第三章

細胞生物學研討方法METHODSANDTECHNIQUES本章內容提要第一節顯微技術一、光學顯微鏡二、電子顯微鏡三、顯微操作技術第二節生物化學與分子生物學技術第三節細胞分別技術第四節細胞培育與細胞雜交第一節顯微技術光學顯微鏡：以可見光〔或紫外線〕為光源。電子顯微鏡：以電子束為光源。—、光學顯微鏡1.構成：①照明系統②光學放大系統③機械安裝2.原理：經物鏡構成倒立實像，經目鏡進一步放大成像。〔一〕普通光學顯微鏡3.分辨力：指分辨物體最小間隔的才干。R=0.61λ/N．A．其中λ為入射光線波長；N．A．為鏡口率＝ｎsinα/2，n=介質折射率；α=鏡口角〔樣品對物鏡鏡口的張角〕。思索：如何提高顯微鏡的分辨才干？表一、幾種介質的折射率顯微鏡的幾個光學特點：制造光學鏡頭所用的玻璃折射率為1.65~1.78，所用介質的折射率越接近玻璃的越好。sinα/2的最大值必然小于1；介質為空氣，鏡口率普通為0.05~0.95；油鏡頭用香柏油為介質，鏡口率可接近1.5。普通光線的波長為400~700nm，分辨力數值不會小于0.2μm，人眼的分辨力為0.2mm,因此顯微鏡的最大設計倍數為1000X。〔二〕熒光顯微鏡Fluorescencemicroscope特點：光源為紫外線，波長較短，分辨力高于普通顯微鏡；有兩個特殊的濾光片；照明方式通常為落射式。Fluorescenceimageofepithelialcell,DNAinblueandMicrotubulesingreen用于察看能激發出熒光的構造。用途：免疫熒光察看、基因定位、疾病診斷。〔三〕激光共聚焦掃描顯微境

Laserconfocalscanningmicroscope,LCSM用激光作光源，逐點、逐行、逐面快速掃描。能顯示細胞樣品的立體構造。分辨力是普通光學顯微鏡的3倍。用途類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，構成立體圖像。laserconfocalscanningmicroscope,LCSMLCSMImageofaXenopusMelanophoremicrotubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)/〔四〕暗視野顯微鏡darkfieldmicroscope聚光鏡中央有擋光片，照明光線不直接進人物鏡，只允許被標本反射和衍射的光線進入物鏡，因此視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。可察看4~200nm的微粒子，分辨率比普通顯微鏡高50倍。把透過標本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種構造間的對比度，使各種構造變得明晰可見。在構造上，相差顯微鏡有不同于普通光學顯微鏡兩個特殊之處。環形光闌〔annulardiaphragm〕：位于光源與聚光器之間。相位板〔annularphaseplate〕：物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。〔五〕相差顯微鏡原理用途：察看未經染色的玻片標本〔六〕偏光顯微鏡polarizingmicroscope用于檢測具有雙折射性的物質，如纖維絲、紡錘體、膠原、染色體等。光源前有偏振片〔起偏器〕，使進入顯微鏡的光線為偏振光，鏡筒中有檢偏器〔與起偏器方向垂直的偏振片〕。載物臺是可以旋轉。淀粉〔七〕微分干涉差顯微鏡Differentialinterferencecontrastmicroscope〔DIC〕1952年，Nomarski發明，利用兩組平面偏振光的干涉，加強影像的明暗效果，能顯示構造的三維立體投影。標本可略厚一點，折射率差別更大，故影像的立體感更強。〔八〕倒置顯微鏡inversemicroscope物鏡與照明系統顛倒，前者在載物臺之下，后者在載物臺之上，用于察看培育的活細胞，通常具有相差物鏡，有的還具有熒光安裝。〔九〕當代顯微鏡的開展趨勢采用組合方式，集普通光鏡加相差、熒光、暗視野、DIC、攝影安裝于一體。自動化與電子化。二、電子顯微鏡〔一〕透射電子顯微鏡transmissionelectronmicroscope,TEM以電子束作光源，電磁場作透鏡。電子束的波長短，并且波長與加速電壓(通常50~120KV)的平方根成反比。由電子照明系統、電磁透鏡成像系統、真空系統、記錄系統、電源系統等5部分構成。分辨力0.2nm，放大倍數可達百萬倍。用于察看超微構造〔ultrastructure〕，即小于0.2μm、光學顯微鏡下無法看清的構造，又稱亞顯微構造〔submicroscopicstructures〕。1.原理透射電子顯微鏡TRANSMISSIONELECTRONMICROSCOPE，TEM表二、不同光線的波長2、制樣技術1〕超薄切片電子束穿透力很弱，用于電鏡察看的標本須制成厚度僅50nm的超薄切片，用超薄切片機〔ultramicrotome〕制造。通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，丙酮逐級脫水，環氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進的方式切片，重金屬〔鈾、鉛〕鹽染色。2〕負染技術用重金屬鹽(如磷鎢酸)對鋪展在載網上的樣品染色；吸去染料，枯燥后，樣品凹陷處鋪了一層重金屬鹽，而凸的出地方沒有染料堆積，從而出現負染效果，分辨力可達1.5nm左右。NegativeStainedActin3〕冰凍蝕刻freeze-etching亦稱冰凍斷裂。標本置于干冰或液氮中冰凍。然后斷開，升溫后，冰升華，暴顯露了斷面構造。向斷裂面上噴涂一層蒸汽碳和鉑。然后將組織溶掉，把碳和鉑的膜剝下來，此膜即為復膜〔replica〕。AYeastCell20世紀60年代問世，用來察看標本外表構造。分辨力為6~10nm，由于人眼的分辨力〔區別熒光屏上間隔最近兩個光點的才干〕為0.2mm，掃描電鏡的有效放大倍率為0.2mm/10nm=20000X。〔二〕掃描電子顯微鏡Scanningelectronmicroscope〔SEM〕任務原理：是用一束極細的電子束掃描樣品，在樣品外表激發出次級電子，次級電子的多少與樣品外表構造有關，次級電子由探測器搜集，信號經放大用來調制熒光屏上電子束的強度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。為了使標本外表發射出次級電子，標本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊下發出次級電子信號。掃描電子顯微鏡原理人類紅細胞酵母人類精子〔三〕掃描隧道顯微鏡

