第四章酶的提取與分離純化預處理（pretreatment）：包括固液分離和細胞破碎（分離胞內產物）等。初步純化（roughfractionation）（提取）：除去與目的產物性質差異很大的雜質。高度純化（finefractionation）（精制）：除去與產物性質相似的雜質。濃縮與干燥（concentrationanddesiccation）（成品加工）:使酶與溶劑分離的過程。

第二節酶的精制

酶純化的基本原則：①建立一個方便靈敏的分析方法；②選擇有效的純化方法，盡可能減少純化步驟；③常在低溫（4℃）條件下進行純化，以避免酶的變性。

一、膜分離

借助一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、形狀、性質的顆粒或分子進行分離的技術。（一）擴散膜分離（濃度差為推動力）

——透析（dialysis）溶質分子Y從高濃度一側通過膜向低濃度一側移動蛋白質透析

1.透析膜

商品透析膜大多制成管狀。材料：纖維素衍生物。1）透析膜的預處理：目的：除雜質。

2）透析袋的保存：防腐劑＋冷藏。2.透析方法及裝置

透析袋透析簡單裝置。A:透析夾，B:透析，C:透析示意圖

（二）加壓膜分離（靜壓力差為推動力）

根據所截留物質顆粒大小的不同，分為：截留顆粒直徑操作壓力應用微濾0.2~2m<0.1MPa除菌超濾20A~0.2m0.1~0.7MPa分離病毒及生物大分子反滲透<20A0.7~13MPa純水制備微濾(Microfiltration，MF)

一種靜態過濾，隨過濾時間延長，膜面上截流沉積不溶物，引起水流阻力增大，透水速率下降，直至微孔全被堵塞；超濾(ultrafiltration，UF

)

一種動態過程，由泵提供推動力，在膜表面產生兩個分力：一個是垂直于膜面的法向分力，使水分子透過膜面，另一個是與膜面平行的切向力，把膜面截流物沖掉。

超濾原理的示意圖

利用超濾膜在一定壓力下使溶液中大分子滯留，而小分子及溶劑濾過的方法。超濾法在蛋白質溶液除鹽、濃縮及分離純化中有廣泛的應用。常規過濾(A)和超濾(B)的示意圖

AB圖4-61

超濾濃縮裝置

反滲透（Reverseosmosis，RO）

利用反滲透膜選擇性地只能透過溶劑(通常是水)的性質，對溶液施加壓力，使溶劑通過反滲透膜而從溶液中分離出來的過程。滲透與反滲透ReverseOsmosis(RO)Nanofiltration(NF)Ultrafiltration(UF)Microfiltration(MF)MembraneFiltration3.電場膜分離（電位差為推動力）電滲析：在離子交換膜的兩側分別裝上正、負電極。應用：脫鹽，海水淡化，純水制備，從發酵液中分離檸檬酸、谷氨酸及凝膠電洗脫。二、層析法

層析法也稱色譜法，是1903年俄國植物學家MichaelTswett發現并命名的。將植物色素溶液通過裝有CaCO3

吸附劑的柱子，然后用石油醚淋洗，各種色素以不同的速率流動后形成不同的色帶而被分開。

色譜起源色譜組分色素石油醚碳酸鈣顆粒

用色彩（chroma）和圖譜（graphs）組成色譜一詞（Chromatography)。層析法的基本原理

利用混合物中各組分物理化學性質的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數等），使各組分在流動相和固定相中的分布程度不同，并以不同的速度移動而達到分離的目的。mobilephase：攜帶樣品流過整個系統的流體

stationaryphase：靜止不動的一相層析法的分類

按兩相所處的狀態分類：液相層析液-固層析液-液層析氣相層析氣-固層析氣-液層析

按層析過程的機理分類：吸附層析：利用吸附劑表面對不同組分吸附性能的差異。分配層析：利用不同組分在流動相和固定相之間的分配系數的不同。離子交換層析：利用不同組分對離子交換劑親和力的不同。凝膠層析：利用某些凝膠對于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。

按操作形式不同分類：柱層析：將固定相裝于柱內，使樣品沿一個方向移動而達到分離。紙層析：用濾紙做液體的載體，點樣后，用流動相展開，以達到分離鑒定的目的。薄層層析：將適當粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進行物質的分離和鑒定。ColumnChromatography

