生物化學實驗上饒師范學院生物科學實驗教學中心目錄1.生物化學實驗室規那么2.生物化學實驗根本操作3.實驗一3,5——二硝基水楊酸比色定糖法4.實驗二血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳5.實驗三總氮量的測定——微量凱氏〔Micro-Kjeldahl〕定氮法上饒師范學院生物科學實驗教學中心

6.實驗四脂肪碘值的測定7.實驗五維生素C的定量測定8.實驗六小麥萌生前后淀粉酶活力的比較9.實驗七組織DNA的提取純化10.實驗八酪蛋白的制備上饒師范學院生物科學實驗教學中心生物化學實驗室規那么〔2課時〕1每個同窗都應該自覺遵守課堂紀律，維護課堂次序，不遲到，不早退，不大聲談笑。2實驗前必需仔細預習，熟習本次實驗的目的、原理、操作步驟，懂得每一操作步驟的意義和了解所用儀器的運用方法，否那么不能開場實驗。3實驗過程中要聽從教員的指點，嚴肅仔細地按操作規程進展實驗，并把實驗結果和數據及時、照實記錄在實驗記錄本上，文字要簡練、準確。完成實驗后經教師檢查簽字贊同，方可分開實驗實。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

4實驗臺面應隨時堅持整潔，儀器、藥品擺放整齊。公用試劑用畢，應立刻蓋嚴放回原處。勿使試劑、藥品灑在實驗臺面和地上。實驗終了，儀器洗凈放好，將實驗臺面抹拭干凈，才干分開實驗室。5運用儀器、藥品、試劑和各種物品必需留意節約。洗滌和運用儀器時，應小心仔細，防止損壞儀器。運用貴重精細儀器時，應嚴厲遵守操作規程，發現缺點須立刻報告教師，不得擅自動手檢修。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

6實驗室內嚴禁吸煙！留意水電平安，分開實驗室前，必需關好水龍頭，拉下電閘，嚴防發惹事故！7廢液倒入專門的廢液桶，固體廢物和帶殘渣的廢物不得倒入水槽或四處亂扔。8儀器損壞時，應照實向教師報告，并填寫損壞儀器登記表，然后補領。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

9實驗室內一切物品，未經本室擔任教師同意，嚴禁攜出室外，借物必需辦理登記手續。10每次實驗課由班長擔任安排值日生。值日生的職責是擔任當天實驗室的平安、衛生和一切效力性的任務。上饒師范學院生物科學實驗教學中心生物化學實驗根本操作〔2課時〕一.玻璃儀器的洗滌在生化實驗中，玻璃儀器干凈與否，是獲得準確結果的重要環節。干凈的玻璃儀器內壁應十清楚亮光潔，無水珠附著在玻壁上。㈠常用的洗滌方法：1.普通儀器，如燒杯、試管等可用毛刷蘸肥皂液、合成洗滌劑仔細刷洗。然后用自來水反復沖洗，最后用少量蒸餾水沖洗2~3次，倒置在器皿架上晾干或置于烘箱烤干備用。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

2.容量分析儀器如吸量管、容量瓶、滴定管等，不能用毛刷刷洗。用后應及時用自來水多次沖洗，細心檢查干凈程度，根據掛不掛水珠采取不同處置方法。〔1〕如不掛水珠，用蒸餾水沖洗、枯燥，方法同上；〔2〕如掛水珠，那么應瀝干后用重鉻酸鉀洗液浸泡4~6小時，然后按上法順序操作，即先用自來水沖洗，再用蒸餾水沖洗，最后枯燥。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

3.粘附有血漿的刻度吸量管等，有三種洗滌方法：〔1〕先用45%尿素溶液浸泡，使血漿蛋白溶解，然后用自來水沖洗；〔2〕也可用1%氨水浸泡，使血漿溶解，然后再依次用1%稀鹽酸溶液、自來水沖洗；〔3〕以上二法如達不到清潔要求，可浸泡于重鉻酸鉀洗液4~6小時，再用大量自來水沖洗，最后用蒸餾水沖洗2~3次。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

4.新購置的玻璃儀器，應先置于1~2%稀鹽酸溶液中浸泡2~6小時，除去附著的游離堿，再用自來水沖洗干凈，最后用蒸餾水沖洗2~3次。5.凡用過的玻璃儀器，均應立刻洗滌，久置干涸后洗滌非常困難。如不能及時洗滌，先用流水初步沖洗后浸泡在清水中，待后按常規處置。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

㈡運用重鉻酸鉀洗液〔以下簡稱洗液〕時應留意以下幾點：1.需用洗液浸泡的容器，在浸泡前應盡量瀝干。否那么會因洗液被稀釋而降低洗液的氧化力。2.Hg2+、Ba2+、Pb2+等離子可與洗液發生化學反響，生成不溶性化合物堆積在容器壁上。因此，凡接觸過上述離子的容器，應先除去上述離子〔可用稀硝酸或5~10%EDTA鈉去除〕。3.油類、有機溶劑等有機化合物可使洗液復原失效。因此，容器壁上附有大量油類、有機物時，應先除去。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

4.洗液的酸性和氧化性很強，運用時應格外留意，千萬不要滴落在皮膚或衣物上，以免灼傷或燒壞。5.洗液顏色由深棕色變為綠色時，闡明洗液曾經失效，應停頓運用，改換新液。因重鉻酸變成硫酸鉻后不再具有氧化性。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

重鉻酸鉀洗液的配制:取重鉻酸鉀20g溶于20ml蒸餾水中，加熱至沸。冷卻后再將200ml濃硫酸漸漸參與，邊加邊攪拌。留意：此時可產生高熱。為防止容器破裂，應選用耐酸搪瓷缸或耐高溫的玻璃器皿，切忌用量筒及試劑瓶等配制。為防止洗液吸收空氣中的水分而被稀釋蛻變，洗液應儲存于帶蓋的容器中。當清潔效能降低時，再參與少量重鉻酸鉀及濃硫酸就可繼續運用。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

二.吸量管的運用吸量管和定量吸(移)液器(微量加樣器)均為用來轉移一定體積溶液的量器。㈠吸量管：生化實驗中常用的有三種，最常用的是刻度吸量管。1.刻度吸量管：⑴刻度吸量管的種類：上饒師范學院生物科學實驗教學中心

