞生產藥物缺點:培養條件高、成本貴、產量低。優點:分泌胞外、純化方便、翻譯後修飾糖基化，與天然產品一致。第三節生產用動物細胞的

要求和獲得

一、生產用動物細胞的要求原代細胞二倍體細胞系轉化細胞系二、生產用動物細胞的獲得⒈原代細胞是直接取自動物組織器官,經過粉碎消化而獲得的細胞懸液（109/g）。需要大量動物，費錢費勞力。雞胚細胞、原代兔腎細胞、鼠腎細胞、淋巴細胞。⒉二倍體細胞系原代細胞經過傳代篩選克隆，從多種細胞成分的組織中，挑選並純化出某種具有一定特徵的細胞株。二倍體細胞有正常細胞的特點：①染色體組型是2n核型；②貼壁依賴接觸抑制；③可傳代培養50代；④無致瘤性。二倍體細胞⒊轉化細胞系通過某個轉化過程形成的，常由於染色體斷裂變成異倍體，失去正常細胞特點，而獲得無限增殖能力。轉化過程可以是自發的，和人工的，從腫瘤組織中。三、常用生產用動物細胞

的特性W1-38：正常胚肺組織人二倍體細胞系。核型為2n=46。成纖維細胞，能產生膠原，培養基用BME（Eagle’Basalmedium）。10%小牛血清，pH7.2,同工酶為G6PDB型。倍增時間為24h，有限壽命50代。安全，用於製備疫苗。

MRC-5：從正常男性肺組織中獲得的人二倍體細胞系。核型為2n=46。屬成纖維細胞。培養基用加小牛血清。同工酶G6PDB型。

有限壽命42～46代。增殖速度較W1-38快，對不良環境敏感性較W1-38低。對人的病毒敏感。用於生產疫苗。

CHO-K1：從中國地鼠卵巢中分離的上皮樣細胞。核型：2n=20～22。培養基：DEME培養基

0.1mmol/L次黃嘌呤，0.1mmol/L胸苷，

10%小牛血清，加入脯氨酸。BHK-21:從5只無性別的生長1天的地鼠幼鼠腎臟中分離的;成纖維樣細胞,核型為2n=44;培養基為DMEM加7%胎牛血清。用於增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等並製作疫苗，現已用於工程細胞構建。用於增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等並制作疫苗，現已用於工程細胞構建。Vero：從正常成年非洲綠猴腎臟分離的。為貼壁依賴的成纖維細胞，核型2n=60；

培養基為199培養基，加5%胎牛血清；用於增殖病毒，包括多瘤病毒、脊髓灰質炎、狂犬病毒。Namalwa：從肯雅患有淋巴瘤病人獲取，建成的人的類淋巴母細胞。2.8%的高倍體率，12～14條標記染色體。單條X，無Y。培養基為RPMI1640，添加7%胎牛血清。用於生產

α干擾素。

SP2/0-Ag14：通過融合的方法，從有羊抗紅細胞活性的BALB/c

小鼠的脾細胞和骨髓瘤細胞系P3X63Ag8融合雜交瘤SP2/NL-Ag

亞克隆中分離獲得，

能耐受8氮鳥嘌呤20μg/ml但在含HAT選擇培養基中不能存活。通常用培養基為DMEM，添加10%胎牛血清。用於生產單抗雜交瘤細胞和抗體。

Sf-91983年從親代IPLB—SF21AE

中克隆形成。親代細胞從秋粘蟲的蛹卵組織中分離獲得。它對苜宿尺蠖核型多角體病毒和其他桿狀病毒高度敏感。通常用的培養基為Grace培養基，添加3.3g/L水解乳蛋白和3.3g/L酵母浸液,10%胎牛血清。用於高效表達外來蛋白製品。四、基因工程細胞構建和

篩選

在生產中採用更多的更有前景的是融合細胞及採用基因工程構建的各種工程細胞。

被用構建工程細胞的動物細胞有：

CHO-dhfr、BHK-21、Namalwa、Vero、SP2/0、Sf-9等細胞。⒈真核細胞基因表達載體的構建使用的載體有兩類：㈠病毒載體牛痘病毒、腺病毒、逆轉錄病毒、桿狀病毒㈡質粒載體

