基因工程的基本內容一、基因工程的概念二、基因操作的工具三、基因操作的步驟四、基因工程的應用五、蛋白質工程的崛起一、基因工程概念

在生物體外，通過對DNA分子進行人工“剪切”和“拼接”，對生物的基因進行改造和重新組合，然后導入受體細胞進行無性繁殖，使重組基因在受體細胞內表達，產生出所需要的基因產物。別名基因拼接技術或DNA重組技術操作環境生物體外操作對象基因操作水平DNA分子水平基本過程剪切→拼接→導入→表達結果人類需要的基因產物二、基因工程的基本工具基因的剪刀——限制性內切酶基因工程過程示意圖基因的針線——DNA連接酶基因的運輸工具——運載體返回主頁二、基因工程的基本工具⑥培養大腸桿菌克隆大量基因⑤用重組質粒轉化大腸桿菌④DNA重組③分離大腸桿菌中質粒②限制酶截取DNA片斷返回基因工程過程示意圖①從細胞中分離出DNA①②③④⑤⑥㈠、限制性內切酶返回分布：主要在微生物中（原核生物）。特點：特異性，即識別特定核苷酸序列，切割特定切點（磷酸二酯鍵）。一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并在特定的切割點上將DNA分子切斷。目前已從近300種微生物中分離出4000種限制酶。（限制性內切酶作用）二、基因操作的工具㈠、限制性內切酶返回分布：主要在微生物中（原核生物）。特點：特異性，即識別特定核苷酸序列，切割特定切點（磷酸二酯鍵）。結果：產生黏性未端（堿基互補配對）和平末端。舉例：EcoR1限制酶、Sma1限制酶

二、基因操作的工具連接酶的作用：將互補配對的兩個黏性末端連接起來，使之成為一個完整的DNA分子。問題用DNA連接酶連接兩個相同的黏性未端要連接幾個磷酸二酯鍵？返回二、基因操作的工具連接的部位：磷酸二酯鍵，不是氫鍵。OHP5`3`3`5`5`3`3`5`DNAligase連接脫氧核糖和磷酸㈡、DNA連接酶連接酶的作用返回二、基因操作的工具㈢、運載體作用：將外源基因送入受體細胞。條件：能在宿主細胞內復制并穩定地保存。具有一或多個限制酶切點。具有某些標記基因（抗藥基因，如抗四環素的標記基因）必須是安全的分子大小應適合種類：質粒、噬菌體和動植物病毒。能將外源基因送入受體細胞的工具二、基因操作的工具非編碼區編碼區上游原核細胞的基因結構非編碼區編碼區編碼區下游啟動子終止子內含子外顯子編碼蛋白質不編碼蛋白質終止子真核細胞的基因結構編碼區上游編碼區非編碼區非編碼區啟動子編碼區下游基因的結構三、基因工程的基本操作程序（一）目的基因的獲取（二）基因表達載體的構建（三）將目的基因導入受體細胞（四）目的基因的檢測與鑒定返回主頁（一）目的基因的獲取三、基因操作的基本步驟從自然界中已有的物種中分離人工的方法合成。獲取目的基因的方法：①從基因文庫中獲取②利用PCR技術擴增目的基因主要指編碼蛋白質的基因。蘇云金桿菌抗蟲基因、人胰島素基因、人干擾素基因、種子貯藏蛋白基因、植物抗病基因等將某生物不同基因的DNA片斷，導入到受體菌群中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫基因組文庫部分基因文庫（如:cDNA文庫）1.基因文庫ⅰ.從基因文庫中獲取目的基因（一）提取目的基因適當限制酶①.基因組文庫的構建提取某生物全部DNA許多DNA片段與載體連接導入該生物基因組文庫基因組文庫與cDNA文庫的構建mRNA逆轉錄酶雜交雙鏈核糖核酸酶H單鏈DNADNA聚合酶雙鏈DNA與載體連接導入受體該生物cDNA文庫②.cDNA文庫的構建每個受體菌含有一段不同的DNA片段ⅰ.從基因文庫中獲取目的基因（一）提取目的基因文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小基因中啟動子基因中內含子基因多少種間基因交流小大無有無有某生物的部分基因某生物的全部基因可以部分可以ⅰ.從基因文庫中獲取目的基因（一）提取目的基因基因組文庫與cDNA文庫的構建ⅱ.利用PCR技術擴增目的基因（一）提取目的基因①概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復制____________的核酸合成技術③條件：_____________________、________、

