吸光光度法第10章物質對光的選擇性吸收，朗伯－比爾定律的意義、有關計算和應用，顯色條件的選擇，吸光光度分析儀器及其測量條件的選擇，吸收曲線與工作曲線的繪制、作用，吸光光度法的應用，示差光度法的原理。教學重點第1節物質對光的選擇性吸收和光吸收的根本定律一、光的根本性質吸光光度法

是基于被測物質的分子

對光

具有選擇吸收的特性而建立的分析方法。光的電磁波性質

射線x射線紫外光紅外光微波無線電波10-2nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105cm可見光400-750nm光的波粒二象性波動性粒子性

E光的折射光的衍射光的偏振光的干預光電效應E：光子的能量〔J,焦耳〕：光子的頻率〔Hz,赫茲〕：光子的波長〔cm〕c：光速〔2.99791010cm.s-1〕h：Plank常數〔6.625610-34J.s焦耳.秒〕二、可見光與溶液的顏色〔物質對光的吸收〕物質的顏色與光的關系完全吸收完全透過吸收黃色光光譜示意表觀現象示意復合光單色光、復合光、光的互補單色光復合光光的互補單一波長的光由不同波長的光組合而成的光假設兩種不同顏色的單色光按一定的強度比例混合得到白光，那么就稱這兩種單色光為互補色光，這種現象稱為光的互補。藍黃紫紅綠紫黃綠綠藍橙紅藍綠物質吸收光的本質光作用于物質時，物質吸收了可見光，而顯示出特征的顏色，這一過程與物質的性質及光的性質有關。物質對光的吸收物質對光的吸收滿足Plank條件h

S2S1S0S3E2E0E1E3h

h

h

透光度〔透射比〕定義：T取值為0.0%~100.0%全部吸收T=0.0%全部透射T=100.0%入射光I0透射光ItIrIa一束平行單色光通過任何均勻、非散射的固體、液體或氣體介質I0=Ia+It+Ir

I0=Ia+It

三、光吸收的根本定律——朗伯—比耳定律〔Lambert-beer’slaw〕朗伯—比耳定律

Lambert–BeerLawI0dbbItII-dIdI∝NIN：薄層中的吸光粒子數N=N0cdSdbN0

：阿伏加德羅常數

dS：捕獲面積，薄層中被光照射的面積。c：吸光溶液的濃度N=k′

cdb故

dI∝NI=Ik′cdbdI=-Ik

cdb,dI/I=-k

cdb積分得或得吸光度A與透光度TAbsorbanceandtransmittanceT：透光率A：吸光度1.00.50ACA100500T%TT=0.0%A=∞T=100.0%A=0.0A=0.434T=36.8%吸光系數和摩爾吸光系數b

：吸光層的厚度，光程，cmc：吸光物質的濃度，g/L,mol/LK：比例常數入射光波長物質的性質溫度取值與濃度的單位相關c：mol/LK

摩爾吸光系數，L·

mol–1·

cm-1c：g/LK

a吸光系數，L·

g–1·

cm-1c：g/100mLK

比吸光系數相互關系MolarAbsorptivityAbsorptivitySpecificextinctioncoefficient吸光系數a比吸光系數桑德爾〔Sandell〕靈敏度SS值表示光程〔pathlenth)為1cm吸收池測得吸光度為0.001時，每mL溶液中待測物質的微克數。單位為g．cm-2。Sandell靈敏度與的關系摩爾吸光系數

