第五章毛細管電泳主要內容Highperformancecapillaryelectrophoresis,HPCE5.1毛細管電泳的根本原理5.2毛細管電泳儀5.3毛細管電泳的別離模式5.4影響分辨率的因素及操作條件選擇5.5毛細管電泳的應用5.1毛細管電泳的根本原理在電解質溶液中，位于電場中的帶電離子在電場力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現象，稱之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質的不同，遷移速率不同，可實現別離。1937年，Tiselius(瑞典)將蛋白質混合液放在兩段緩沖溶液之間，兩端施以電壓進行自由溶液電泳，第一次將人血清提取的蛋白質混合液別離出白蛋白和α、β、γ球蛋白；發現樣品的遷移速度和方向由其電荷和淌度決定；第一次的自由溶液電泳；第一臺電泳儀；1948年，獲諾貝爾化學獎；5.1.1概述經典電泳分析利用電泳現象對某些化學或生物物質進行別離分析的方法和技術叫電泳法或電泳技術。按形狀分類：U型管電泳、柱狀電泳、板電泳；按載體分類：濾紙電泳、瓊脂電泳、聚丙烯酰胺電泳、自由電泳；傳統電泳分析：操作煩瑣，別離效率低，定量困難，無法與其他分析相比。1981年，Jorgenson和Luckas，用75μm內徑石英毛細管進行電泳分析，柱效高達40萬/m，促進電泳技術發生了根本變革，迅速開展成為可與GC、HPLC相媲美的嶄新的別離分析技術——高效毛細管電泳。高效毛細管電泳分析

highperformancecapillaryelectrophoresis高效毛細管電泳在技術上采取了兩項重要改進：一是采用了0.05mm內徑的毛細管,；二是采用了高達數千伏的電壓。毛細管的采用使產生的熱量能夠較快散發，大大減小了溫度效應，使電場電壓可以很高。電壓升高，電場推動力大，又可進一步使柱徑變小，柱長增加，高效毛細管電泳的柱效遠高于高效液相色譜，理論塔板數高達幾十萬塊/米，特殊柱子可以到達數百萬。電壓：0～30kV；別離柱不涂敷任何固定液；紫外或激光誘導熒光檢測器；〔可檢測到：10-19～10-21mol/L〕高效毛細管電泳的特點〔書P144有6點〕1.儀器簡單、易自動化電源、毛細管、檢測器、溶液瓶2.分析速度快、別離效率高在3.1min內別離36種無機及有機陰離子，4.1min內別離了24種陽離子；別離柱效：105～107/m理論塔板數；3.操作方便、消耗少，本錢低進樣量極少，水介質中進行；4.應用范圍極廣有機物、無機物、生物、中性分子；生物大分子等；分子生物學、醫學、藥學、化學、環境保護、材料等；5、高靈敏度。6、進樣量少。5.1.2高效毛細管電泳(HPCE)根本原理