scanningtunnelingmicroscope，STM原理：根據隧道效應而設計，當原子尺度的針尖在不到一個納米的高度上掃描樣品時，此處電子云重疊，外加一電壓〔2mV~2V〕，針尖與樣品之間構成隧道電流。電流強度與針尖和樣品間的間隔有函數關系，將掃描過程中電流的變化轉換為圖像，即可顯示出原子程度的凹凸形狀。分辨率：橫向為0.1~0.2nm，縱向可達0.001nm。用途：三態〔固態、液態和氣態〕物質均可進展察看。掃描隧道顯微鏡原理STMimage,BenzenemoleculesaccumulateatstepedgesonCu三、顯微操作技術

micromanipulationtechnique在倒置顯微鏡下利用顯微操作器進展細胞或早期胚胎操作的一種方法。顯微操作器是用以控制顯微注射針在顯微鏡視野內挪動的機械安裝。顯微操作技術包括細胞核移植、顯微注射、嵌合體技術、胚胎移植以及顯微切割等。細胞核移植技術已有幾十年的歷史，Gordon等人〔1962〕對非洲爪蟾進展核移植獲得勝利。我國著名學者童第周等上個世紀70年代在魚類細胞核移植方面進展了許多任務，并獲得了豐盛成果。顯微操作儀第二節生物化學與分子生物學技術一、細胞化學技術組織化學和細胞化學染色方法〔histochemicalandcytochemicalstainingmethod〕用于對某些細胞成分進展定性和定位研討。〔一〕固定物理固定：血膜空氣快速枯燥、冷凍枯燥。化學固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和鋨酸等試劑。顯示多糖常用乙醇固定，顯示酶類多用甲醛丙酮緩沖液固定。〔二〕顯示方法金屬沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反響產物最終生成CoS或PbS有色沉淀，而顯示出酶活性。Schiff反響：細胞中的醛基可使Schiff試劑中的無色品紅變為紅色。用于顯示糖和脫氧核糖核酸〔Feulgen反響〕。聯苯胺反響：過氧化酶分解H202。產生新生氧，后者再將無色聯苯胺氧化成聯苯胺藍，進而變成棕色化合物。脂溶染色法：借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色。茚三酮反響：顯示蛋白質。二、免疫細胞化學immunocytochemistry根據免疫學原理，利用抗體同特定抗原專注結合，對抗原進展定位測定的技術。常用的標志物有熒光素和酶。免疫熒光法〔immunofluorescenttechnique〕：常用的螢光素有異硫氰酸熒光素、羅丹明等。酶標免疫法〔enzyme-labeledantibodymethod〕：常用的酶有辣根過氧化物酶，酶與底物發生反響后構成不透明的堆積物，從而顯示出抗原存在的部位。三、顯微光譜分析技術細胞中有一些成分具有特定的吸收光譜，核酸、蛋白質、細胞色素、維生素等都有本人特征性的吸收曲線。可利用顯微分光光度計對某些成分進展定位、定性和定量測定。四、放射自顯影術用于研討標志化合物在機體、組織和細胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機理、作用部位等等。原理：將放射性同位素標志的化合物導入生物體內，經過一段時間后，制取切片，涂上鹵化銀乳膠，經放射性曝光，使乳膠感光。普通用14C和3H標志。常用3H-TDR來顯示DNA，用3H-UDR顯示RNA；用3H氨基酸研討蛋白質，用3H甘露糖、3H巖藻糖研討多糖。14C半衰期為5730年，3H為12.5年。五、分子雜交技術具有互補核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當條件下，經過氫鍵結合，構成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA雜交的雙鏈分子。這種技術可用來測定單鏈分子核苷酸序列間能否具有互補關系。〔一〕原位雜交〔insituhybridization〕。用于檢測染色體上的特殊DNA序列。最初是運用帶放射性的DNA探針，后來又發明了免疫探針法。〔二〕Southern雜交是體外分析特異DNA序列的方法，操作時先用限制性內切酶將核DNA或線粒體DNA切成DNA片段，經凝膠電泳分別后，轉移到醋酸纖維薄膜上，再用探針雜交，經過放射自顯影，即可識別出與探針互補的特殊核苷序列。將RNA轉移到薄膜上，用探針雜交，那么稱為Northern雜交。六、PCR技術PCR即：polymerasechainreaction。