①按容量規格來分，有0.1、0.2、0.25、0.5、1、2、5、10ml等數種。其精細度按不同的容積可達移取量的0.1~1%。通常將管身標明的總容量分刻為100等分。因此，10ml的吸量管一格代表0.1ml；1ml的吸量管一格代表0.01ml,其他類推。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

②按“零〞點位置來分，有“O〞點在吸量管上端的〔即讀數從上而下逐漸增大〕，也有“O〞點在吸量管下端的〔讀數從下而上逐漸增大)。兩種標示方法，在運用時各有方便之處。③按刻度方法來分，刻度吸量管也有兩種，一種是刻度刻到尖端的，將液體放出時，應吹出殘留在吸量管尖端的少量液體(我實驗室的刻度吸量管全部是這一種)，另一種是刻度不刻到尖端的。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

⑵刻度吸量管的正確運用方法：用右手拇指和中指夾住管身，將吸量管的尖端伸入試液深處，左手持洗耳球把試液吸入管內至高過刻度以上時，迅速用右手食指按住吸量管的上口，以控制試液的泄放。吸液后應盡量使吸量管堅持垂直，使右眼與刻度等高，略微輕抬食指或悄然轉動吸量管，使試液面緩慢降落，至管內試液彎月面的最低點與吸量管的刻度線相齊為止。然后將吸量管插到需加試劑的容器中，讓尖端與容器內壁靠緊，松開食指讓液體流出。液體流完后再等15秒鐘，捻動一下吸量管后移去〔如需吹的吸量管，那么吹出尖端的液體后再捻轉一下吸量管移去〕。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

⑶運用刻度吸量管的本卷須知：①選擇適當規格的吸量管：吸量管的最大容積應等于或略大于所需容積〔ml數〕。②仔細看清吸量管的刻度情況：刻度能否包括吸量管尖端的液體？讀數方向是從上而下，還是從下而上？③拿吸量管時，刻度一定要面向本人，以便讀數。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

④汲取試劑時應留意三點：一是先吹去吸量管內能夠存在的殘留液體，二是將吸量管插入試劑液面深部(以免吸液過程中因液面降低而吸入空氣產生氣泡或管內試劑進入洗耳球)，三是運用洗耳球(不可直接用口吸)。⑤按吸量管上口時應該用食指，不能用拇指。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

⑥汲取粘滯性大的液體(如血液、血漿、血清等)時，除選用適宜的吸管(奧氏管)外，應留意拭凈管尖附著的液體，盡量減慢放液速度(用食指壓力控制)，待液體流盡后吹出管尖殘留的最后一滴液體。⑦運用的吸量管應干凈、枯燥無水。如急用而又有水時，可用少量欲取試劑沖洗3次，以免試劑被稀釋。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

2.移液吸量管：也有兩種，常見的一種是吸量管的上端只需一個刻度，另一種是除了在吸量管上端有刻度外，在吸量管下端狹窄處也有一刻度線。無論哪一種，在運用時將量取的液體放出后，只需將吸量管的尖端觸及受器壁約半分鐘即可，不得吹出尖端的液體。3.奧氏吸量管：準確度最高，運用時必需吹出留在尖端的液體。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

㈡定量吸(移)液器(微量加樣器)：定量吸液器是吸量管的革新產品。由塑料制成。目前，因產地廠家不同其質量、價錢差別非常懸殊。1.定量吸液器的優點：運用方便，取、加樣迅速，計量準確，不易破損，能汲取多種樣品〔只換吸嘴即可〕。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

2.定量吸液器的類型：有兩種類型。⑴固定式：只能取加一定容量的試劑，不能隨意調理取加樣量。其規格有10μl、20μl、25μl、30μl、50μl、100μl、200μl、250μl、300μl、400μl、500μl、1000μl等。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

⑵可調式：在一定容量范圍內可根據需求進展調理取加樣量。例如規格為50～200μl的可調式定量吸液器，可以在50到200μl的范圍內根據需求調理成設計允許的各種取加樣容量〔60μl、85μl、110μl、170μl、200μl等〕。普通來講，固定式吸液器比較準確，可調式吸液器運用較為方便。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

3.定量吸液器的運用方法：⑴選擇適當的吸液器。吸液前先把吸嘴套在吸引管上，套上后要悄然旋緊一下，以保證結合嚴密。⑵持法：右手四指〔除大拇指外〕并攏握住吸液器外殼〔使外殼突起部分搭在食指近端〕，大拇指悄然放在吸液器的按鈕上。⑶取樣(吸液)：用大拇指按下按鈕到第一停頓點，以排出一定容量的空氣，隨后把吸嘴尖浸入取樣液內，徐徐松開大拇指，讓按鈕漸漸自行復原，取樣即告完成。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

⑷排液：將吸液器的吸嘴尖置于加樣容器壁上，用大拇指漸漸地將按鈕按下到第一停頓點，停留1秒鐘〔粘性較高的溶液停留時間應適當延伸〕。然后再把按鈕按到第二停頓點上，讓吸嘴沿管壁向上滑動。當吸嘴尖與容器壁或溶液分開時，方可釋放按鈕，使其恢復到初始位置。⑸吸液器用后應及時取下吸嘴。將吸嘴用自來水沖洗后浸入盛水的容器內〔以防干涸〕，待實驗終了后集中仔細清洗。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

三.溶液的混勻㈠混勻的目的：⒈使反響體系內的各種物質分子很好地相互接觸，充分進展反響；⒉使欲稀釋的溶液成為濃度均一的溶液。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

㈡混勻的方法通常有以下幾種：⒈使盛器作離心運動。⒉左手持試管上端，用右手指輕擊試管下半部，使管內溶液作旋轉運動。⒊利用旋渦混合〔振蕩〕器混勻。⒋不得已時可用枯燥清潔的玻璃棒攪勻。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

㈢混勻的本卷須知：⒈防止盛器內的液體濺出或被污染。⒉嚴禁用手指堵塞管口或瓶口震蕩混勻。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

四.離心機的運用離心法是分別沉淀的一種方法。它是利用離心機轉動產生的離心力，使比重較大的物質堆積在管底，以到達與液體分別的目的。因液體在沉淀的上部，故稱清亮的液體部分為上清液。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

