視頻：bio863-跨越世紀的生命贊歌——863計劃生物技術領域15周年回眸細胞培養室中下列物品該如何消毒？玻璃培養瓶，移液管，試管等玻璃器皿？超凈工作臺臺面？金屬手術器械？不耐熱的液體培養基和胰蛋白酶等？橡膠塞和塑料瓶蓋等？細胞培養室？操作人員的手部？實驗室桌面、地面等？視頻：滅菌和消毒技術.wmvChapter3細胞培養的基本方法◆無菌操作技術◆培養細胞的觀察◆常用的染色方法◆細胞培養的污染和檢測/◆無菌操作成功或失敗的首要條件◆培養前準備操作卡片用品置于場地，然后消毒操作野消毒洗手和著裝火焰消毒一、無菌操作技術要領動作準確敏捷不用手觸及已消毒物品操作面布局合理操作保持一定順序培養用瓶和吸管的放置防止各種用液的交叉污染不向操作野講話或咳嗽視頻：03細胞培養之無菌操作.rmChapter3細胞培養的基本方法◆無菌操作技術◆培養細胞的觀察◆常用的染色方法◆細胞培養的污染和檢測

由于細胞小而復雜，若不借助適當的手段，則難以觀察其形態、結構，更難發現細胞內各種組分的分子組成及功能。目前，已有多種研究細胞的技術，從光鏡到電子顯微鏡，從一般細胞化學法到免疫化學法等。

細胞在體外培養過程中需要每天進行常規檢查和顯微鏡觀察，及時了解細胞生長狀態、數量改變、細胞形態、細胞有無移動、有無污染、培養液pH是否變酸、變黃是否更換等。二、培養細胞的觀察方法1.肉眼觀察肉眼觀察培養液的顏色和透明度的變化。正常情況下，培養液pH介于7.2～7.4之間，呈桃紅色清亮透明。（指示劑：酚紅）培養時，細胞代謝會使培養液pH值下降，引起顏色變淺變黃。發現培養液變黃，應及時換液傳代。一般生長穩定的細胞2～3天換液一次，生長緩慢的細胞3～4天換液一次。

苯酚紅Phenolred

別名：酚紅；苯酚磺酞；Phend-sulphonphthalein

分子式：C19H1405S相對分子質量：354．38性狀:紅色結晶性粉末。微溶于水，易溶于乙醇及堿溶液，不溶于三氯甲烷及醚。溶于稀堿溶液呈紅色。

用途：酸堿指示劑，pH值1.2（橙）～3.0(黃），6.5（棕黃）～8.0(紫紅）酚紅在培養基中被用來作為PH值的指示劑:中性時為紅色,酸性時為黃色,堿性時為紫色。問題：細胞培養過程中，培養基會逐漸變黃，為什么？培養基如果暴露在空氣中會逐漸變紫，為什么？（page45）生長良好的細胞，在顯微鏡下可觀察到細胞透明度大，折光性強，輪廓不清。相差顯微鏡觀察時可見細胞部分細微結構。若細胞生長狀態不良，可見細胞輪廓增強，細胞折光性變弱，胞質中出現空泡、脂滴和其他顆粒狀物質，細胞之間空隙增大，細胞形態不規則，甚至失去原有細胞的特點，產生圓縮脫落，有時細胞表面及周圍出現絲絮狀物。發現這種情況應及時處理。2.顯微鏡觀察◆倒置顯微鏡培養的CHO細胞◆相差顯微鏡視頻：相差顯微鏡的使用.wmv相差顯微鏡由相差聚光器和相差接物鏡兩個主要部分組成。它與普通光鏡相比多了兩個部件，一個是在聚光器上增加一個環形光闌，使透過聚光器的光線形成空心光錐、聚焦到標本上。另一個是在物鏡的后焦面增加一個相板，相板有一個環形區，其大小恰好通過環形光闌束的直射光，相板各區鍍以不同物質，使得通過環形區的光比通過相板其他部位的光超前或滯后1/4λ相差顯微鏡的結構