牛痘病毒：用構建多價疫苗腺病毒、逆轉錄病毒：用於基因治療。桿狀病毒：用於外源基因表達。

其作為載體的優點：①雙鏈DNA，易重組②插入7～8kbDNA不影響正常病毒粒子的形成。③多角體蛋白和病毒粒子的形成無直接關係，因此用外源基因更換多角體蛋白基因，仍能形成有感染力病毒粒子；

④多角體蛋白基因有非常強的啟動子，產生的蛋白質可占全部蛋白質的20%～30%；⑤用光學顯微鏡可看到多角體，可以此作為標記物，選陽性克隆。⑥如用家蠶桿狀病毒，還可在蠶體表達外源基因。

質粒載體在細菌和哺乳動物細胞體內都能擴增。都含有如下基本成分：①允許載體在細菌體內擴增的質粒序列。②含有使基因表達的調控元件。

③能用以篩選出外源基因已整合的選擇標記。④有時還帶有選擇性增加拷貝數的擴增系統。⒉基因載體的導入和高效表達工程細胞株的篩選

基因載體導動物細胞常用方法是：磷酸鈣沉澱法電穿孔法

磷酸鈣沉澱法：溶解的DNA加Na2HPO4和CaCl2形成磷酸鈣沉澱，DNA被包在磷酸鈣沉澱中，形成DNA—磷酸鈣共沉澱物，當和細胞表面接觸時，則通過細胞吞噬作用而將DNA導入。

電穿孔法：

借助電穿孔儀的高壓脈衝電場，使細胞膜出現暫態可逆性小孔，外源DNA沿小孔進入細胞。轉化率較高，拷貝數低。

五、細胞庫的建立生產用的工程細胞必須建立兩個細胞庫：⒈原始細胞庫⒉生產用細胞庫⒈原始細胞庫貯存時須有該細胞的詳細擋案，包括：

①該細胞系的歷史②該細胞系的特性③對各種有害因數的檢查結果⒉生產用細胞庫從原始細胞庫來的，或從單一安瓶來，或從多個安瓶來即刻混合，經培養擴增再分裝儲存形成細胞庫。

宿主細胞中表達的外源基因，在轉錄翻譯精製工藝放大過程中都可能發生變化，故從原料以及製備全過程都必須嚴格控制條件和鑒定品質。一、原材料的品質控制

原材料的品質控制是確保編碼藥品的DNA序列的正確性，重組微生物來自單一克隆，所用質粒純而穩定，以保證產品品質的安全性和一致性。

根據品質控制要求應瞭解以下特性：⒈明確目的基因的來源、克隆經過，並以限制性內切酶酶切圖譜和核苷酸序列予以確證；⒉應提供表達載體的名稱、結構、遺傳特性及各組成部分（如複製子、啟動子）的來源與功能，構建中所用位點的酶切圖譜，抗生素抗性標記物；⒊應提供宿主細胞的名稱、來源、傳代歷史、檢定結果及其生物學特性；⒋須闡明載體引入宿主細胞的方法及載體在宿主細胞與載體結合後的遺傳穩定性；⒌提供插入基因與表達載體兩側端控制區內的核苷酸序列，詳細敘述在生產過程中啟動與控制基因在宿主細胞中表達的方法及水準等。二、培養過程的品質控制