_______________、__________前提條件②原理：________④方式：以_____方式擴增，即____（n為擴增循環的次數）⑤結果：聚合酶鏈式反應體外特定DNA片段DNA復制已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸一對引物DNA聚合酶指數2n使目的基因在短時間內成百萬倍地擴增ⅱ.利用PCR技術擴增目的基因（一）提取目的基因⑥過程：a.DNA變性（90-95℃）:雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成_______。b.退火（復性55-60℃）:系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部______。c.延伸（70-75℃）:在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的_______。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈ⅱ.利用PCR技術擴增目的基因（一）提取目的基因ⅲ.人工合成目的基因（一）提取目的基因基因較小，核苷酸序列已知，可以利用DNA合成儀用化學方法人工合成1、目的：使目的基因在受體細胞中穩定存在，并可遺傳給下一代，同時使目的基因能表達發揮作用。2、組成：①復制原點②目的基因③啟動子④終止子⑤標記基因三、基因操作的基本步驟（二）基因表達載體的構建啟動子：位于基因首端的一段特殊結構的DNA片段，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA，最終獲得蛋白質。3、作用：終止子：位于基因尾端的一段特殊結構的DNA片段，能終止mRNA的轉錄標記基因：為鑒別受體細胞中是否含有目的基因從而將含有目的基因的細胞篩選出來三、基因操作的基本步驟（二）基因表達載體的構建ⅰ.轉化：ⅱ.方法導入植物細胞導入動物細胞導入微生物細胞農桿菌轉化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——Ca2+處理目的基因進入__________內，并且在受體細胞內維持_____和_____的過程受體細胞穩定表達（三）將目的基因導入受體細胞三、基因操作的基本步驟ⅱ.方法：a.農桿菌轉化法⑴.特點：易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數單子葉植物沒有感染能力⑵.原理：植物體受損傷時，傷口處細胞分泌大量酚類化合物吸引農桿菌，農桿菌Ti質粒上的T-DNA可轉移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的DNA上。（三）將目的基因導入植物受體細胞三、基因操作的基本步驟目的基因的遺傳特性得以維持穩定和表達⑷優點：⑶過程：目的基因插入Ti質粒的T-DNA上轉入農桿菌導入植物細胞整合到受體細胞染色體上經濟和有效，約80%轉基因植物由此法獲得。三、基因操作的基本步驟a.農桿菌轉化法（三）將目的基因導入植物受體細胞b.基因槍法(微彈轟擊法)將包裹在金屬顆粒（常用鎢粉和金粉粒子）表面的表達載體DNA打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達。

單子葉植物常用的一種基因轉化方法，但成本較高。ⅱ.方法：三、基因操作的基本步驟（三）將目的基因導入植物受體細胞c.花粉管通道法植物花粉萌發后，花粉管穿過花柱直通胚囊。花粉管通道法是在植物受粉后，花粉管愈合前，剪去柱頭，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞。我國科學家獨創，曾用于轉基因抗蟲棉的研發，十分簡便經濟。ⅱ.方法：三、基因操作的基本步驟（三）將目的基因導入植物受體細胞d.顯微注射法顯微注射技術是轉基因動物中采用最多，最為有效的一種將目的基因導入動物細胞的方法。目的基因表達載體取卵(受精卵)受精卵胚胎早期培養顯微注射新性狀動物移植程序：ⅱ.方法：三、基因操作的基本步驟（三）將目的基因導入動物受體細胞e.Ca2+處理⑴微生物特點：⑵常用受體細胞：繁殖快、單細胞、遺傳物質相對較少原核生物，以大腸桿菌應用最為廣泛。ⅱ.方法：⑶操作程序：三、基因操作的基本步驟運載體為質粒，受體細胞為細菌（三）將目的基因導入微生物受體細胞運載體為質粒，受體細胞為細菌受體細胞：細菌細胞壁的通透性增大重組質粒進入受體細胞目的基因隨受體細胞的繁殖而復制氯化鈣大量的目的基因不能，受體細胞必須表現出特定的性狀，才能說明目的基因完成了表達。受體細胞攝入DNA分子后就說明目的基因完成表達嗎？三、基因操作的基本步驟⑶程序：（三）將目的基因導入微生物受體細胞(四)目的基因的檢測與鑒定ⅰ.檢測ⅱ.鑒定:①轉基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因②目的基因是否轉錄出了mRNA③目的基因是否翻譯成蛋白質抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法——方法——方法——DNA分子雜交分子雜交抗原抗體