電動離心機的運用方法：1.將欲離心的液體，置于離心管或小試管內。并檢查離心管或小試管的大小能否與離心機的套管相匹配。2.取出離心機的全部套管，并檢查套管底部能否鋪有軟墊，有無玻璃碎片或漏孔〔有玻璃碎片必需取出，漏孔應該用蠟封住〕。檢查合格后，將盛有離心液的兩個試管分別放入套管中，然后連套管一同分置于粗天平的兩側，經過往離心管與套管之間滴加水來調理兩邊的分量使之到達平衡。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

3.將已平衡的兩只裝有離心管的套管，分別放入離心機相互對應的兩插孔內。蓋上離心機蓋。翻開電源開關。逐檔扭動旋鈕，緩慢添加離心機轉速，直至所需數值。到達離心所需時間后，將轉速旋鈕逐漸回零，封鎖電源，讓離心機自然停頓轉動后〔不可人為制動〕，取出離心管。上饒師范學院生物科學實驗教學中心實驗一3,5—二硝基水楊酸比色定糖法

〔8課時〕目的和要求1.掌握3,5—二硝基水楊酸比色法定糖的原理及方法。2.用3,5—二硝基水楊酸定糖法測定樣品中的總糖及復原糖。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

實驗原理3,5----二硝基水楊酸與復原糖共熱后被復原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內，復原糖的量和反響液的顏色強度呈現比例關系，利用比色法可測知樣品的含糖量。該方法是半微量測糖法，操作簡便，快速，雜質干擾較小。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

實驗步驟一、葡萄糖規范曲線的繪制取9支大試管，分別按下表順序參與各種試劑：

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將上述各管溶液混勻后，用72型分光光度計〔520nm〕進展比色測定，用空白管溶液調零點，記錄光密度值。以葡萄糖濃度為橫坐標，光密度值為縱坐標繪制出規范曲線。

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二、樣品中總糖和復原糖含量的測定1.樣品中復原糖的提取：準確稱取2g樣品，放入100ml燒杯內，參與85％乙醇50ml，混勻，在50℃恒溫水浴中保溫30min，過濾，濾渣再用85％乙醇提取二次。將濾液合并，蒸去乙醇，加少量水，移入100ml容量瓶中，用水定容，備用。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

2.樣品中總糖的水解及提取：準確稱取樣品1g，放入大試管中，參與1ml6mol/L鹽酸和15ml蒸餾水。混勻，在沸水浴中加熱半小時后，用碘化鉀－碘溶液檢查水解程度，假設已水解完全，那么不呈現藍色。冷卻后參與酚酞指示劑1滴。以10％氫氧化鈉中和至溶液呈微紅色。過濾并定容至100ml。再準確汲取上述溶液10ml，放入100ml容量瓶中，定容，備用。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

3.樣品中含糖量的測定：取7支大試管，分別按下表參與各種試劑：上饒師范學院生物科學實驗教學中心

將各管混勻后，按制造規范曲線時同樣的操作測定各管的光密度，在規范曲線上查出相應的復原糖含量，按下述公式推算出山芋粉內復原糖與總糖的百分含量。

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思索題1.比色測定的操作要點是什么？方法的根本原理是什么？2.72型分光光度計的原理及運用時的本卷須知是什么？3.比色測定時為什么要設計空白管？4.總糖包括哪些化合物？上饒師范學院生物科學實驗教學中心實驗二血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳

〔6課時〕目的和要求1.掌握醋酸薄膜電泳的原理及操作。2.定量測定血清中各種蛋白質的相對百分含量。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

實驗原理采用醋酸纖維薄膜為支持物的電泳方法，叫做醋酸纖維素薄膜電泳。醋酸纖維素，是纖維素的羥基乙酰化所構成的纖維素醋酸酯。將它溶于有機溶劑〔如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等〕后，涂抹成均勻的薄膜那么成為醋酸纖維素薄膜。該膜具有均一的泡沫狀的構造，有強浸透性，厚度約為120μm。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

醋酸纖維素薄膜電泳是近年來推行的一種新技術。它具有微量、快速、簡便、分辨力高、對樣品無拖尾和吸附景象等優點。該技術已廣泛運用于血清蛋白、糖蛋白、脂蛋白、結合球蛋白、同功酶的分別和測定等方面。目前，醋酸纖維薄膜電泳趨向于替代紙電泳。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

實驗步驟一、儀器和薄膜的預備1.醋酸纖維素薄膜的潤濕的選擇：將薄膜小心地放入盛有緩沖液的培育皿內，使它漂浮在液面。假設迅速潤濕，整條薄膜色澤深淺一致，那么闡明薄膜質地均勻；假設潤濕時，薄膜上出現深淺不一的條紋或斑點等，那么為薄厚不勻的薄膜。實驗中應選用質地均勻的薄膜。由于，纖維素薄膜的質量對電泳的結果影響很大。例如，膜厚薄不均可以呵斥區帶歪扭不齊、各區帶界限不情、背景脫色困難、實驗結果難于反復等景象。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

將選用的薄膜用鑷子輕壓，使它全部浸入緩沖液內，待膜完全浸透〔約半小時〕后取出，夾在清潔的濾紙中間，悄然吸去多余的緩沖液，同時分辨出光澤面和無光澤面。2.制造“濾紙橋〞：剪裁盡寸適宜的濾紙條。取雙層附著在電泳槽的支架上，使它的一端與支架的前沿對齊，而另一端浸入電泳槽的緩沖液內。然后，用緩沖液將濾紙全部潤濕并驅除氣泡，使濾紙緊貼在支架上，即為“濾紙橋〞。按照同樣的方法，在另一個電泳槽的支架上制造一樣的“濾紙橋〞。它們的作用是聯絡醋酸纖維素薄膜和兩極緩沖液之間的中間“橋梁〞。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

3.平衡：用平衡安裝〔或自制的平衡管〕，使兩個電泳槽內緩沖液的液面彼此處于程度的形狀。普通需求平衡15～20min。留意，平衡后應將平衡安裝的活塞關好〔或除去平衡管〕。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

二、點樣在薄膜無光澤的一面點樣。點樣區距負極端1.5㎝處。點樣時，先用血色素吸管將2～3微升的血清均勻地涂在點樣器外表，再用點樣器“印〞在薄膜的點樣區內〔見以下圖〕。留意。應使血清均勻分布在點樣區，構成具有一定寬度、精細勻稱的直線，切不可用力過大把薄膜弄破。事先可在濾紙上練習點樣，掌握點樣技術，這是獲得具有明晰區帶的電泳圖譜的重要環節之一。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