在工程菌的貯存中，要求種子克隆純而穩定；在培養過程中，要求工程菌所含的質粒穩定，始終無突變；在重複生產發酵中，工程菌表達穩定；始終能排除外源微生物污染。

生產基因工程產品應有種子批系統，並證明種子批不含有致癌因數，無細菌、病毒、真菌和支原體等污染，並由原始種子批建立生產用工作細胞庫。

原始種子批須確證克隆基因DNA序列，詳細敘述種子批來源、方式、保存及預計使用期，保存與復蘇時宿主載體表達系統的穩定性。

對生產種子，應詳細敘述細胞生長與產品生成的方法和材料，並控制微生物污染；提供培養生產濃度與產量恒定性數據，依據宿主細胞-載體系統穩定性，確定最高允許傳種代數；

在培養過程中，應測定被表達基因分子的完整性及宿主細胞長期培養後的基因型特徵；依宿主細胞-載體穩定性與產品恒定性，規定持續培養時間，並定期評價細胞系統和產品。

培養週期結束時，應監測宿主細胞-載體系統的特性，如質粒拷貝數、宿主細胞中表達載體存留程度，含插入基因載體的酶切圖譜等。

三、純化工藝過程的品質控制

產品要有足夠的生理和生物學試驗數據，確證提純物分子批間保持一致性；外源蛋白質、DNA與熱源質控制在規定限度以下。

在精製過程中能清除宿主細胞蛋白質、核酸、糖類、病毒、培養基成分及精製工序本身引入的化學物質，並有檢測方法。四、目標產品的品質控制

基因工程藥物的品質控制主要包括以下幾項要求:產品的鑒別、純度、活性、安全性、穩定性和一致性。它需要利用生物化學、免疫學、微生物學、細胞生物學和分子生物學等多學科的理論與技術所建立的鑒定方法。⒈產品的鑒別常用的鑒定方法:

電泳方法:SDS、等電聚焦、免疫電泳免疫學方法:放射免疫(RIA)、酶聯免疫(ELISA)

受體結合試驗高效液相色譜(HPLC)、肽圖分析法、末端序列分析、圓二色譜、核磁共振⑴肽圖分析

肽圖分析是用酶法或化學法降解目的蛋白質,對生成的肽段進行分離分析。它是檢測蛋白質一級結構最有效的方法，該技術靈敏高效是對基因工程藥物的分子結構和遺傳穩定性進行評價和驗證的首選方法。常用HPLC、毛細管電泳。⑵氨基酸成分分析

50個氨基酸較理想⑶部分氨基酸序列分析

N端15個氨基酸可作為重組蛋白質和多肽的重要鑒定指標。

⑷重組蛋白質濃度測定和相對分子量的測定蛋白質濃度測定方法有:福林-酚法、雙縮脲法蛋白相對分子量的測定:凝膠過濾法、SD-SPAGE法⑸蛋白質二硫鍵分析測定方法有:

對氯汞苯甲酸法等

5，5’-二硫基雙-2-硝基苯甲酸法⒉純度分析⑴蛋白質含量測定

SDS、等電聚焦、各種HPLC、毛細管電泳⑵雜質①蛋白類雜質殘留宿主細胞蛋白採用免疫分析的方法②非蛋白類雜質②非蛋白類雜質非蛋白類雜質主要有:病毒、細菌等微生物、熱原、內毒素、致敏源及DNA。常用檢測方法：雜質和污染物檢測方法內毒素鱟試劑、家兔熱原法宿主細胞蛋白免疫分析、SDS、CE其他蛋白雜質免疫分析、SDS、HPLC、CE殘餘DNADNA雜交、紫外光譜、蛋白結合蛋白變異肽譜、HPLC、IEF、CE甲醯蛋氨酸肽譜、HPLC、IEF、CE蛋氨酸氧化肽譜、HPLC、質譜、氨基酸分析產物變性或聚和脫氨基SDS、IEF、HPLC、CE、質譜、凝膠過濾雜質和污染物檢測方法單克隆抗體SDS、免疫分析氨基酸取代氨基酸分析、肽譜、質譜、CE微生物微生物學檢查支原體微生物學檢查病毒微生物學檢查⒊生物學活性測定需通過動物體內試驗和通過細胞培養進行體外效價測定。⒋穩定性考查是藥品有效性安全性的重要指標，是藥品貯藏條件和使用期限的主要依據。⒌產品一致性的保證五、產品的保存⒈液態保存⑴低溫保存⑵在穩定的下保存⑶高濃度保存⑷加保護劑保存⒉固態保存第十節基因工程藥物製造實例

干擾素（interferon，IFN）是人體細胞分泌的一種活性蛋白質，具有廣泛的抗病毒抗腫瘤和免疫調節活性，是人體防禦系統的重要組成部分。根據分子結構和抗原性的差異分為α、β、γ、ω等4個類型。α型干擾素在分為α1bα2aα2b等亞型。一、基因工程菌的組建

誘生的白細胞提取全RNA通過寡dT-纖維素柱蔗糖密度梯度獲得寡A的mRNA離心提取12s

的mRNA

逆轉錄成cDNA雙鏈cDNA接上dT或dG尾

pBR322質粒pBR322質粒加上dA或dC第十節基因工程藥物製造

實例

干擾素（interferon，IFN）是人體細胞分泌的一種活性蛋白質，具有廣泛的抗病毒抗腫瘤和免疫調節活性，是人體防禦系統的重要組成部分。根據分子結構和抗原性的差異分為α、β、γ、ω等4個類型。α型干擾素在分為α1bα2aα2b等亞型。一、基因工程菌的組建誘生的白細胞提取全RNA通過寡dT-纖維素柱蔗糖密度梯度獲得寡A的mRNA離心提取12s