層析設備梯度洗脫器蠕動泵（恒流泵）層析柱紫外監測儀記錄儀部分收集器

蛋白質定量-——紫外吸收法蛋白質分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基（主要是色氨酸Trp和酪氨酸Tyr的共軛雙鍵）對紫外光有吸收，以色氨酸吸收最強，最大吸收峰為280nm。在波長280nm具有吸光的氨基酸平衡、吸附鹽梯度沖洗分管收集蛋白測定制圖測A280記錄儀低溫層析柜層析操作分離前：1）樹脂預處理：凝膠溶漲。2）裝柱：重力沉降法，要求均勻，無氣泡。3）平衡：層析柱使用前，須用緩沖液平衡至所需的pH值和離子強度。層析操作分離中：上樣：體積盡可能小。平衡：用緩沖液使不被吸附的雜蛋白穿過。洗脫：連續梯度洗脫：連續改變緩沖液的pH或離子強度。階梯式梯度洗脫：分段地改變緩沖液的pH或離子強度。等溫平衡洗脫：用平衡緩沖液直接進行擴展洗脫。同時進行分步收集和檢測。

分離后：再生，平衡，保存。（一）吸附層析

（adsorptionchromatography）

1.原理利用吸附劑對不同物質吸附力不同而使混合物中各組分分離的方法。吸附作用的強弱主要與吸附劑和被吸附物質的性質有關。吸附層析的關鍵是吸附劑和洗脫劑的選擇。2.吸附劑1）吸附劑的選擇：根據吸附能力強弱分為：弱吸附劑：蔗糖、淀粉中等吸附劑：碳酸鈣、磷酸鈣、硅膠等強吸附劑：氧化鋁、活性炭吸附劑的選擇根據相似相溶原則：極性強的吸附劑易吸附極性強的物質非極性的吸附劑易吸附非極性的物質。但為了便于解吸附，對于極性強的物質通常選用極性弱的吸附劑進行吸附。

2）吸附劑的性質：活性炭：常用的吸附介質。硅膠：常用的極性吸附介質。羥基磷灰石（HA）[Ca10(PO4)6.(OH)2]:

微晶型的磷酸鈣制品，表面有Ca2+和PO43-兩種帶電基團；吸附原理是HA的Ca2+與蛋白質的負電荷基團作用。

3.洗脫劑要求：

粘度小，純度高，穩定性好，完全洗脫下所要分離的成分,易與目標分子分離。選擇：

具有較高洗脫能力的洗脫劑作為流動相。生物大分子一般選擇中性鹽溶液為洗脫劑。4.應用

分離純化生物大分子（二）凝膠過濾層析

凝膠過濾（gelfiltration）又稱分子篩層析（molecularsievechromatography）、排阻層析（exclusionchromatography）,是以各種多孔凝膠為固定相，利用溶液中各組分的分子量不同而進行分離的技術。1.基本原理

大分子物質不能進入凝膠孔內，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來；小分子物質可自由出入凝膠孔，流程長而后流出層析柱。Size-exclusionchromatography凝膠對溶質的排阻程度可用分配系數Kd表示：

Ve-VoKd=————ViVo——外水體積，層析柱內凝膠顆粒之間空隙的體積（ml）Vi——內水體積，層析柱內凝膠顆粒內部各微孔體積的總和（ml）Ve——某組分的洗脫體積，從加進層析柱到流出液中該組分出現高峰時的洗脫液體積（ml）凝膠過濾柱色譜洗脫的三種峰Ⅰ.Kd=0時,即Ve=Vo,說明該組分分子量足夠大，不進入微孔，最先流出。Ⅱ.Kd=1時,即Ve=Vo+Vi，說明該組分能進入凝膠的全部內空隙，最后流出。Ⅲ.其它組分0<Kd<1,因分子大小而改變洗脫峰的位置。Kd小的先流出，Kd大的后流出。

分配系數Kd的意義：1)可定量地衡量各組分的流出順序。2)判斷分離效果，Kd差異大，分離效果好，

Kd差異小，分離效果差。2.凝膠的種類和性質

1)交聯葡聚糖凝膠（dextrangel)

商品名:Sephadex

型號

SephadexG－10至G-200G后的數字為凝膠吸水值的10倍。數字越大，交聯度越小，孔徑越大，分離范圍越廣。凝膠型號

顆粒大小/μm

溶脹體積/(ml/g)

分離范圍（Mr）

SephadexG-10

SephadexG-15

SephadexG-25

SephadexG-50

SephadexG-75

SephadexG-100

SephadexG-150SephadexG-2004～120

4～120

50～150

50～150

40～120

40～120

40～120

40～120

2～3

2.5～3.5

4～6

9～11

12～15

15～20

20～30

20～30

小于7×102

小于1.5×103

1.0×103～5.0×103

1.5×103～3.0×1043.0×103～8.0×104

4.0×103～1.0×105

5.0×103～3.0×105

5.0×103～6.0×105

葡聚糖凝膠層析介質的有關參數

2）瓊脂糖凝膠（agarosegel)