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三、電泳將已點樣的薄膜使無光澤面向下貼在電泳槽支架的“濾紙橋〞上，參照以下圖。平衡10min，仔細檢查電泳安裝的線路能否正確，然后,通電。翻開電源開頭，調理電壓和電流強度，先旋動儀器粗調旋鈕，再旋動細調旋鈕。調理到薄膜每厘米寬的電流強度為0.3mA，通電10～15min后，再將電壓和電流強度提高到薄膜每厘米長度電壓為10V左右，薄膜每厘米寬的電流強度為0.4～0.6mA。在電泳過程中，應留意控制電壓和電流強度，防止過高或偏低。待電泳區帶展開約3.5㎝時，那么并閉電源，普統統電時間為60min左右。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

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四、染色電泳終了立刻取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5min。然后，用漂洗液浸洗，每隔10min左右換一次漂洗液，延續改換三次，可使背景顏色脫去。將膜夾在干凈的濾紙中，吸去多余的溶液。操作中，要留意控制染色和漂洗的時間，防止背景過深或某些區帶太淺。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

五、結果判別普通的染色后的薄膜上可顯現清楚的五條區帶。從正極端起，依次為清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

六、透明將染色后漂洗干凈的薄膜用吹風機吹干，再浸入透明液的甲液中，浸泡2min后立刻浸入透明液的乙液中，浸泡1min〔要準確〕，然后迅速取出薄膜，將它緊貼在玻璃板上，不要存留氣泡。大約2～3min內的薄膜完全透明，放置10～15min后，用吹風機將膜吹干。在水籠頭下將玻璃板上透明的薄膜潤濕后，用單面刀片從膜的一角撬起，并劃開一端，再用手捏住撬起的膜悄然撕下，可以容易地從玻璃板上取下透明的薄膜。用濾紙吸干，浸入液體石臘中，約３min后取出。再用干凈的濾紙吸干，壓平，那么成為色澤艷麗而又透明的血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳圖譜，可長期保管不褪色。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

七、定量未經透明處置的血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳圖譜可直接用于定量測定。普通采用洗脫法或光密度計法，測定各蛋白質組分的相對百分含量。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

１．洗脫法：將電泳圖譜的各區帶剪下，分別浸入盛有0.4mol/L氫氧化鈉溶液的試管中，清蛋白管參與4ml，其他每管各加２ml，搖勻，放入37℃恒溫水浴上浸提30min，每隔10min，充分搖動一次，以便將色澤完全洗脫下來。該溶液顏色較穩定，在室溫下24小時內顏色強度無顯著變化。然后在620nm波優點比色，測定各管的光密度值為O.DA、O.Dα1、O.Dα２、O.Dβ、O.Dγ。按以下方法計算血清各部分蛋白質所占百分率。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

〔１〕先計算光密度值總和〔簡寫為Ｔ〕：

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〔２〕再計算血清各部分蛋白質所占百分率〔即相對百分含量〕：上饒師范學院生物科學實驗教學中心

正常值：清蛋白54.0～73.0；α１球蛋白2.8～5.1%；α2球蛋白6.3～0.6%；β球蛋白5.2～1.0%；γ球蛋白12.5～0.0%。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

２．光密度計法：將枯燥的血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳圖譜放入自動掃描光密度儀〔或色譜掃描儀〕內，經過反射〔運用未透明的薄膜時〕或透射〔用已透明的薄膜時〕方式，在記錄器上自動繪出血清蛋白質各組分曲線圖，橫坐標為膜的長度，縱坐標為光密度〔或光強度〕，每一個峰代表一種蛋白質組分。然后，用求積儀丈量出各峰的面積，計算每個峰的面積與它們總面積的百分比就代表血清中各種蛋白質組分的百分含量。或將曲線圖上各峰沿曲線剪下，稱量各峰的分量，計算每個峰的分量與它們總分量的查分比也可以代表血清中各種蛋白質組分的百分含量。在使器具有電子計算機附件的自動掃描光密度儀時，可以由顯示部分或打字帶上獲得血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳圖譜上每條區帶所代表的蛋白質組分的含量。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

思索題指出醋酸纖維素薄膜用作電泳的支持物有何優點？上饒師范學院生物科學實驗教學中心

備注①染色液、漂洗液和透明液應在密封的瓶子內儲存。否那么，易揮發的成分蒸發，使溶液各組分配比發生改動，影響實驗結果。在氣侯溫度較高的季節，更要非常留意，特別是透明液。②電泳時間的長短，應以獲得血清各組分的最正確分別效果為規范。由于，運用不同型號電泳儀進展實驗，有時所需電泳時間差別較大。另外，電泳時產生大量的熱，為了獲得反復性強、區帶明晰的電泳圖譜，應運用冷卻安裝降溫。在炎熱的夏季，更為必要。上饒師范學院生物科學實驗教學中心實驗三總氮量的測定——微量凱氏〔Micro-Kjeldahl〕定氮法

〔8課時〕目的和要求1.學習微量凱氏定氮法的原理。2.掌握微量凱氏定氮法的操作技術，包括規范梳酸銨含氮量的測定、未知樣品的消化蒸餾、滴定及其含氮量的計算等。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

實驗原理天然有機物〔如蛋白質、核酸及氨其酸等〕的含氮量用凱氏定氮法來測定。當天然含氮有機物與濃硫酸共熱時，分解出氮、二氧化碳及水。氮轉變出的氨與硫酸化合生成硫酸銨。分解反響進展得很慢，可參與硫酸銅及硫酸鉀或硫酸鈉促進之，其中硫酸銅為催化劑，硫酸鉀或硫酸鈉可提高消化液的沸點。氧化劑過氧化氫也能加速反響。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

消化完了后，在凱氏定氮儀中參與強堿堿化消化液，使硫酸銨分解，放出氨。用水蒸汽蒸餾法，將氨蒸入過量規范無機酸溶液中，然后用規范堿溶液進展滴定，準確測定氨量，從而折算出含氮量。以甘氨酸為例，該過程的化學反響如下：上饒師范學院生物科學實驗教學中心

測定時常用硼酸溶液搜集氨，氨與溶液中的氫離子結全，生成銨離子，使溶液中氫離子濃離降低。然后再用強酸滴定，直至恢復溶液中原來氫離子濃度為止。所用的強酸的當量數即相當于被測樣品中氨的當量數。本法適用的范圍為0.2-1.0mg氮。相對誤差應小于±2%。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