反響體系：①樣品DNA；②引物〔primer〕，約15-20個核苷酸；③4種dNTP；④TagDNA聚合酶，來自于嗜熱水生菌Thermusaquaticus，最適作用溫度75~80℃，短時間在95℃下不失活。⑤緩沖體系和Mg2+。反響過程：①變性：約90-95℃；②復性：約60℃左右；③延伸：70-75℃；④反復“變性——復性——延伸〞過程20-30次循環。PCR原理第三節細胞分別技術一、離心技術是分別細胞器〔如細胞核、線粒體、高爾基體〕及各種大分子根本手段。轉速為10~25kr/min的離心機稱為高速離心機。轉速>25kr/min，離心力>89Kｇ者稱為超速離心機。目前超速離心機的最高轉速可達100000r/min，離心力超越500Kg。〔一〕差速離心Differentialcentrifugation特點：介質密度均一；速度由低向高，逐級離心。用途：分別大小相差懸殊的細胞和細胞器。沉降順序：核——線粒體——溶酶體與過氧化物酶體——內質網與高基體——核蛋白體。可將細胞器初步分別，常需進一步經過密度梯離心再行分別純化。LowspeedHighspeedDifferentialcentrifugation〔二〕密度梯度離心用介質在離心管內構成一延續或不延續的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質的頂部，經過離心力場的作用使細胞分層、分別。類型：速度沉降、等密度沉降。常用介質：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。分別活細胞的介質要求：1〕能產生密度梯度，且密度高時，粘度不高；2〕PH中性或易調為中性；3〕濃度大時浸透壓不大；4〕對細胞無毒。1、速度沉降velocitysedimentation用途：分別密度相近而大小不等的細胞或細胞器。特點：介質密度較低，介質的最大密度應小于被分別生物顆粒的最小密度。原理：介質密度梯度平緩，分別物按各自的沉降系數以不同的速度沉降而到達分別。2.等密度沉降isopycnicsedimentation用途：分別密度不等的顆粒。特點：介質密度較高，陡度大，介質的最高密度應大于被分別組分的最大密度。所需的力場通常比速率沉降法大10~100倍，往往需求高速或超速離心。原理：樣品各成分在延續梯度的介質中經過一定時間的離心那么沉降到與本身密度相等的介質處，并停留在那里到達平衡，從而將不同密度的成分分別。Velocity(A)andEquilibrium(B)sedimentation二、流式細胞術用途：對單個細胞進展快速定量分析與分選的一門技術。原理：包在鞘液中的細胞經過高頻振蕩控制的噴嘴，構成包含單個細胞的液滴，在激光束的照射下，這些細胞發出散射光和熒光，經探測器檢測，轉換為電信號，送入計算機處置，輸出統計結果，并可根據這些性質分選出高純度的細胞亞群，分別純度可達99%。包被細胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細胞計〔flowcytometer〕。三、細胞電泳原理：在一定PH值下細胞外表帶有凈的正或負電荷，能在外加電場的作用下發生泳動。各種細胞或處于不同生理形狀的同種細胞荷電量有所不同，故在一定的電場中的泳動速度不同。用途：檢測細胞生理形狀和病理形狀、分別不同種類的細胞，如分別哺乳動物的XY精子。第四節細胞培育與細胞雜交一、細胞培育〔一〕動物細胞培育群體培育〔massculture〕：將含有一定數量細胞的懸液置于培育瓶中，讓細胞貼壁生長，集合〔confluence〕后構成均勻的單細胞層；克隆培育〔clonalculture〕：培育高度稀釋的細胞懸液，細胞貼壁生長，每一個細胞構成一個細胞集落，稱為克隆。轉鼓培育法：為制取細胞產品而設計，大容量旋轉培育，使培育的細胞一直處于懸浮形狀之中。原代培育〔primaryculture〕：即：培育直接來自動物機體的細胞群，將細胞從一個培育瓶轉移到另外一個培育瓶稱為傳代或傳代培育〔Passage〕。細胞株〔cellstrain〕：從原代培育細胞群中挑選出的具有特定性質或標志的細胞群。細胞系〔cellline〕：從腫瘤組織培育建立的細胞群或培育過程中發生突變或轉化的細胞，可無限繁衍。克隆〔clone〕：亦稱無性系。指由同一個祖先細胞經過有絲分裂產生的遺傳性狀一致的細胞群。表三、實驗室中常用的幾種細胞系細胞系名稱細胞類型來源3T3成纖維細胞小鼠HeLa宮頸癌上皮細胞HenriettaLacks

BHK21成纖維細胞敘利亞倉鼠Pt