靈敏度靈敏度吸光度的加合性

多組分體系中，如果各組分之間無相互作用，其吸光度具有加合性，即第2節吸光光度計及吸收光譜

一、光度分析法的幾種類型1、目視比色法標準系列（色階）未知樣品特點利用自然光比較吸收光的互補色光準確度低〔半定量〕不可分辨多組分方法簡便，靈敏度高2、光電比色法3、分光光度法〔紫外-可見分光光度法〕UV-VISUltravioletVisualSpectroscopy0.575光源單色器吸收池檢測器顯示I0It參比樣品入射光I0透射光It請注意與定義比較未考慮吸收池和溶劑對光子的作用二、分光光度計及其根本部件紫外-可見分光光度計組件光源單色器吸收池比色皿檢測器信號輸出氫燈，氘燈，185~350nm；鹵鎢燈，250~2000nm.根本要求：光源強，能量分布均勻，穩定作用：將復合光色散成單色光棱鏡光柵玻璃，350~2500nm,石英，185~4500nm平面透射光柵，反射光柵玻璃，光學玻璃，石英作用：將光信號轉換為電信號，并放大光電管，光電倍增管，光電二極管，光導攝像管〔多道分析器〕表頭、記錄儀、屏幕、數字顯示0.5cm、1cm、2cm、3cm單波長單光束分光光度計0.575光源單色器吸收池檢測器顯示單波長雙光束分光光度計差值光源單色器吸收池檢測器顯示切光器721型分光光度計儀器結構示意圖1722型分光光度計吸收光譜〔光吸收曲線〕測量某物質對不同波長單色光的吸收程度，以波長〔〕為橫坐標，吸光度〔A〕為縱坐標，繪制吸光度隨波長的變化可得一曲線，此曲線即為吸收光譜。(a)(b)(c)(d)220240260280

nm

A0000(a)聯苯〔己烷溶劑〕；一些典型的紫外光譜(b)苯〔己烷溶劑〕；(c)苯蒸汽；(d)Na蒸汽。吸收光譜的討論：〔1〕同一種物質對不同波長光的吸光度不同。吸光度最大處對應的波長稱為最大吸收波長λmax〔2〕不同濃度的同一種物質，其吸收曲線形狀相似λmax不變。而對于不同物質，它們的吸收曲線形狀和λmax那么不同。ABA

A

C增大〔3〕吸收曲線可以提供物質的結構信息，并作為物質定性分析的依據之一?！?〕在λmax處吸光度隨濃度變化的幅度最大，所以測定最靈敏。吸收曲線是定量分析中選擇入射光波長的重要依據?！?〕不同濃度的同一種物質，在某一定波長下吸光度A有差異，在λmax處吸光度A的差異最大。此特性可作為物質定量分析的依據。吸收定律與吸收光譜的關系AC吸收定律A或

吸收光譜A

C

max第3節顯色反響及其影響因素顯色反響：在光度分析中，將無色或淺色的待測組分轉變為有色離子或絡合物的反響有機物質官能團強吸收直接測定UV-VIS官能團弱吸收衍生化反響UV-VIS顯色反應無機物質通常通過顯色反響生成吸光系數大的有色物質進行測定，以提高靈敏度332+桔紅色

max鄰二氮菲顯色劑：與被測組分生成有色化合物的試劑

1、對顯色反響的要求1、顯色反響的靈敏度要高，其摩爾吸收系數應比較大。2、顯色反響的選擇性要高3、有色化合物的組成要恒定，化學性質要穩定4、比照度要大，即有色化合物與顯色劑之間的顏色差異應盡可能大。一般要求有色化合物與顯色劑的最大吸收波長之差應大于60nm。5、顯色過程要易于控制。重現性2、顯色劑無機顯色劑有機顯色劑a.磺基水楊酸屬于OO型螯合劑，主要用于測定Fe3+

酸度不同，絡合物配比不同，顏色也不同b.丁二酮肟屬于NN型螯合劑，主要用于測定Ni2+

形成紅色絡合物c.1,10-鄰二氮菲屬于NN型螯合劑，主要用于測定Fe2+

形成橘紅色絡合物e.偶氮胂Ⅲ〔鈾試劑Ⅲ〕屬于偶氮類螯合劑，主要用于測定Th(Ⅳ)、Zr(Ⅳ)、U(Ⅳ)等d.二苯硫腙屬于含S顯色劑，主要是萃取光度法測定Cu2+、Pb2+、Zn2+、Cd2+、Hg2+等的試劑f.鉻天青S

屬于三苯甲烷類螯合顯色劑，主要用于測定Al3+g.結晶紫屬于三苯甲烷類堿性染料，主要用于測定Tl3+混配化合物由一種金屬離子與兩種不同配體通過共價鍵結合成的三元絡合物3、多元絡合物b.離子締合物金屬離子先與配體形成絡陰離子或絡陽離子，再與帶反電荷的離子生成離子締合物由三種或三種以上的組分所形成的絡合物，目前應用較多的是三元絡合物c.金屬離子-配體-外表活性劑體系二、影響顯色反響的因素1、反響體系的酸度2、顯色劑的用量3、顯色反響時間4、顯色反響溫度5、溶劑6、溶液中共存離子的影響1、酸度的選擇酸度的影響影響顯色劑的平衡濃度和顏色