實驗步驟一、樣品處置血清樣品：取人血或豬血〔蛋白質樣品含水量普通為10%～12%〕，放于離心管中，于冰箱中放置過夜，次日離心除去血凝塊，上層黃色透明清液，即為血清。吸出1ml血清，加到50ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋到刻度，混勻備用。溶液如顯渾濁，加少量氯化鈉，再混勻。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

固體樣品：測定某一固體樣品中的含氮量，是按100克該物質的的干重所含的氮克數來表示〔%〕。因此在定氮前應先將固體樣品中的水分除掉。操作時先將樣品磨細，在稱量瓶中稱入一定量的樣品，再置于105℃的烘箱內烘烤1小時。用坩堝鉗將稱量瓶放入枯燥器內，待降至室溫后稱重。按上述操作，每烘干1小時后反復稱量一次，直至兩次稱量數值不變，即到達恒重為止。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

二、消化預備4個50ml的凱氏燒瓶，并標號，向第1、2號燒瓶內各參與2ml稀釋血清溶液〔或4ml核酸制品溶液，或200mg固體粉末〕。留意，用吸量管直接將溶液〔或用試管參與固體樣品〕加至燒瓶底部，切勿沾于瓶品及瓶頸上。向3、4號燒瓶參與2ml水，作為空白對照，丈量試劑中能夠含有的微量含氮物質，以對樣品進展校正。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

在每個燒瓶中參與約300mg硫酸鉀-硫酸銅混合物，再用量筒參與化學純濃硫酸3ml，將以上4個燒瓶放到消化架上〔見圖4-1〕，〔如無消化架，可將燒瓶放在置于通風櫥內或通風處的電爐上〕進展消化。接好抽氣安裝，調理煤氣量。先用小火焰加熱煮沸，首先看到燒瓶內物質碳化變黑，并產生大量泡沫，此時要特別留意，不能讓黑色物質上升到燒瓶頸部，否那么將嚴重地影響樣品的測定結果。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

當混合物停頓冒泡，蒸汽與二氧化硫也均勻地放出時，將火焰調理到使瓶內液體悄然沸騰。假設在瓶頸上發現有黑色顆粒，應小心地將燒瓶傾斜振搖，用消化液體將它沖洗下來，在消化中要時常轉動燒瓶，使全部樣品都侵泡在硫酸內，以便在微沸的硫酸含中不斷消化，消化液在輕度迥流的情況下大約維持6～8小時〔對于那些賴氨酸含量較高的蛋白質樣品甚至需求12小時〕。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

待消化液變成褐色后，為了加速完成消化，可將燒瓶取下，稍冷，將30%過氧化氫溶液1～2滴，加到瓶底消化液中，再繼續消化，直到消化液由淡黃色變成明晰的淡藍綠色，消化即告完成〔固體樣品約需7小時〕。為了保證反響的徹底完成，再繼續加熱消化1小時。消化結束，封鎖煤氣燈，使燒瓶冷卻室溫。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

三、蒸餾1.儀器的洗滌：儀器應先經普通洗滌，再經水蒸汽洗滌。普通洗滌是先用水洗凈棒狀玻塞〔見以下圖〕周圍，每次實驗后要洗去氫氧化鈉溶液，以防樣品參與時立刻放氨。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

運用前全部蒸餾安裝必需用水蒸汽充分洗滌。用水蒸汽洗滌蒸餾器的目的在于洗去冷凝管中能夠殘留的氨。對于處于運用形狀的儀器〔尤其是正在測定中的儀器〕，加樣前使蒸汽經過1～2min即可，對于較長時間未運用的儀器，必需用水蒸汽洗滌到吸收蒸汽的硼酸-指示劑混合液中指示劑顏色合格為止，洗滌方法如下：上饒師范學院生物科學實驗教學中心

取2～3個50ml的維形瓶，參與5ml左右2%硼酸-指示劑混合液，用外表皿覆蓋備用。先煮沸蒸汽發生器〔見上圖〕，器中盛有用幾滴硫酸酸化過的蒸餾水，并加幾滴甲基紅指示劑蒸餾器中還應放入一些毛細管，它們的長度必需超越液面，也可以用一些玻璃珠或小段橡皮管，它們都有防止爆沸的作用，封鎖夾子9，使蒸汽經過反響室7中的插管10，進入反響室，再由冷凝器11的下端逸出。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

在冷凝器下端放一只空燒杯以接受凝集的水滴。這樣用蒸汽洗滌5min左右后，在冷凝器下口放一個盛有硼酸-指示劑混合液的錐形瓶12，位置如上圖，冷凝器下端應完全浸沒于液體內，繼續用蒸汽洗滌1～2min。察看錐形瓶中溶液能否根本上不變色，假設不變色，那么證明蒸餾器內部洗滌干凈。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

實踐上因指示劑極為靈敏，很難到達完全不變色。含有指示劑的硼酸溶液，紫褐色，即使不接納氨蒸汽，只放在室內的桌面上，幾分鐘后，也能夠會因吸收了空氣中的CO2而變色，因此，在操作過程中應保證硼酸溶液不被其它試劑反污染〔這點很重要〕。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

洗滌較長時間未運用的儀器，用硼酸-指示劑混合液于冷凝管下品接納蒸汽時，假設1～2min后溶液未變成鮮綠色，而只變成灰色或暗綠色，即可以為是根本上未變色，儀器已洗凈。向下挪動錐形瓶，使硼酸液面分開冷凝管口約1，繼續通蒸汽1min，最后用水沖洗冷凝管外口，移開火焰，翻開夾子，可預備樣品測定。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

2.樣品及空白蒸餾：加樣前先撤火1〔熟練后此步可省去，不撤〕，并務必翻開夾子9〔這是本實驗關鍵之一，否那么，樣品會被倒抽到反響器外〕。取下棒狀玻塞6，用吸管汲取2ml消化液，細心地插到反響器小玻杯的棒狀玻玻6的下方。這步必需真實做到，以免加堿后氨立刻揮發逸走，讓反響液流入反響室7中，塞上棒狀玻塞，取1只盛有硼酸-指示劑混合液的錐形瓶，放在冷凝器之下口，冷凝器下口必需在硼酸注面之下〔這是本實驗關鍵的一步〕。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