商品名:Sepharose（瑞典）;Bio-GelA(美國）依靠糖鏈之間的次級鍵維持網狀結構，瓊脂糖密度越大，網狀結構越密集。型號

使用范圍（蛋白質的分子量）含瓊脂糖（℅）

6BSepharose4B2B104～3×106105～3×107106～108

642

6BSepharoseCL4B2B

同上

同上

0.5m

Bio-GelA1.5m5m15m50m150m10～500×10310～150010～500040～15000100～500001000～150000

1086421

Sepharose及Bio-gelA型號

3）聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamidegel）

商品名為Bio-Gel,型號從Bio-GelP－2至P-300，P值越大，孔徑也越大。以丙烯酰胺為單體，以甲叉雙丙烯酰胺為交聯劑聚合成的高分子聚合物。3.操作：1）凝膠的選擇和處理根據相對分子質量范圍選擇相應型號的凝膠介質。將干膠懸浮于5~10倍的蒸餾水中，充分溶脹，抽氣，裝柱。2）柱的選擇采用L/D比值高的柱子，可提高分辨率，但影響流速。3）加樣體積不能過多，不超過床體積的5％，脫鹽時可在10％左右。4）洗脫洗脫液與平衡時用的buffer一致。洗速不可過快，保持恒速。5）膠的保存洗脫完畢后，凝膠柱已恢復到上柱前的狀態，不必再生處理。用0.02%NaN3防腐。4.應用

1）脫鹽２)生物大分子物質的分離純化

3）分子量的測定

4）溶液濃縮LogMABCLogM測V測LogM=k1-k2Ve（Ve為洗脫體積）

先測得幾種標準蛋白質的Ve，并以其分子量對數對Ve作圖得一直線，再測出待測樣品的Ve，查標準曲線即可確定分子量。蛋白質的洗脫體積與其分子量有關（三）離子交換層析

（ionexchangechromatography，IEC）1.原理:根據待分離物質帶電性質不同的分離純化方法。1）離子交換劑：離子交換劑由載體、電荷基團和反離子構成。

如羧甲基纖維素離子交換劑組成纖維素—O—CH2—COO-—Na+

載體電荷基團反離子

化學原料合成：樹脂類物質載體

天然材料制成：cellulose

sephadexsepharose

陽離子交換劑:電荷基團（－）,反離子（＋）電荷基團陰離子交換劑:電荷基團（＋）,反離子（－）

如：DEAE-纖維素，CM-Sepharose離子交換劑--帶有電荷基團的不溶性載體-O-CH2CH2N-HCH2CH3CH2CH3Cl-載體Diethylaminoethyl(DEAE)

陰離子交換劑(可吸附帶負電的蛋白質)

陽離子交換劑(可吸附帶正電的蛋白質)兩種離子交換劑陰離子交換劑：常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2-羥丙基陽離子交換劑：常用羧甲基CM—CH2COO－

磺丙基SP—C3H6SO3－DEAE－C2H4N+(C2H5)2HQAE－C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3

離子交換葡聚糖

以SephadexG-25,G-50為骨架，接入離子交換基團。

DEAE（QAE）SephadexA-25，A-50CM（SP）SephadexC-25，C-50

A：anion陰離子

C:cation陽離子類型說明功能基團反離子DEAE-SephadexA-25，A-50弱堿性陰離子交換劑二乙氨基己基氯QAE-SephadexA-25，A-50強堿性陰離子交換劑二乙氨基己基—2-羥丙基氯CM-SephadexC-25，C-50弱酸性陽離子交換劑羧甲基鈉SP-SephadexC-25，C-50強酸性陽離子交換劑磺丙基鈉離子交換葡聚糖

離子交換劑的選擇a.強、弱離子交換劑的選擇：強型：適用的pH范圍廣，制備無離子水

弱型：適用的pH范圍窄，分離生物大分子物質

b.陰、陽離子交換劑的選擇：酶的穩定性若<pI穩定，蛋白質帶正電荷，用陽離子交換劑若>pI穩定，蛋白質帶負電荷，用陰離子交換劑2）蛋白質的電荷性質pH值如何影響蛋白質的電荷數24681012140系統pH+

蛋白質帶正電荷

蛋白質帶負電荷等電點-

實驗設計原理利用不同的蛋白質分子在溶液中所帶電荷不同，從而與離子交換劑有不同結合力而分離。pH6.0pI>6.0蛋白質帶正電pI<6.0蛋白質帶負電2.陰離子交換劑分離蛋白質的過程平衡吸附去吸附分離結束再生+低鹽高鹽利用不同鹽濃度將不同蛋白質洗脫下來Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Ion-exchangechromatography3.操作平衡上樣平衡洗脫再生1）上樣：上樣體積不十分嚴格。2）洗脫:

