Y染色體微缺失檢測

迪安醫學檢驗中心

編輯課件一、背景1全球不育夫婦占已婚夫婦10%-15%2其中男性原因占40%-50%3遺傳因素占男性不育的30%410%~15%的特發性無精癥存在Y染色體的微缺失編輯課件二Y染色體微缺失相關基因Y染色體是最短的近端著絲粒染色體,是男性特有的染色體。1976年，Tiepolo和Zuifaidi首先提出Y染色體上有多個基因參與生精過程。多年研究，發現男性特有的Y染色體上面存在一個關鍵的與生育相關的因子的區域，稱為AZF區。目前認為在AZF區上存在四個精子發生亞區〔AZFa、AZFb、AZFc、AZFd〕，各亞區包含的位點在男性生殖細胞發育的不同時期起著不同的作用，位點的缺失可致患者表現為少、弱精癥或無精癥從而引發不育。一般認為，Y染色體的近端缺失〔涉及AZFa和AZFb〕，表現以唯支持細胞綜合癥為主的嚴重生精障礙，Y染色體的遠端缺失〔涉及AZFd和AZFc〕，可殘留島狀的生精正常區域。對無精癥患者中，對檢查睪丸過小或睪丸活檢仍無精子患者，一般不再行AZF基因檢測。總之，開展染色體和AZF檢測，可全面評價男性不育遺傳缺陷，從而更好的解釋發病原因，提供遺傳咨詢和指導臨床診療。1996年將AZF區劃分為3個區:AZFa、AZFb、AZFc。1999年研究發現在AZFb和AZFc間存在AZFd。研究發現,在Y染色體AZFa、AZFb、AZFc3個區至少發現15個與精子發生相關的基因，AZFd區尚未發現相關基因。編輯課件二Y染色體微缺失相關基因AZFa缺失的病人,主要表現為唯支持細胞綜合征伴睪丸體積縮小,無精子生成AZFb缺失的病人主要表現為生精過程阻滯在精母細胞階段,無精子生成AZFc區缺失病人表現多樣化,會出現無精子癥和少精子癥的不同臨床表現編輯課件二Y染色體微缺失相關基因AZFa缺失患者33%為嚴重少精子,67%表現為無精子AZFb缺失患者9%輕度少精子,23%嚴重少精子,68%無精子AZFc缺失患者46%嚴重少精子,54%無精子編輯課件二Y染色體微缺失相關基因AZFa-b缺失患者50%嚴重少精子50%無精子AZFa-c缺失患者100%無精子AZFb-c缺失患者4%嚴重少精子,96%無精子編輯課件二Y染色體微缺失相關基因AZFa缺失較為少見,占整個AZF缺失4.9%。整個AZFa區域缺失通常表現為SCOS,為絕對的無精子癥。假設患者為AZFa缺失,不建議做睪丸穿刺尋找精子進行卵細胞胞質內單精子注射，目前只能尋求供精人工授精技術來獲得妊娠。編輯課件二Y染色體微缺失相關基因AZFb缺失也不多見,占整個AZF缺失15.8%。缺失的典型睪丸組織學特征是精子成熟障礙,主要停滯在初級精母細胞階段。但也有SCOS的報告，睪丸穿刺不能獲得精子,因此,臨床上也不建議做睪丸穿刺。編輯課件二Y染色體微缺失相關基因AZFc缺失是臨床上最常見的AZF缺失類型,臨床和睪丸組織學表型多種多樣。一般說來,AZFc缺失患者尚存精子生成能力。AZFc缺失見于無精子癥或嚴重少精子癥患者,罕見情況下,也可以在自然狀態下遺傳給其男性后代在無精子癥患者中,AZFc缺失者通過睪丸精子穿刺獲得精子的時機比其他缺失類型大,同時可以從睪丸穿刺獲得精子進行ICSI受孕,但這些患者的男性后代都將是AZFc缺失的攜帶者，建議在進行試管嬰兒前,行遺傳咨詢。編輯課件三AZF微缺失與其他不育因素AZF微缺失與隱睪癥AZF微缺失與精索靜脈曲張AZF微缺失與雙側輸精管缺如AZF微缺失與睪丸支持細胞AZF微缺失與生殖激素異常AZF微缺失與其他不育因素編輯課件四Ｙ染色體微缺失的檢測方法核型分析總體上來說操作繁瑣、效率不高,尤其是難以檢測出微小的染色體異常或變異。