的mRNA

逆轉錄成cDNA雙鏈cDNA接上dT或dG尾

pBR322質粒pBR322質粒加上dA或dC

退火獲的雜交質粒轉化大腸桿菌擴增雜交質粒篩選抗青黴素但對氨芐用雜交翻譯法挑選青黴素敏感細菌克隆含干擾素cDNA克隆將干擾素cDNA克隆入表達載體在大腸桿菌中進行高效表達二、基因工程干擾素的製備啟開種子製備種子液發酵培養粗提精提半成品製備半成品檢定分裝凍幹成品檢定成品包裝α2b干擾素生產過程1.發酵工程菌：SW-IFNα-2b/E.coliDH5α，質粒用啟動子，含氨芐青黴素抗性基因。培養基含1%蛋白凍0.5%酵母提取物0.5%NACl。搖床培養30C，10h，發酵種子。15L發酵罐培養，30C，8h。然後42C，3h。離心去上清。ooo

2.產品的提取與純化濕菌超聲破碎，離心，上清超濾濃縮，SephadexG50分離。經SDS檢查。在經DE-52柱純化。三、品質控制標和要求⒈半成品檢定⑴干擾素效價測定⑵蛋白質含量測定⑶比活性⑷純度測定⑸相對分子量測定⑹殘餘外源性DNA含量測定⑺殘餘血清igG含量測定⑻殘餘抗生素活性測定⑼紫外光譜掃描⑽肽圖測定⑾等電點測定⑿除菌半成品干擾素效價測定、無菌試驗、熱原試驗。第一節概述

1890年Behring和北裏柴三郎發現白喉抗毒素,建立了血清療法,開創了抗體制藥。

1937年Tiselius用電泳法將血清蛋白分離為白蛋白、α、β、γ球蛋白，並證明抗體活性主要存在於γ球蛋白組分。

抗體是指能與相應抗原特異性結合具有免疫功能的球蛋白。

抗體的產生：機體免疫系統受抗原刺激後，B淋巴細胞被活化增殖和分化為漿細胞，由漿細胞合成和分泌的球蛋白。20世紀60年代發現多發性骨髓瘤是漿細胞癌變形成的惡性增殖性疾病。病人血清中出現同抗體結構類似的球蛋白，統稱為免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。所以Ig是化學結構的概念，而抗體是生物學功能的概念。

多克隆抗體：病原微生物含有多種抗原決定簇的抗原物質，因此這些抗體製劑也是多種抗體的混合物，故稱多克隆抗體。1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴細胞雜交瘤技術製備出單克隆抗體（monoclonalantibodyMcAb）。單克隆抗體具有高度特異性、均一性、來源穩定、可大量生產等特點，為抗體製備和應用提供了全新的手段，還促進了基礎和臨床醫學的發展。

單克隆抗體作為抗體製劑，在臨床上主要用與疾病的診斷和治療。單克隆抗體檢測與某些疾病有關的抗原，輔助臨床診斷。用放射性核素標記單克隆抗體進行腫瘤顯像，做免疫定位診斷。

單克隆抗體用於臨床治療，CD3單克隆抗體作為免疫抑制劑對器官移植免疫排斥有抑制作用。以單克隆抗體作為載體的藥物對腫瘤進行定向治療。第二節單克隆抗體

單克隆抗體是將抗體產生細胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細胞相融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細胞成為純一的單克隆細胞系而產生的。

一、抗原與動物免疫製備特定抗原的單克隆抗體，首先要製備用於免疫的適當抗原，再用抗原進行動物免疫。有的抗原可以用化學合成：地高辛多數抗原物為混合物須經免疫、篩選、克隆化。