增加溶液的離子強度

梯度洗脫法

改變溶液的pH值

3）再生：用0.5mol/LNaOH和0.5mol/LNaCl混合溶液或0.5mol/LHCl處理。4.應用制備純化生物大分子圖4-39梯度溶液的制備方法和洗脫曲線（a）線性梯度；（b）凸形梯度；（c）凹形梯度；（d）編程梯度（四）疏水層析（HydrophobicInteractionChromatography,HIC）從分離純化的機制看，屬吸附層析類。利用疏水層析介質和蛋白質分子都具有一定的疏水性質，根據被分離成分與固定相之間疏水力大小的不同而進行分離。

大多數蛋白質具有較強的親水性，但分子內部存在一個疏水核心，欲讓蛋白質與疏水性固定相結合在一起，可以靠蛋白質表面的一些疏水補丁（hydrophobicpatch），或讓蛋白質發生局部變性（可逆），暴露出掩藏于分子內的疏水性殘基。原理:

在高鹽濃度下，蛋白質發生局部可逆變性，被迫與疏水層析的固定相結合在一起，然后通過降低流動相的離子強度，即可將結合于固定相的蛋白質，按其結合力大小，依次進行解吸附。2.層析介質

親水性（如Sepharose）基質固定相疏水性（如硅膠、樹脂）配體（疏水性基團）（苯基、辛基、烷基）產品名稱載體配基生產公司苯基Sepharose4B瓊脂糖凝膠珠苯基Pharnacia辛基Sepharose4B瓊脂糖凝膠珠辛基Pharnacia烷基交聯瓊脂糖凝膠珠瓊脂糖凝膠珠烷基(Cn)以色列

一些商品疏水層析介質

3.操作平衡上樣平衡洗脫再生1）加樣：樣品溶液中補加適量的鹽。2）洗脫：用降低鹽濃度的平衡緩沖液洗脫。3）再生：除去固定相吸附的雜質，用水或

8mol/L脲素溶液。4.應用主要用于分離純化大分子物質。

（五）親和層析(AffinityChromatography)

由吸附層析發展起來的，是從復雜混和物中純化蛋白質的最好方法。又稱：功能層析（functionchromatography）生物專一吸附（biospecificadsorption）選擇層析（selectivechromatography）

1.原理

利用生物大分子間特異的親和力來純化生物大分子，如：抗原和抗體；酶和底物或輔酶或抑制劑；激素和受體；RNA和其互補的DNA等。

將待純化物質的特異配體通過適當的化學反應共價連接到載體上，待純化的物質可被配體吸附，雜質則不被吸附，從層析柱流出，變換洗脫條件，即可將欲分離的物質洗脫下來，實現分離提純。+CCC配基蛋白質1.配基固相化2.親和吸附固體載體3.解吸附Affinitychromatography2.基質的選擇理想的基質應滿足以下要求：①高度的親水性。②極低的非特異性吸附性（惰性）。③具有足夠的化學基團。④適當的多孔性。⑤較好的理化穩定性。可被應用的基質（載體）：（按性能優劣排序）瓊脂糖凝膠、聚丙稀酰胺凝膠、葡聚糖凝膠、纖維素。最常用的是瓊脂糖，Sepharose1B到10B3.配體的選擇一對可逆結合的生物分子中與載體相偶聯的一方稱配體。如抑制劑，底物，抗體，輔酶等。

優良配體須具備的條件：1）與待純化的物質有較強的親和力。2）具有與基質共價結合的基團。所要分離的目的產物

相應的配基

酶抗體凝集素激素底物、抑制劑、輔酶（輔因子）抗原、病毒、細胞多糖、糖蛋白、細胞受體受體、載體蛋白

目的產物與相應的配基

4.偶聯（親和吸附劑的制備）配體一定，改造載體（基質）1）基質活化：不同的載體活化需要不同的活化劑。常用：溴化氰（CNBr）、環氧氯丙烷、1,4-丁二醚、戊二醛、高碘酸鹽、苯醌等。溴化氰法是最早使用且最常用的活化方法。如用CNBr作用于葡聚糖和瓊脂糖的糖羥基2）引入連接臂（spacearm）

又稱手臂（spacer）“接臂”的目的：克服影響配基與生物大分子的結合的空間障礙。“接臂”的途徑：常用二胺化合物（丁二胺、乙二胺、己二胺）。目前帶有各種手臂的系列載體已有商品供應。如：AH-Sepharose4B常用手臂5.操作：1）層析前：制備親和層析劑

選擇根據欲分離物質特性配基

選擇根據配基分子大小及基團特性載體2）洗脫：能削弱酶和親和吸附劑間的相互作用。包括：非專一性洗脫和專一性洗脫偶聯親和層析劑非專一性洗脫：改變溫度改變pH值改變離子強度專一性洗脫：

競爭性洗脫劑（如抑制劑、底物類似物）被吸附物質結合競爭性地與配體結合6.應用1）純化大分子物質如：純化糖蛋白用凝集素（能可逆性地結合碳水化合物的蛋白質），Lectin-Sepha