此錐形瓶在加堿液〔30%氫氧化鈉溶液〕前或者也可以加樣品之前就放在冷凝管下口，并使下口浸入，目的是保證全部吸收氫氧鈉溶液與樣品接觸時放出的氨。用量筒向小玻杯5參與10ml30%氫氨化鈉，加完后，悄然地旋轉著向上提起棒狀玻塞〔小玻杯5極易損壞，提放玻塞時就小心操作〕，使堿液漸漸流入反響室7，在堿液尚未守全流入時，將玻塞蓋緊，向小玻杯5中參與約5ml蒸餾水。再輕提玻塞，使一半蒸餾水流入反響室，另一半留在玻杯中水封。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

蒸餾：用煤氣燈1加熱水蒸汽發生器，沸騰后，夾緊夾子9，開場蒸餾。錐形瓶中硼酸-指示劑混合液吸收氨，由紫色變為綠色，自變色起記時，蒸餾3～5min。挪動錐形瓶，使硼酸液面分開冷凝管口約1，并用少量蒸蒸餾水洗滌冷凝管下口外面，繼續蒸餾1min。拿開錐形瓶，用外表皿覆蓋瓶口。按以上操作再蒸餾二次后，三瓶一同滴定，再進展消化空白液的蒸餾。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

排廢液及洗滌：一次蒸餾終了后，為了排出反響后的廢液，在小玻杯中倒入冷蒸餾水，并加大煤氣燈火焰。待蒸汽很足，反響室外殼7溫度很高〔燙手，這時反響室下方的夾子9是緊閉的〕，反響室中液體沸騰，延續不斷冒泡后，于右手輕提捧狀玻塞，使冷水流入反響室的同時，立刻左手用勁捏橡皮管4，這時因反響室外殼8中的蒸汽比反響室7中的多，遇冷收縮較大，壓力應力降低較多，結果，反響室7廢液經過的反響室中的插管10自動地被抽到反響室外殼中。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

塞住玻塞，取蒸餾水約20ml，參與小玻杯，提起玻塞，冷水再流入反響室，又自動抽出，如此反復幾次即可排盡應廢液及洗滌廢液。假設外殼中已有較多的廢液，可待反響室外殼蒸熱后，右手捏夾子9，放出一些廢液，左手立刻捏一下橡皮管4，積存液即從反響室中排出，這樣左右手交替幾次，也可排出反響室內的液體。如此沖洗3～4次。翻開夾子9，排出反響室外殼中積存的廢液，封鎖夾子9，再用蒸汽經過會套蒸餾儀數分鐘后，繼續下一次蒸餾。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

“樣品〞及“規范〞，因含氨極多，硼酸運用液吸收大量氨蒸汽后，顏色發生明星突變，由暗綠忽然地變為鮮綠色。“空白〞因含氨極少，無明顯的顏色突變。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

3.滴定：全部蒸餾終了后，用0.0100N規范鹽酸溶液滴定各錐形瓶中搜集的氨量，直至硼酸-指示劑混合液由綠色變回淡紫色，即為滴定終點。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

四、計算假設測定的樣品含氮部分是蛋白質〔如血清〕，那么：式中：A為滴定樣品用去鹽酸平均毫升數：B為滴定空白用去鹽酸平均毫升數；C為稱量樣品的克數；0.0100為鹽酸的當量濃度〔實踐上，此項應按實驗中運用鹽酸的實踐濃度填寫〕；14為氮的原子量；6.25為系數〔1ml0.01N鹽酸相當于0.14mg氮〕。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

假設樣品中除有蛋白質外，尚有其他含氮物質，那么樣品蛋白質含量的測定要復雜一些。首先，需向樣品中加氯乙酸，使其最終濃度為5%，然后檢驗定未加三氯乙酸的樣品及參與三氯乙酸后樣品的上清液中的含量氮量，得出非蛋白氮量及總氮量，從而計算出蛋白質⑤，再進一步折算出蛋白質含量。蛋白氮=總氮-非蛋白氮蛋白質含量〔克/%〕=蛋白氮×6.25上饒師范學院生物科學實驗教學中心

思索題1.指出以下試劑的作用：〔1〕消化含氮樣品時運用的濃硫酸、硫酸鉀及硫酸銅粉末。〔2〕蒸餾滴定中的30%氫氧化鈉溶液、2%硼酸溶液及2%硼酸溶液中的指示劑。2.指出本測定方法產生誤差的緣由。3.正式測定未知樣品前為什么必需測定規范硫酸銨的含氮量及空白？4.寫出以下各步的化學反響式：〔1〕蛋白質消化〔2〕氨的蒸餾〔3〕氨的滴定上饒師范學院生物科學實驗教學中心

備注①蒸餾時實驗室中切忌有堿性霧氣〔如氨〕，否那么將嚴重地影響實驗結果的準確度。②假設反響室內液體太多，超越1/2，又不易排出時，只能拆開儀器倒出貯液。但是普通盡量防止發生此種情況。折卸時應特別小心，防止損壞儀器。裝配儀器應首先放松用來固定冷凝管的萬能夾，然后小心地將冷凝管向下錯開，待反響室外殼與冷凝管分開后，再挪動反響室。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

③“空白〞滴定值包括水及氫氧化鈉溶液中含有的微量的氨。因些，水質對“空白〞滴定值的影響甚大。“消化樣品〞最后用“消化空白〞進展校正計算，“不消化的樣品〞最后用“不消化的空白〞進展校正計算。而且，在實驗中，稀釋樣品的水與“空白〞的水該當取自于同一瓶中。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

④蛋白質是一類復雜的含氮化合物，其中每一種蛋白南都有恒定的含氮量，普通大約為14-18%，平均為16%。由凱氏定氮法測出含氮量，再乘以系數6.25〔即每含氮1g，就表示該物質含蛋白質6.25g〕即為蛋白質量。⑤最好將三氯乙酸沉淀的蛋白質部分再去消化，消化后測含氮量，這個含氮量應相等于由總氮及非蛋白氮計算的蛋白氮量。但操作費事一些。上饒師范學院生物科學實驗教學中心實驗四脂肪碘值的測定

〔4課時〕目的和要求1.學習脂肪碘值測定的原理和方法。2.了解測定脂肪碘值的意義。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