熒光原位雜交(Fluorescenceisituhybridization,FISH)雖然有更高的分辨率,但其檢測的范圍為20kb~5Mb,對于微小的染色體缺失也難以檢測,且繁瑣的實驗操作與高昂的本錢也限制了FISH技術在臨床中的廣泛應用。編輯課件四Ｙ染色體微缺失的檢測方法目前關于Ｙ染色體微缺失的檢測方法最常用的是多重聚合酶鏈反響(ＰＣＲ)技術而檢測的位點有很多但有研究說明ＳＹ８４ＳＹ１５２ＳＹ１２７ＳＹ１４７\ＳＹ２５４-ＤＡＺ和ＲＢＭＹ１這６個基因標志物能覆蓋大局部已發現的微缺失其他的位點序列靈敏度比較低,當然不同種族間可能會有輕微的差異編輯課件四Ｙ染色體微缺失的檢測方法由于不同實驗室采用PCR方法不同,導致實驗結果各異。為提高診斷質量，歐洲男科協會(EAA)和歐洲分子遺傳實驗質控網(EMQN)在1999、2004年先后公布了第1版和第2版Y染色體微缺失分子診斷指南，標準了檢測微缺失時的Y染色體序列標簽點(sequencetargetedsites，STS)與所采用的內外對照方法。編輯課件四Ｙ染色體微缺失的檢測方法選擇位于Y染色體短臂(Yp)的睪丸決定基因(SRY)和鋅指蛋白基因(ZFX／ZFY)為對照。ZFX／ZFY既存在于x染色體短臂，也存在于Yp，其與SRY一起構成2個目前推薦使用的參照基因。每個AZF區域至少設置2個STS位點才能正確有效.其推薦的STS為AZFa：sY84，sY86：AZFb：sY127，sY134；AZFc：sY254，sY255。多重PCR實驗中的引物應包括：sY14(SRY)，zFY，，sY84，sY86，sY127，sY134，sY254，sY255。編輯課件五染色體微缺失相關基因研究的

意義1用于原發性無精或少弱精癥的遺傳咨詢。通過遺傳病因診斷，找到男性不育的遺傳病因，那么可防止不必要的藥物及手術治療。2進行輔助生育之前對其進行遺傳病因診斷，可盡量防止將不良基因傳遞給下一代3輔助生育精子質量篩選4為未來的基因治療提供理論依據。編輯課件染色體微缺失相關基因研究的

意義為臨床治療各種男性不育提供分子或細胞水平的依據，Ｙ染色體微缺失雖然不會影響身體健康和心理健康，但會導致后代出現同樣的不育問題對于不育夫婦，特別是無精子癥和嚴重少精癥的不育夫婦，雖然其可以通過ＩＣＳＩ到達妊娠的目的，并且有正常的胚胎發育和足月妊娠，但在接受ＩＣＳＩ治療之前有必要進行Ｙ染色體微缺失的檢測以及移植前遺傳診斷，盡量選擇女嬰，切斷遺傳途徑。編輯課件EGFR突變與非小細胞肺癌酪氨酸激酶抑制劑靶向治療編輯課件一背景肺癌是當今世界上最常見的惡性腫瘤,男性肺癌占各類惡性腫瘤發病率的首位,女性肺癌發病率僅次于乳腺癌占第2位。盡管手術和化療技術不斷提高,但肺癌患者的預后仍然很差,5年生存率仍<20%。近年來隨著分子生物學技術的提高,產生了一些針對分子靶點的抗腫瘤藥物。這些藥物針對性強,能特異性地殺傷腫瘤細胞。其中以表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)為靶點的分子靶向治療(moleculartargetedtherapy)在非小細胞肺癌的治療中日漸突出。編輯課件EGFR屬于受體酪氨酸激酶(receptortyrosinekinases,RTKs),調控細胞的生長、分化、血管生成及凋亡抑制,其信號通路與惡性腫瘤的生長、侵襲及轉移關系密切。靶向藥物稱作酪氨酸激酶抑制劑(tyrosinekinasesinhibitors,TKIs),其中吉非替尼(Gefitibib,商品名為Iressa易瑞沙)和埃羅替尼(Erlotinib,商品名為Tarceva特羅凱)治療可以使腫瘤縮小。