M+nR=MRnOH-H+影響被測組分的存在狀態

RH

=R-+H+

1

2影響絡合物的組成

例，磺基水楊酸–Fe3+pH=1.8~2.5FeR紫紅色pH=4~8FeR2棕褐色pH=8~11.5FeR3黃色酸度的選擇理論計算以作圖可得適宜pH范圍實際工作中，作A~pH曲線，尋找適宜pH范圍。ApHM+nR=MRnOH-H+2、顯色劑的用量M+nR=MRn定量反響實際工作中，作A~CR

曲線，尋找適宜CR范圍。ACR3、溫度的選擇實際工作中，作A~T曲線，尋找適宜反響溫度。ATATATATAT4、反響時間的選擇實際工作中，作A~t曲線，尋找適宜反響時間。5．溶劑提高靈敏度、反響速率，影響溶解度、組成6．溶液中共存離子的影響第4節吸光光度分析及誤差控制測量波長的選擇無干擾，選擇

max有干“吸收最大，干擾最小〞的原那么擾，A

A

待測溶液吸光度的選擇控制A=0.2~0.8方法選擇c選擇b1、非單色光影響小2、靈敏度高一、測量條件的選擇參比液的選擇原那么：扣除非待測組分的吸收以顯色反響為例進行討論M+R=M-R

max試液 顯色劑溶劑吸光物質參比液名稱及組成無吸收無吸收光學透明溶劑參比溶劑基質吸收無吸收

吸收試液參比不加顯色劑的試液無吸收吸收

吸收試劑參比不加試液的溶液基質吸收吸收吸收吸收退色參比顯色劑+試液+

待測組分的掩蔽劑假設欲測M-R的吸收

maxA〔樣〕=A〔待測吸光物質〕+A〔干擾〕+A〔池〕A〔參比〕=A〔干擾〕+A〔池〕目的：消除由于吸收池壁及溶劑、試劑對入射光的反射和吸收帶來的誤差，并可扣除干擾的影響二、吸光光度分析的方法微量組分的分析單組分的測定純物質或共存物質不干擾1、標準比較法A=εbcsA=εbcx2、標準曲線法〔工作曲線法〕橫坐標：標準溶液的濃度〔參加體積〕ACs縱坐標：相應的吸光度cs與cx相近多組分的測定解聯立方程法A

XY

1

2根據加合性原那么解聯立方程，可求得Cx,Cy

為物質的特征參數，可通過配制標準溶液測得。ACs(x)三、對朗伯-比耳定律的偏離主要原因非單色光吸光質點的相互作用負誤差正誤差介質不均勻引起的偏離1、非單色光引起的對吸光定律的偏離對吸收光譜而言，b和c固定，反映了

隨波長變化的情況，單一波長，

固定；不同波長，

不同。因此，非單色光將導致對吸光定律的偏離。A或

12在實際工作中，入射光通常具有一定的帶通。為了防止非單色光帶來的影響，一般選用峰值波長進行測定。1對應的

1較小2對應的

2較大選用峰值波長，也可以得到較高的靈敏度。2、吸光質點間相互作用引起的對吸光定律的偏離質點間的靜電作用質點間的締合作用質點間的化學反響例，聚合引起的對吸光定律的偏離單體：2

max=660nm二聚體：

max=610nmAC

max=660nmA

660nm610nm化學反響的影響M+L=ML

max吸光定律光度法測定通常在一個較大的濃度范圍內作工作曲線，當′或隨著濃度的變化而變化，或隨著副反響的變化而變化時，就表現出對吸光定律的偏離。實際計算四、消除干擾的方法

1、控制溶液酸度2、參加掩蔽劑3、改變干擾離子的價態4、利用參比溶液消除顯色劑和某些共存有色離子的干擾6、選擇適當的波長7、別離干擾離子5、增加顯色劑用量五、吸光度測量的誤差吸光度標尺刻度是不均勻的光度計中透光度的標尺刻度是均勻的透光度讀數誤差△T約為±0．01A=εbcdA=εbdcdc為測量結果c的測量誤差dA為測量吸光度A時的測量誤差A=－lgT=－0.434lnTT在15%-65％〔吸光度A在之間〕，測量的相對誤差較小。T=36.8％或A=0.434時，測量結果的相對誤差最小。第5節其他吸光光度法高濃度示差吸光光度法1、根本原理常規法以空白溶劑為參比示差法以濃度為Cs的標準溶液為參比A△C△CxA′〔Cx>Cs〕適宜高