實驗原理脂肪中，不飽和脂肪酸鏈上有不飽和鍵，可與鹵素(Cl2,Br2,I2)進展加成反響，不飽和鍵數目越多，加成的鹵素量就越多，通常以“碘值〞表示。在一定條件下，每100g脂肪所吸收的碘的克數稱為該脂肪的“碘值〞。碘值越高，闡明不飽和脂肪酸的含量越高，它是鑒定和鑒別油脂的一個重要常數。本實驗運用溴化碘(IBr)進展碘值測定。IBr的一部分與不飽和脂肪酸起加成作用，剩余部分與碘化鉀作用放出碘，放出的碘用硫代硫酸鈉滴定。詳細反響過程如下：加成反響：─CH═CH─+IBr─→C2H2IBr釋放碘：IBr+KI─→KBr+I2滴定：I2+2Na2SO4─→2NaI+Na2S4O6上饒師范學院生物科學實驗教學中心

實驗步驟準確地稱取0.3—0.4g花生油2份，置于兩個枯燥的碘瓶內，切勿使油粘在瓶頸或壁上。參與10ml四氯化碳，悄然搖動，使油全部溶解。用滴定管仔細地參與25ml溴化碘溶液〔Hanus溶液〕，勿使溶液接觸瓶頸。蓋好瓶塞，在玻璃塞與瓶口之間加數滴10%碘化鉀溶液封鎖縫隙，以免碘的揮發損失。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

在20—30℃暗處放置30min，并不時悄然搖動。放置30min后，立刻小心地翻開玻璃塞，使塞旁碘化鉀溶液流入瓶內，切勿喪失。用新配制的10%碘化鉀10ml和蒸餾水50ml把玻璃賽和瓶頸上的液體沖洗入瓶內，混勻。用0.1mol/L硫代硫酸鈉溶液迅速滴定至淺黃色。參與1%淀粉溶液約1ml，繼續滴定。將近終點使，用力振蕩，使碘由四氯化碳層全部進入水溶液內。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

再滴定至藍色消逝為止，即達滴定終點。另作2份空白對照，除不加樣品外，其他操作同上。滴定后，將廢液倒入廢液缸內，以便回收四氯化碳。計算碘值按下式計算碘值：碘值=〔A-B〕×T×100/C式中，A=滴定空白用去的Na2S2O3溶液的平均毫升數，B=滴定碘化后樣品用去的Na2S2O3溶液的平均毫升數，C=樣品的分量(g)，T=1ml0.1mol/L硫代硫酸鈉溶液相當的碘的克數。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

思索題1.測定碘值有何意義？液體油和固體脂碘值之間有何區別？2.參與溴化碘溶液后，為何要在暗處存放30min？3.滴定過程中，淀粉溶液為何不能過早參與？4.滴定終了放置一些時間后，溶液前往藍色，否那么表示滴定過量，為什么？上饒師范學院生物科學實驗教學中心

備注①碘瓶必需洗凈，枯燥，否那么瓶中的油中含有水分，引起反響不完全。參與碘試劑后，如發現碘瓶中顏色變成淺褐色時，闡明試劑不夠，必需再添加10—15ml試劑。②如參與碘試劑后，液體變濁，這闡明油脂在CCl4中溶解不完全，可再加些CCl4。③將近滴定終點時，用力振蕩是本滴定成敗的關鍵之一，否那么容易滴過頭或缺乏。如振蕩不夠，CCl4層會出現紫色或紅色。此時該當用力振蕩，使碘進入水層。④淀粉溶液不宜加得過早。否那么，滴定值偏高。上饒師范學院生物科學實驗教學中心實驗五維生素C的定量測定

〔4課時〕目的和要求1.學習定量測定生素C的原理和方法。2.進一步掌握滴定法的根本操作技術。3.了解蔬菜中維生素C的含量。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

實驗原理維生素C是人類營養中最重要的維生素之一，缺乏時會產生壞血病，因此又稱為抗壞血酸。它是具有L系糖構型的不飽和多羥化合物，屬于水溶性維生素。維生素C分布很廣，植物的綠色部分及許多水果〔桔類、草莓、山楂、辣椒等〕的含量更為豐富。維生素C具有很強的復原性。在堿性溶液中，加熱并有氧化劑存在時，抗壞血酸易被氧化面破壞。在中性和微酸性環境中，抗壞血酸能將染料2，6－二氯酚靛酚復原成無色的復原型2，6－二氯酚靛酚。同時將抗壞血酸氧化成脫氫抗壞血酸。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

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氧化型2，6－二氯酚靛酚在酸性溶液中呈紅色，在中性或堿性溶液中呈藍色。因此，當用2，6–二氯酚靛酚滴定含有抗壞血酸的酸性溶液時，在抗壞血酸尚未全部被氧化時，滴下的2，6–二氯酚靛酚立刻被復原成無色。但溶液中的抗壞血酸一旦全部被氧化時，那么滴下的2，6–二氯酚靛酚立刻呈現紅色。所以，當溶液從無色轉變成微紅色時，即表示溶液中的抗壞血酸剛剛全部被氧化。此時即為滴定終點。從滴定時2，6–二氯酚靛酚規范的耗費量，可以計算出被檢物質中抗壞血酸的含量。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

該法簡便易行，但有以下缺陷：①在生物組織內和組織提取物內，抗壞血酸還能以脫氫抗壞血酸及結合抗血酸的方式存在。它們同樣具有維生素C的生理作用，但不能將2，6–二氯酚靛酚復原脫色。②生物組織提取物和生物體液中常含有其他復原性物質，其中有些也可以在同樣實驗條件下使2，6–二氯酚靛酚復原脫色。③在生物組織提取物中，常有色素類物質存在，給滴定終點的察看呵斥困難。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

實驗步驟用分析天平準確地稱取樣品約0.5克。樣品必需用溫水洗去泥土，并在空氣中風干。放入研缽中，加1％鹽酸溶液5～10ml一同研磨。放置片刻，將提取液濾入50ml容量瓶。如此反復抽提2～3次。最后用1％鹽酸液稀釋到刻度并混勻。每次量取5ml放入小錐形瓶內進展滴定。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

用微量滴定管，以0.001N2，6–二氯酚靛酚溶液〔藍色〕滴定至提取液呈現淡粉紅色，并堅持15～30秒不褪。滴定過程必需迅速，不要超越2min。由于在本滴定條件下，一些非維生素C復原物質的復原作用較緩慢，快速滴定右以防止或減少它們的影響。要使結果準確，滴下運用的2，6–二氯酚靛酚鈉在1～4ml之間，假設滴定結果超越此范圍，那么必需增減樣品用量或交提取液適當稀釋。另取5ml1％鹽酸作空白對照滴定。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