電泳是指帶電離子在電場中的定向移動，不同離子具有不同的遷移速度，遷移速度與哪些因素有關？當帶電離子以速度ν

在電場中移動時，受到大小相等、方向相反的電場推動力和平動摩擦阻力的作用。電場力：FE=qE

阻力：F=fν故：qE=fνq—離子所帶的有效電荷；E—電場強度；ν—離子在電場中的遷移速度；f—平動摩擦系數(對于球形離子：f=6πηγ；γ—離子的表觀液態動力學半徑；η—介質的粘度；)所以，遷移速度：〔球形離子〕物質離子在電場中差速遷移是電泳別離的根底。淌度μ：單位電場強度下的平均電泳速度。電滲現象與電滲流1.電滲流現象當固體與液體接觸時，固體外表由于某種原因帶一種電荷，那么因靜電引力使其周圍液體帶有相反電荷，在液-固界面形成雙電層，二者之間存在電位差〔Zeta電位〕。當液體兩端施加電壓時，就會發生液體相對于固體外表的移動，這種液體相對于固體外表的移動的現象叫電滲現象。電滲現象中整體移動著的液體叫電滲流〔electroosmoticflow，簡稱EOF〕。2.HPCE中的電滲現象與電滲流石英毛細管柱，內充液pH>3時，外表電離成-SiO-,管內壁帶負電荷，形成雙電層。在高電場的作用下，帶正電荷的溶液外表及擴散層向陰極移動，由于這些陽離子實際上是溶劑化的，故將引起柱中的溶液整體向負極移動，速度ν電滲流。3.HPCE中電滲流的大小與方向電滲流的大小用電滲流速度ν電滲流表示，取決于電滲淌度μ和電場強度E。即ν電滲流=μE電滲淌度取決于電泳介質及雙電層的Zeta電勢，即μ=ε0εξε0—真空介電常數；ε—介電常數；ξ—毛細管壁的Zeta電勢。ν電滲流=ε0εξE實際電泳分析，可在實驗測定相應參數后，按下式計算ν電滲流=Lef/teoLef—毛細管有效長度；teo—電滲流標記物〔中性物質〕的遷移時間。HPCE中電滲流的方向電滲流的方向取決于毛細管內外表電荷的性質：內外表帶負電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向陰極；內外表帶正負電荷，溶液帶負電荷，電滲流流向陽極；石英毛細管；帶負電荷，電滲流流向陰極；改變電滲流方向的方法：〔1〕毛細管改性外表鍵合陽離子基團；〔2〕加電滲流反轉劑內充液中參加大量的陽離子外表活性劑，將使石英毛細管壁帶正電荷，溶液外表帶負電荷。電滲流流向陽極。4.HPCE中電滲流的流形電荷均勻分布，整體移動，電滲流的流動為平流，塞式流動〔譜帶展寬很小〕；液相色譜中的溶液流動為層流，拋物線流型，管壁處流速為零，管中心處的速度為平均速度的2倍〔引起譜帶展寬較大〕。5.HPCE中電滲流的作用電滲流的速度約等于一般離子電泳速度的5～7倍；各種電性離子在毛細管柱中的遷移速度為：ν+=ν電滲流+ν+ef陽離子運動方向與電滲流一致；ν-=ν電滲流-ν-ef陰離子運動方向與電滲流相反；ν0=ν電滲流中性粒子運動方向與電滲流一致；〔1〕可一次完成陽離子、陰離子、中性粒子的別離；〔2〕改變電滲流的大小和方向可改變別離效率和選擇性，如同改變LC中的流速；〔3〕電滲流的微小變化影響結果的重現性；在HPCE中，控制電滲流非常重要。HPCE中影響電滲流的因素

factorsinfluencedelectroosmosis1.電場強度的影響

電滲流速度和電場強度成正比，當毛細管長度一定時，電滲流速度正比于工作電壓。2.毛細管材料的影響不同材料毛細管的外表電荷特性不同，產生的電滲流大小不同；3.電解質溶液性質的影響〔1〕溶液pH的影響對于石英毛細管，溶液pH增高時，外表電離多，電荷密度增加，管壁zeta電勢增大，電滲流增大，pH=7，到達最大；pH<3，完全被氫離子中和，外表電中性，電滲流為零。分析時，采用緩沖溶液來保持pH穩定。〔2〕陰離子的影響在其他條件相同，濃度相同而陰離子不同時，毛細管中的電流有較大差異，產生的焦耳熱不同。緩沖溶液離子強度，影響雙電層的厚度、溶液黏度和工作電流，明顯影響電滲流大小。緩沖溶液離子強度增加，電滲流下降。4.溫度的影響毛細管內溫度的升高，使溶液的黏度下降，電滲流增大。溫度變化來自于“焦耳熱〞；焦耳熱：毛細管溶液中有電流通過時，產生的熱量；HPCE中的焦耳熱與背景電解質的摩爾電導、濃度及電場強度成正比。溫度每變化1，將引起背景電解質溶液黏度變化2%～3%；5.添加劑的影響〔1〕參加濃度較大的中性鹽，如K2SO4，溶液離子強度增大，使溶液的黏度增大，電滲流減小。〔2〕參加外表活性劑，可改變電滲流的大小和方向；參加不同陽離子外表活性劑來控制電滲流。參加陰離子外表活性劑，如十二烷基硫酸鈉〔SDS〕，可以使壁外表負電荷增加，zeta電勢增大，電滲流增大；〔3〕參加有機溶劑如甲醇、乙腈，使電滲流增大。HPCE中的參數與關系式

1.遷移時間〔保存時間〕HPCE兼具有電化學的特性和色譜分析的特性。有關色譜理論也適用。V—外加電壓；L—毛細管總長度；2.別離效率〔塔板數〕在HPCE中，僅存在縱向擴散，σ2=2Dt擴散系數小的溶質比擴散系數大的別離效率高，別離生物大分子的依據。3.別離度影響別離度的主要因素；工作電壓V；毛細管有效長度與總長度比；有效淌度差。別離度可按譜圖直接由下式計算：5.2高效毛細管電泳儀儀器流程與主要部件電壓：0～30kV；別離柱不涂敷任何固定液；紫外或激光誘導熒光檢測器；〔可檢測到：10-19～10-21mol/L〕1.高壓電源〔1〕0～30kV穩定、連續可調的直流電源；〔2〕具有恒壓、恒流、恒功率輸出；〔3〕電場強度程序控制系統；〔4〕電壓穩定性：0.1%；〔5〕電源極性易轉換；2.毛細管柱〔1〕材料：石英：各項性能好；玻璃：光學、機械性能差；〔2〕規格：內徑20～75μm，外徑350～400μm；長度≤1m3.緩沖液池