相差顯微鏡的基本原理把透過標本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結構之間的對比度，使標本的各種結構變得更清晰可見。光線透過標本后，發生折射，偏離了未通過標本的光線的光路，這兩組光線合軸后，則發生相互干涉現象。透過生物標本發生折射的光線與未透過標本的光線之間產生了光程差。前者被阻滯了1/4λ(波長)。如果把光程差再增加1/4λ，則變為1/2λ，合軸后兩束光線的干涉加強，使標本周圍發生暈圈，提高了可見度。相差顯微鏡觀察活細胞的步驟首先調好相位板，使聚光器相位板號與接物鏡放大倍數(相位板)相一致。然后抽出接目鏡，再換輔助望遠鏡，移動輔助鏡筒并調整聚光器相位板，使視影中兩個大小一樣的光環相互吻合。再重新換上原接目鏡，即成相差圖像。當更換不同倍數接物鏡時，需按上述過程重新調節。用相差顯微鏡觀察細胞應注意瓶（或皿）的厚度、均勻性、清潔度、氣溫等。經標準化生產的培養板、培養瓶（或皿）一般成像效果都較好，但反復刷洗過的玻璃或塑料器皿將嚴重影響分辨力。天氣較冷時，若與顯微鏡觀察處溫差較大，由于溫差使培養瓶內壁形成霧滴而影響觀察的清晰度，此時可輕輕將瓶傾斜使瓶內培養液浸潤內壁，以得到好的相差像。若對原代細胞培養進行相差顯微照相，最好選擇換液后進行，這樣可以去除漂浮的組織塊和死細胞，提高成像清晰度。觀察細胞時要有無菌概念，動作要輕，避免猛烈振蕩。觀察時間不要太長，觀察次數也不要太頻繁，以免影響細胞生長。思考

某種藥物（或向細胞中轉入某個新基因；或抑制細胞中某個原有基因的表達后）對培養的某種腫瘤細胞的形態和生長增殖的影響。提示：（1）細胞形態的觀察手段和觀察指標（2）檢測細胞生長增殖狀態的手段和指標視頻：抗腫瘤藥物臨床前藥效學評價關鍵技術及平臺研究順利通過驗收.asf三、培養細胞的檢測指標1.細胞計數細胞生長狀況有關指標的檢測方法

Cellcountingusingahaemocytometer

細胞數/毫升細胞懸液＝4大格細胞總數/4×10000×稀釋倍數1毫米計數原則：不數死細胞（染藍）、壓線細胞數上不數下，數左不數右，一團細胞按一個計數！視頻：細胞計數.wmv1毫升＝1立方厘米2.細胞生長曲線如何作？page73三、培養細胞的檢測指標◆生長曲線是培養細胞生物學特性的基本參數之一，是測定細胞絕對生長數的常用方法，也是判定細胞活力的重要指標?！舫Ｓ糜跍y定藥物等外來因素對細胞生長的影響！3.細胞分裂指數細胞分裂指數是表示細胞增殖旺盛程度的指標。它以被測1000個細胞中的分裂細胞數來計算。其方法為：用秋水仙素將細胞處理1～2小時后，按染色體制片法制片并染色，計算1000個細胞中分裂相的數目，重復4次取平均值，用百分比表示。

三、培養細胞的檢測指標基本步驟：(1)細胞準備用蓋片(支持物)培養法。(2)每24小時取出一個小玻片，按常規方法進行固定，吉姆薩或HE染色，封片，制成永久標本。(3)顯微鏡下選擇細胞密度適中的區域觀察分裂細胞并計數。逐個視野進行，對每一時間組的玻片各取細胞多、中、少3個區域各一區，共數1000個細胞，計算出平均分裂相值所占百分比。觀察時要掌握好分裂相標準，主要是確定好劃分間期和前期，末期和間期等的界限，以減少誤差。