提取液和空白對照各做三份，對結果取平均值進展計算。計算：式中：VA為滴定樣品提取液所耗用的2，6–二氯酚靛酚的平均毫升數；VB為滴定空白對照所耗用的2，6–二氯酚靛酚的平均毫升數；C為樣品提取液的總毫升數；D為滴定時所取的樣品提取液毫升數；W為被檢樣品的質量。T為1毫升規范0.001N2，6–二氯酚靛酚溶液相當維生素C的毫克數，T的詳細數目為mg/ml。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

思索題指出本實驗采用的定量測定維生素C的方法有何優缺陷？上饒師范學院生物科學實驗教學中心實驗六小麥萌生前后淀粉酶活力的比較

〔6課時〕目的和要求1．學習分光光度計的原理和運用方法。2．學習測定淀粉酶活力的方法。3．了解小麥萌生前后淀粉酶活力的變化。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

實驗原理種子中貯藏的碳水化合物主要以淀粉的方式存在。淀粉酶能使淀粉分解為麥芽糖。2〔C6H10O5〕n＋H2O-------nC12H22O11麥芽糖有復原性，能使3,5-二硝基水楊酸復原成棕色的3-氨基5-硝基水揚酸。后者可用分光光度計法測定。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

實驗步驟1．種子發芽：小麥種子浸泡2.5小時后，放人25℃恒溫箱內或在室溫下發芽。2．酶液提取：取發芽第三天或第四天的幼苗15株，放人乳缽內，加海砂200毫克，加1％氯化鈉溶液10毫升，用力磨碎。在室溫下放置20分鐘，攪拌幾次。將提取液離心〔l500轉／min〕6－7分鐘。將上清液倒人量筒，測定酶提取液的總體積。進展酶活力測定時，將酶提取液稀釋10倍。取枯燥種子或浸泡2.5小時后的種子15粒作為對照〔提取步驟同上〕。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

3．酶活力測定：〔1〕取25毫升刻度試管4支。編號。按下表要求加人各試劑〔各試劑須25℃預熱10分鐘〕。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

將各管混勻，放在25℃，水浴中保溫3分鐘后，立刻向各管中加人10％3,5-二硝基水楊酸溶液2毫升。〔2〕取出各試管，放人沸水浴中加熱5分鐘。冷至室溫，加水稀釋至25毫升。將各管充分混勻。〔3〕用空白管作對照；在500毫微米處測定各管的光吸收值，將讀數填入上表。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

4．計算根據溶液的濃度與光吸收值成正比的關系，即：A規范／A未知＝C規范／C未知那么C〔酶液管濃度〕＝A酶×C規范／A規范式中C代表濃度；A為光吸收值。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

思索題1．為什么要將各試管中的溶液置于25℃水浴中保溫？上饒師范學院生物科學實驗教學中心實驗七組織DNA的提取純化

〔8課時〕目的和要求學習從鼠肝中提取動物DNA的方法。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

實驗原理DNA是儲存遺傳信息的物質，是遺傳的物質根底，它與生命的正常活動如種厲遺傳、生長發育有親密關系。其構造與功能的研討是當前分子生物學研討的主要內容之一。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

核酸廣泛存在于生物中，DNA含有生物體的全部遺傳信息，在生物組織中以核蛋白(DNP)方式存在。真核生物中，DNA主要存在于細胞核中，核外也有少量，如線粒體DNA，稱為核外基因。DNA的分子長度普通隨生物由低級進化到高級而添加。人類基因組含2.9×109bp。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

無論是研討核酸的構造，還是它的功能，首先需求對核酸進展分別與提純。分別與提純核酸最根本的要求是堅持核酸的完好性及純度。要從生物組織中提取DNA，DNA是以核蛋白(DNP)方式存在于細胞核中故首先必需粉碎組織，裂解細胞膜和核膜，使DNP釋放出來，再用苯酚提取蛋白。由于細胞中的核糖核蛋白(RNP)和DNP往往一同被提取，故DNA沉淀中混有RNA。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

需用核糖核酸酶(RNase)處置，去除RNA。并用蛋白酶將遺留的少量蛋白質水解除去，再經苯酚處置，乙醇沉淀，最后可得較為純真的DNA。它的純度可以從260nm波優點的光密度和280nm波優點的光密度之比值測知，普通以O.D260nm／O.D280nm能到達1.8左右為規范。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

分別與提純過程中堅持DNA的完好性和純度存在許多困難，主要緣由有：(1)細胞內存在很高的DNA酶活性，在分別與提純過程中會呵斥核酸的降解。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

(2)DNA分子很大，分別過程中因化學要素或物理要素使DNA降解，如強酸、強堿、溫度過高或機械張力剪切等。DNA的定量可采用化學的定磷法、定核酸法。目前多數實驗室采用紫外分光光度法測定核酸含量，以下公式可作為紫外定量時參考：雙鏈DNA含量：O.D260nm×樣品稀釋倍數×50ug／ml=ug/m1樣品。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

實驗步驟1．取新穎鼠肝用冰生理鹽水洗去血水，用濾紙吸千后，—70℃冰箱中保管，用時取出。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

2.1克鼠肝加10ml裂解緩沖液，在組織勻漿器中勻漿約1分鐘(2次，每次0.5分鐘)3．取塑料離心管1支參與1／3勻漿液(假設勻漿液太稠，那么再參與lmlTE緩沖液)，然后再參與等體積苯酚：氯仿混和液抽提。每次抽提輕緩地來回搖動5分鐘，然后離心10000轉／分鐘×5分鐘，水相吸入另一干凈的離心管中，反復抽提二次。留意：每次水相時不要將界面上的變性蛋白質混入，抽提二次后普通有機相和水相界面上的變性蛋白質極少，肉眼根本看不見。假設界面上變性蛋白質仍較多，可添加抽提次數。上饒師范學院生物科學實驗教學中心

4．水相參與一刻度離心管中后，參與2.5倍體積的冰無水乙醇(可用刻度離心管丈量體積)，加5mol／LNaCl到終濃度為0.1mol／L，在離心管中輕緩的混勻，此時可見白色絮狀沉淀，此即DNA粗