在Gefitibib和Erlotinib的臨床試驗和治療中,僅有一局部NSCLC人群對藥物有反響編輯課件發現幾乎所有對TKIs敏感的NSCLC患者都存在EGFR基因的體細胞突變。因此,研究NSCLC患者不同治療反響性的機制、以及從中篩選出最適治療對象進行有針對性的治療具有重要臨床意義。編輯課件EGFR基因突變與TKIs治療敏感性文獻報道：肺癌細胞中EGFR酪氨酸激酶編碼區基因突變是靶向藥物奏效的一個必要前提條件,研究結果顯示,對EGFR突變型NSCLC,Gefitinib的有效率高達80%以上,而對野生型腫瘤那么根本無效。這一研究隨后被相繼其它研究所證實。編輯課件EGFR基因位于7號染色體短臂7p12～14區,由28個外顯子組成。EGFR在許多腫瘤中過表達,與腫瘤的生長侵襲及轉移密切相關。在肺癌中,EGFR突變多出現于外顯子18～21區。最常見的突變包括19區的缺失突變(deletion)和21區的點突變(pointmutation),這兩種突變約占所有EGFR突變的85%～90%。編輯課件外顯子19區的堿基缺失主要是第746～752位密碼子的缺失突變,導致EG2FR蛋白中氨基酸序列喪失,這一缺失改變了受體酪氨酸激酶ATP結合槽(ATP2bindingcleft)的角度,從而改變了細胞對TKIs的敏感性。外顯子21的點突變主要是第858位密碼子出現T→G轉換,引起EGFR蛋白中該位點的氨基酸由亮氨酸轉變為精氨酸(簡稱L858R),此種結構改變也使細胞對TKIs的敏感性發生變化編輯課件其他EGFR突變比較少見,包括外顯子18區的點突變和外顯子20區的插入突變編輯課件TKIs治療耐受與EGFR二次突變并不是所有的EGFR突變都會導致對Gefitinib或Erlotinib敏感性的增加,對Gefitinib或Erlotinib最初有反響的患者可發生二次突變而出現TKI治療耐受。如T790M,發生在EGFR外顯子20區,編碼的蘇氨酸轉變為甲硫氨酸;氨基酸的改變導致了ATP結合區結構改變,使得細胞對TKIs的敏感性降低。T790M突變也可出現在未做治療的患者中,因此,對于EGFR不同突變的功能有必要進一步研究,以明確某個或某幾個突變是篩選適合TKIs治療患者的最正確指標。編輯課件EGFR基因擴增和CA重復序列的多態性表達EGFR或存在EGFR基因擴增的患者對Erlotinib治療反響好,并且生存率得到明顯提高。研究發現：EGFR的高拷貝數與對藥物較好的反響率、疾病控制率和存活率相聯系。EGFR蛋白的高表達與好的治療結果之間的關聯度那么次之。同時EGFR突變與較好的反響率和預后有關。編輯課件但進一步的統計分析說明只有高的EGFR基因拷貝數對應較高的存活率。因此說明,EGFR基因擴增可作為篩選TKIs治療的指標之一。編輯課件研究發現,位于EGFR內含子1的CA重復序列的多態性可影響EGFR的蛋白表達,低重復CA數患者EGFR的RNA和蛋白表達高于高重復CA數的患者,體外實驗也證實低重復CA數細胞對Gefitinib的敏感性較高。編輯課件EGFR家族其他成員—HER2/HER3HER2可與EGFR結合形成異源二聚體,引發受體自身磷酸化過程。有研究認為,HER22基因拷貝數增加的腫瘤對Gefitinib更敏感。但亦有研究發現,FISH(原位熒光雜交)檢測HER2或HER3陽性腫瘤與陰性腫瘤相比,兩組患者的病程進展時間及平均存活時間均沒有顯著差異。但是在體外細胞株的實驗中,不管有無EGFR突變存在,HER2和(或)HER3高表達的細胞表現出對Gefitinib較高的敏感性。編輯課件K-RAS基因突變K-RAS是EGFR信號通路下游的基因。與EGFR基因突變相反,K