RNA沉默的定義

RNA沉默是指由雙鏈RNA（dsRNA）誘發的同源mRNA高效特異性降解的現象。生物學現象來定義：生物技術來定義：人為地引入與內源靶基因具有相同序列的雙鏈RNA,從而誘導內源靶基因的mRNA降解,達到阻止基因表達的目的。

RNA沉默是指由雙鏈RNA（dsRNA）誘發的同源mRNA高效特異性降解的現象。生物學現象來定義：生物技術來定義：人為地引入與內源靶基因具有相同序列的雙鏈RNA,從而誘導內源靶基因的mRNA降解,達到阻止基因表達的目的。

RNA沉默是指由雙鏈RNA（dsRNA）誘發的同源mRNA高效特異性降解的現象。生物學現象來定義：生物技術來定義：人為地引入與內源靶基因具有相同序列的雙鏈RNA,從而誘導內源靶基因的mRNA降解,達到阻止基因表達的目的。

1精選課件ppt基因沉默現象的發現1990年，Jorgensen等將產生色素的基因導入矮牽牛中，試圖加深花朵的顏色，結果很多花沒有變成深紫色，反而成了花斑的甚至白的。表明不僅導入的基因未表達，而且本身同源的基因失活。從而發現在轉基因植物中存在基因表達的共抑制現象，即轉入的外源基因和本身的同源基因都被抑制，出現基因沉默現象。2精選課件ppt父本轉基因后代圖1.GUS基因導入矮牽牛后的轉基因植株3精選課件ppt1998年Fire等證實，將制備的RNA高度純化后發現，單鏈RNA的基因抑制作用很微弱，而用純化后的dsRNA卻能高效、特異地阻斷相應基因的表達。實驗證明雙鏈RNA抑制基因的表達的效率比純化后的反義RNA至少高幾個數量，他們稱此現象為dsRNA介導的RNA干擾（RNAi）4精選課件pptRNA沉默的作用機制dsRNA在Dicer酶的作用下，被切割加工成21~25nt的雙鏈siRNA激活的RISC將siRNA的雙鏈解開，并通過堿基互補配對識別互補的mRNA，然后切割靶mRNA。siRNA結合一個酶復合物形成RISC5精選課件ppt植物病毒編碼的沉默抑制因子

RNA沉默抑制子的發現1997年，馬鈴薯X病毒屬與馬鈴薯Y病毒屬間的協同效應的研究發現馬鈴薯X病毒屬編碼的HC-Pro蛋白在協生中起致病增強的作用，HC-Pro蛋白可能充當RNA沉默的抑制子。1998年，三個獨立的小組采用不同的方法證實了這一推測。6精選課件pptRNA沉默抑制子的作用機理抑制病毒siRNA的產生阻礙siRNA整合入RISC干擾RISC降解同源的mRNA

主要的三種作用方式7精選課件ppt沉默抑制子的主要鑒定方法基因沉默的回復用攜帶待鑒定基因的病毒載體接種報告基因已經發生沉默的轉基因植物，觀察病毒載體引起的癥狀是否加重和報告基因能否回復表達。農桿菌浸潤GFP系統沉默接種帶有待鑒定基因的病毒載體農桿菌浸潤農桿菌浸潤農桿菌浸潤接種帶有待鑒定基因的病毒載體農桿菌浸潤接種帶有待鑒定基因的病毒載體農桿菌浸潤8精選課件pptABCDA.GFP在煙草中大量表達；B.攜帶嵌入GFP的雙向質粒的農桿菌誘導的GFP基因沉默；C.PVY感染GFP發生沉默的煙草；D.帶有PVYHC-Pro基因的PVX病毒載體感染GFP發生沉默的煙草。紫外燈下觀察GFP為綠色熒光9精選課件ppt農桿菌共浸潤瞬時抑制試驗構建分別含有報告基因和抑制子基因的兩種農桿菌質粒后將含有兩種這兩種質粒的農桿菌混合注射植物葉片上，再跟蹤觀察注射區域的報告基因的表達情況。如果候選基因具有抑制子活性，報告基因的表達會持續很長時間，反之報告基因很快被沉默。此方法快速、簡單，已被普遍應用，可用來快速、大量地篩選抑制子。HC-ProCMV2bRGDVPns11空載體RGDVPns11抑制局部GFP沉默帶有35S-GFP的農桿菌與帶有相應質粒的農桿菌混合后共滲透接種轉基因本生煙16c，接種6天后在長波紫外燈下觀察GFP熒光。10精選課件ppt功能互補法

利用有抑制功能的抑制子來代替候選抑制子的一種方法。如，BSMV的b蛋白去除后病毒致病力下降，檢測表明由RNA沉默引起。但這個突變株在轉PVA的HC-Pro基因的植株內表現很強的致病力。并且用HC-Pro替換b基因的重組病毒也能引起很強的致病力，同時RNA沉默的標志物siRNA也消失了。