為使雜交瘤細胞穩定，免疫動物和骨髓瘤細胞供體同一品系動物進行免疫。目前常用的骨髓瘤細胞系多來自BALB/c小鼠和LOU大鼠，因此免疫動物也採用相應的品系。

免疫的方法採用體內免疫法和體外免疫法。

體內免疫法適用於免疫原性強、抗原量較多時應用，一般用8～12周齡雌性鼠。顆粒性抗原（如細菌細胞抗原）的免疫原性強，可不加佐劑，直接注入腹腔10個細胞進行初次免疫，間隔1～3周，再追加免疫1～2次。7可溶性抗原按每只小鼠10～100μg抗原與福氏完全佐劑等量混合後注入腹腔內，進行初次免疫，間隔2～4周，再用不加佐劑原抗原追加免疫1～2次。一般再采脾細胞前3日由靜脈注射最後一次抗原。刺激B細胞分裂。

脾內免疫法即在麻醉下直接將

0.1～0.2ml抗原注入脾臟進行免疫。細胞抗原需105個，可溶性抗原需10μg。

體外免疫法用於不能採用體內免疫的情況下，如製備人源性單克隆抗體；免疫源性極弱，易引起免疫抑制。優點：需抗源量少，免疫期短，干擾因素少。

體外免疫法：用4～8周齡BALB/c

小鼠的脾臟製成單細胞懸液，再加入適當抗原使其濃度達0.5～5μg/ml,在5%CO

37C下培養4～5天,再分離脾細胞,進行細胞融合。o2o二、細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養細胞融合的方法：脾細胞（1×10）骨髓瘤細胞（2×10）混合聚乙二醇誘導下融合，2分鐘，然後用培養液將融合液緩慢稀釋。87

用於細胞融合的骨髓瘤細胞應具有融合率高，自身不分泌抗體，所產生的雜交瘤細胞分泌抗體能力強，長期穩定。

PEG相對分子量4000，濃度為50%

二甲基亞碸增加融合率。

細胞融合後可產生多種融合。脾—脾、脾—瘤、瘤—瘤融合細胞。選擇性培養:

培養基為HAT培養液。次黃嘌呤(H)氨甲喋呤(A)胸腺嘧啶(T)配製。

A阻斷DNA合成。

三、篩選陽性克隆與克隆化篩選陽性克隆常用檢測方法：免疫酶技術、免疫螢光技術、放射免疫技術等。克隆化是指單個細胞通過無性繁殖而獲得細胞集團的整個培養過程。ELISA用於破傷風抗體的篩選四、雜交瘤細胞與抗體性狀的鑒定雜交瘤細胞鑒定：染色體分析。它是鑒定的客觀指標，瞭解分泌抗體的能力。單抗進行Ig類和亞類鑒定：用羊或兔抗Ig不同類或亞類抗體，進行免疫擴散或ELISA鑒定。親和力、特異性、純度、分子量測定。五、單克隆抗體的大量製備體外培養法可獲的10μg/ml抗體體內誘生法可獲的5～20mg/ml抗體用BALB/c小鼠。降植烷接種雜交瘤細胞取腹水離心上清。

六、單克隆抗體的純化依單抗IgG類和亞類不同，選各種不同的純化方法。體內誘生法單克隆抗體的純化方法：1離心取上清，超濾，鹽析。2分離⑴凝膠過濾用於IgGIgM單抗純化。⑵陰離子交換層析IgG單抗純化。⑶親和層析IgG單抗純化。第三節鼠源性單克隆抗體

的改造

雜交瘤單抗為鼠源性，應用人體產生人抗鼠抗體及毒副作用。對鼠源性的單抗進行基因加工和改造。目的：降低免疫源性；降低相對分子量。人-鼠嵌合抗體、改形抗體、小分子抗體。Ig分子結構Ig分子的基因結構一、人鼠嵌合抗體

抗原抗體結合功能—抗體可變區（V）同種性免疫源性—抗體穩定區（C）在基因水準上將鼠源單抗的H和L鏈可變區基因分離出來，分別與人Ig的H和L鏈的穩定區（C）基因連接成人-鼠嵌合抗體的H和L鏈基因，再共轉染骨髓瘤細胞，就能表達完整人-鼠嵌合抗體。二、改形抗體（CDR移植抗體）Ig分子中參與構成抗原結合部位的區域是H和L鏈V區中的互補決定區（CDR區），而不是整個可變區。H和L鏈各有三個CDR，其他部分稱框架區。用鼠源單抗的CDR序列替換人Ig分子中