化學惰性，機械穩定性好；4.檢測器

要求：具有極高靈敏度，可柱端檢測；檢測器、數據采集與計算機數據處理一體化；

類型檢測限/mol特點紫外-可見10-13～10-15加二極管陣列，光譜信息熒光10-15～10-17靈敏度高，樣品需衍生激光誘導熒光10-18～10-20靈敏度極高，樣品需衍生電導10-18～10-19離子靈敏，需專用的裝置；毛細管電泳的進樣方式進樣量：毛細管長度的1%-2%；納升級、非常小；1.流體力學進樣方式〔1〕進樣端加壓〔2〕出口端抽真空〔3〕虹吸進樣

毛細管一端插入樣品瓶，加電壓；2.電動進樣方式進樣不均：電歧視現象，淌度大的離子比淌度大的進樣量大；離子喪失：淌度大且與電滲流方向相反的離子可能進不去；特別適合黏度大的試樣；3.擴散進樣試樣通過擴散作用進入別離柱端口處。5.3別離模式八種別離類型，介紹常用的幾種；根據試樣性質不同，采用不同的別離類型；每種機理的選擇性不同；一、毛細管區帶電泳

capillaryzoneelectrophoresis，CZE

帶電粒子的遷移速度=電泳和電滲流速度的矢量和。

正離子：兩種效應的運動方向一致，在負極最先流出；中性粒子：無電泳現象，受電滲流影響，在陽離子后流出；陰離子：兩種效應的運動方向相反；ν電滲流>ν電泳時,陰離子在負極最后流出,在這種情況下,不但可以按類別離,同種類離子由于差速遷移被相互別離。最根本、應用廣的別離模式；二、毛細管凝膠電泳

capillarygelelectrophoresis，CGE將聚丙烯酰胺等在毛細管柱內交聯生成凝膠。其具有多孔性，類似分子篩的作用，試樣分子按大小別離。能夠有效減小組分擴散，所得峰型鋒利，別離效率高。蛋白質、DNA等的電荷/質量比與分子大小無關，CZE模式很難別離，采用CGE能獲得良好別離。特點：抗對流性好，散熱性好，別離度極高。無膠篩分技術：采用低粘度的線性聚合物溶液代替高粘度交聯聚丙烯酰胺。柱廉價、易制備。1.緩沖溶液中參加離子型外表活性劑，其濃度到達臨界濃度，形成一疏水內核、外部帶負電的膠束。三、膠束電動毛細管色譜〔MECC，MEKC〕

micellarelectrokineticcapillarychromatography，MEKC

在電場力的作用下，膠束在柱中移動。

2.電泳流和電滲流的方向相反，且ν電滲流>ν電泳，負電膠束以較慢的速度向負極移動；5.色譜與電泳別離模式的結合。3.中性分子在膠束相和溶液〔水相〕間分配，疏水性強的組分與膠束結合的較牢，流出時間長；4.可用來別離中性物質，擴展了高效毛細管電泳的應用范圍；1.根據等電點差異別離生物大分子的高分辨率電泳技術；2.毛細管內充有兩性電解質〔合成的具有不同等電點范圍的脂肪族多胺基多羧酸混合物〕，當施加直流電壓〔6～8V〕時，管內將建立一個由陽極到陰極逐步升高的pH梯度；3.氨基酸、蛋白質、多肽等的所帶電荷與溶液pH有關，在酸性溶液中帶正電荷，反之帶負電荷。在其等電點時，呈電中性，淌度為零；四、毛細管等電聚焦

capillaryisoelectricfocusing，CIEF4.聚焦：具有不同等電點的生物試樣在電場力的作用下遷移，分別到達滿足其等電點pH的位置時，呈電中性，停止移動，形成窄溶質帶而相互別離；5.陽極端裝稀磷酸溶液，陰極端裝稀NaOH溶液；6.加壓將毛細管內別離后的溶液推出經過檢測器檢測；7.電滲流在CIEF中不利，應消除或減小。5.5毛細管電泳的應用陽離子分析遷移方向和電滲流方向一致；4.5min內別離了24種金屬離子；陽極進樣，陰極檢測；具有很高的靈敏度；陰離子分析陰離子電泳方向和電滲流方向相反、速度接近，分析時間長、效率低；質量小、電荷密度大的離子如：SO4-2、Cl-、F-等，電泳速率大于電滲流，陽極端流出，在陰極端無法檢測；參加電滲流改性劑，十六烷基三甲基溴化胺等，使電泳方向和電滲流方向一致，可在3.1min內別離36種陰離子；陰極進樣，陽極檢測；離子價態及存在形態分析；藥物分析

analysisofpharmaceutics檢測體液或細胞中某些代謝產物的分析；尿液中的氨基酸含量作為臨床診斷糖尿病的輔助手段；采用毛細管區帶電泳方式，在11m