細胞分裂指數=細胞分裂相數/細胞總數(1000)×1000

4.細胞貼壁率

細胞貼壁率又稱細胞接種存活率。它是細胞被制成分散的懸液后，以低密度(2～5個細胞/cm2)被接種到底物上，貼壁并能存活生長形成細胞小群(克隆)的細胞百分數值，用以表示細胞的生存能力和細胞群的活力。三、培養細胞的檢測指標（1）取對生長期細胞，用消化法制成細胞懸液，計數后按檢測細胞生長曲線的接種細胞的原則，將細胞接種于培養瓶(濃度相對高些)。接種12～15瓶。（2）每2小時取出一瓶細胞，倒掉培養液，然后加入胰酶消化已貼壁細胞，計數已貼壁細胞，用下面公式逐個計算每個時間上的貼壁率。每2小時一次，共觀察24小時即12。接種存活率%(貼壁率)=(貼壁存活細胞數/接種細胞數)×100%基本步驟：5.克隆形成率細胞接種存活率只表示接種細胞后貼壁的細胞數，但貼壁后的細胞不一定每個都能增殖和形成克隆。而形成克隆的細胞必為貼壁和有增殖活力的細胞?？寺⌒纬陕史从臣毎后w依賴性和增殖能力兩個重要性狀。由于細胞生物學性狀不同，細胞克隆形成率差別也很大，一般初代培養細胞克隆形成率弱，傳代細胞系強；二倍體細胞克隆形成率弱，轉化細胞系強；正常細胞克隆形成率弱，腫瘤細胞強。并且克隆形成率與接種密度有一定關系，做克隆形成率測定時，接種細胞一定要分散成單細胞懸液，直接接種在碟皿中，持續一周，隨時檢查，到細胞形成克隆時終止培養。三、培養細胞的檢測指標平板克隆形成試驗基本步驟：(1)取對數生長期的單層培養細胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞，把細胞懸浮在10%胎牛血清的RPMI1640培養液中備用。(2)將細胞懸液作梯度倍數稀釋，以適當的細胞密度(根據增殖能力)接種于培養皿中。一般分每皿50、100、200個細胞的梯度密度分別接種含10mL37℃預溫培養液的皿中，并輕輕轉動，使細胞分散均勻。置37℃5%CO2及飽和濕度的環境下，靜置培養2～3周。(3)經常觀察，當培養皿中出現肉眼可見的克隆時，終止培養。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加純甲醇或1:3醋酸/甲醇5mL，固定15分鐘。然后去固定液，加適量Giemsa應用染色液染10～30分鐘，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。

(4)將平皿倒置并疊加一張帶網格的透明膠片，用肉眼直接計數克隆，或在顯微鏡(低倍鏡)計數大于10個細胞的克隆數。最后計算克隆形成率。

克隆數

克隆形成率=—————×100%

接種細胞數平板克隆形成試驗方法簡單，適用于貼壁生長的細胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗成功的關鍵是細胞懸液的制備和接種密度。細胞一定要分散得好，不能有細胞團，接種密度不能過大。軟瓊脂培養克隆形成試驗基本步驟：(1)取對數生長期細胞，用0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打，使之成為單細胞，作活細胞計數，用含20%胎牛血清的DMEM培養液調整細胞密度至1×106細胞/L。然后根據實驗要求作梯度倍數稀釋。(2)用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%兩個濃度的低溶點瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40℃中不會凝固。

(3)按1:1比例使1.2%的瓊脂糖和2×DMEM培養基(含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直徑6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)，冷卻凝固，可作底層瓊脂置CO2溫箱中備用。(4)按1:1比例讓0.7%的瓊脂糖和2×DMEM培養基在無菌試管中相混以后，再向管中加入0.2mL的細胞懸液，充分混勻，注入鋪有1.2%瓊脂糖底層平皿中，逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37℃5%CO2溫箱中培養10～14天。(5)把平皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細胞克隆數。計算形成率。軟瓊脂培養法常用檢測腫瘤細胞和轉化細胞系。試驗中瓊脂與細胞相混時，瓊脂溫度不宜超過40℃。接種細胞的密度每平方厘米不超過35個，一般6cm的平皿接種1000個細胞。正常細胞在懸浮狀態下不能增殖，不適用于軟瓊脂克隆形成試驗。5.細胞周期標記有絲分裂百分率法（percentagelabeledmitoses，PLM）：對測定細胞進行脈沖標記、定時取材、利用放射自顯影技術顯示標記細胞，通過統計標記有絲分裂細胞百分數的辦法來測定細胞周期。放射標記物為3H或者14C標記的TdR。三、培養細胞的檢測指標50100TG20TMTsTcTG2+1/2TM常以TC-

（TG2+TM+TS）的方式求出TG16.MTT法測定細胞活力四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍，