濃度的測定思考：（Cx

Cs）時情況怎樣？2、示差法的誤差方法定量原理相對誤差常規法示差法∴Tr>Tx∵I0>Is有結論：示差法提高了準確度例題例題dT=0.01,樣品Tx=2.00%,標準Ts=10.0%示差法常規法誤差示差法誤差示差法提高準確度的實質常規法TxT051050100

落在測量誤差較大的范圍高濃度示差法T051050100TrTsTs

落在測量誤差較小的范圍示差法通過改變儀器的定位使透射率的刻度標尺讀數擴展示差法通過提高測量的準確度提高了方法的準確度結論：雙波長分光光度法光源單色器單色器檢測器切光器狹縫吸收池

不需空白溶液作參比；但需要兩個單色器獲得兩束單色光(λ1和λ2)；以參比波長λ2處的吸光度Aλ2作為參比，來消除干擾。在分析渾濁或背景吸收較大的復雜試樣時顯示出很大的優越性。靈敏度、選擇性、測量精密度等方面都比單波長法有所提高。

雙波長分光光度法21A

XY∵∴Y

的存在不干擾

X的測定

因只用一個吸收池，而且以試液本身對某一波長的光的吸光度為參比，因此，消除了因試液與參比液及兩個吸收池之間的差異所引起的測量誤差，提高了測量的準確度。選擇波長組合λ1、λ2的根本要求：1、選定的波長λ1和λ2處干擾組分應具有相同吸光度，即：ΔAy=ΔAyλ2－ΔAyλ1=0故：ΔAx+y=ΔAx=(εxλ2－εxλ1)bcx此時：測得的吸光度差ΔA只與待測組分x的濃度呈線性關系，而與干擾組分y無關。假設x為干擾組分，那么也可用同樣的方法測定y組分。

可采用作圖法選擇符合上述兩個條件的波長組合。2、在選定的兩個波長λ1和λ2處待測組分的吸光度應具有足夠大的差值。導數分光光度法

在雙波長分光光度計上，如果使用的兩個波長很接近，進行同時掃描，并保持兩波長差不變，便可獲得一階導數光譜。導數光譜：吸光度隨波長變化率對波長的曲線n階導數1、能夠分辨兩個或兩個以上嚴重重疊的吸收峰

2、能夠分辨吸光度隨波長急劇上升處所掩蓋的弱吸收峰

3、能夠確認寬闊吸收帶的最大吸收波長

導數光譜譜帶比原吸收光譜窄，減少了與干擾譜帶交迭的可能性，提高了抗干擾能力。導數光譜可去除背景干擾，提高分別率。

導數分光光度法在多組分同時測定、渾濁樣品分析、消除背景干擾、加強光譜的精細結構以及復雜光譜的辨析等方面，顯示了很大的優越性。導數分光光度法定量分析的理論根底：1、峰-谷法2、基線法3、峰-零法測量導數光譜峰值的方法：第六節吸光光度法的應用一、痕量金屬分析二、臨床分析三、食品分析(酶聯免疫法)四、其他應用弱酸和弱堿解離常數的測定

設某波長下，HB和B-都有吸收，b=1cm，根據吸光度的加和性：在高酸度時，弱酸幾乎以HB形式存在：在強堿性時，弱酸幾乎以B-形式存在：∴

絡合物的組成的測定摩爾比法測絡合比〔飽和法〕M+nR=MRnCM,固定；CR,從0開始增大在特定波長測定

R=0,

M=0,

MRn>0ACR/CMn

R>0,

M>0,

MRn=0ACR/CMn等摩爾連續變化法〔Job〕測絡合比M+nR=MRnCM+CR=常數CM/C從0→1在特定波長測定

R=0,

M=0,

MRn>000.51.0ACM/C0.33n=1,CM/C=0.5n=2,CM/C=0.3300.51.0ACM/C

R>0,

M>0,

MRn=0填空1、苯酚在水溶液中摩爾吸收系數ε為6.17×103moL/L，假設要求使用1cm吸收池時的透光度為0.15～0.65，那么苯酚的濃度應控制在2、多組分分光光度法可用解聯立方程的方法求得各組分的含量，這是基于3、在紫外可見分光光度計中，在可見光區使用的光源是燈；用的棱鏡和比色皿的材質可以是；而在紫外光區使用的光源是