四唑鹽比色法的原理：活細胞線粒體中琥珀酸脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍紫色產物甲臜（formazan)，并沉淀在細胞中，而死細胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細胞中藍紫色結晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標儀測定OD值。

MTT法簡單快速、準確，廣泛應用于新藥篩選、細胞毒性試驗、腫瘤放射敏感性實驗等。三、培養細胞的檢測指標操作步驟：（1）細胞懸液接種于96孔培養板；103-104細胞/孔，每孔培養基總量200微升（96孔培養板每孔容積370微升），37℃、5％CO2培養箱中培養一段時間（根據實驗目的決定培養時間）（2）加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／孔）；繼續培養3小時。（3）吸出孔內培養液后，加入DMSO液（150微升／孔），將培養板置于微孔板扳蕩器上振蕩10分鐘，使結晶物溶解。（4）酶標儀檢測各孔OD值（檢測波長570納米）。記錄結果，繪制細胞生長曲線。每隔24小時測量一個點，3個平行樣品！視頻：藥物對細胞增殖的影響——細胞生物學實驗教學案例.wmvRNAi基因抑制對細胞生長和增殖的影響.ppt基因抑制對細胞生長和增殖的影響.pptChapter3細胞培養的基本方法◆無菌操作技術◆培養細胞的觀察◆常用的染色方法◆細胞培養的污染和檢測離體活細胞染色觀察中性紅染色

中性紅是常用的活體染色染料，常用的濃度為1:10000，用生理鹽水(或Hanks液)溶解后進行高壓蒸氣滅菌暗處存放，可直接浸染活體細胞顯微鏡下觀察或用于細胞的病毒蝕斑，肉眼計數空斑數目。因其毒性大，染色后細胞不能再培養。臺盼藍染色

用0.5%濃度的臺盼藍（Trypanblue）,用PBS配制，室溫保存，該染料只對死細胞著色，可測定活細胞數和計算存活百分率。細胞死活鑒定——染料排除檢測法溴化乙錠（EB）和碘化丙啶（PI）染色

嵌入核酸雙鏈之間，只能標記死細胞?。t色熒光）AcridineOrange（AO）丫啶橙可染活或死細胞，同時標記DNA和RNADNA：綠色熒光RNA：紅色熒光熒光染料染色觀察Chapter3細胞培養的基本方法◆無菌操作技術◆培養細胞的觀察◆常用的染色方法◆細胞培養的污染和檢測一、污染途徑◆空氣◆器材清洗消毒不徹底◆操作◆血清◆組織二、污染對培養細胞的影響及檢測最嚴峻的挑戰-污染(contamination)

細胞培養的污染問題十分重要，一旦發生污染，將導致前功盡棄。所以細胞培養一定要建立無菌觀念。遇到培養污染要分析原因，及時處理。

細胞培養中常見的污染物有細菌、酵母菌、真菌、支原體和病毒等。在出現以下情況時培養的細胞可能有污染：1)培養液的酸堿度發生異常的改變。2)培養液出現混濁。3)光鏡觀察到菌絲和顆粒。4)細胞出現死亡或增殖緩慢等。

細菌污染培養液渾濁鏡下可見菌體真菌污染大多呈白色或淺黃色小點漂浮于培養液表面鏡下呈絲狀、管狀或樹枝狀，縱橫交錯支原體污染最常見、不易察覺大小介于0.2-2μm，約1%可通過濾菌器對酸耐受性差，對熱較敏感，青霉素無效“正?！备杏X腺苷酸環化酶精氨酸檢測◆支原體檢測:

支原體污染細胞后，能抑制細胞代謝和生長，改變核酸合成，影響細胞的抗原性，引起細胞染色體改變，干擾DNA的復制，以及具有類病毒作用。在培養細胞初期，由于支原體對細胞的繁殖影響較小而往往被忽略。支原體檢測方法和處理

1）熒光技術檢測：支原體含有DNA，能與一種熒光染料Hoechest33258特異性的結合，可根據細胞表面的熒光來顯示細胞是否污染有支原體。2）直接培養法：實驗室常用。3）放射自顯影檢測：4）DNA分子雜交：

檢測完畢后，所有實驗用具均應經過高壓消毒處理支原體污染電鏡照片（×30K）病毒的污染及檢測1）致細胞病變效應（Cytopathiceffect,C