第1講全面落實“基因工程及生物技術的安全性與倫理問題”的主干知識1．切割質粒的限制性內切核酸酶均能特異性地識別6個核苷酸序列。(×)2．E.coliDNA連接酶既可連接平末端，又可連接黏性末端。(×)3．載體的作用是攜帶目的基因導入受體細胞中，使之穩定存在并表達。(√)4．用PCR方法擴增目的基因時必須知道基因的全部序列。(×)5．外源DNA必須位于重組質粒的啟動子和終止子之間才能進行復制。(×)6．蛋白質工程是在分子水平上對蛋白質分子直接進行操作，定向改變分子的結構。(×)7．在電泳時，DNA分子的遷移速率與DNA分子的大小和構象有關，與DNA分子的帶電量和帶電性質無關。(×)8．“設計試管嬰兒”與“試管嬰兒”的技術操作過程是完全相同的。(×)系統學習(一)重組DNA技術的基本工具(固基點)主干知識·記準理清(一)基因工程的概念(二)基因工程的基本工具1．限制性內切核酸酶——“分子手術刀”存在主要存在于原核生物中作用識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開特性一種限制酶只能識別一種特定的脫氧核苷酸序列，并且能在特定的位點上切割DNA分子結果產生黏性末端或平末端2．DNA連接酶——“分子縫合針”種類E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源大腸桿菌T4噬菌體特點只縫合黏性末端縫合黏性末端和平末端作用恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵，連接兩個DNA片段3．基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”類型最常用：質料；其他：噬菌體、動植物病毒等條件①穩定并自我復制或整合到受體DNA上，使目的基因穩定存在且數量可擴增；②具有一個至多個限制酶切割位點，供外源DNA片段插放；③具有特殊的標記基因，便于重組DNA分子的篩選作用攜帶外源DNA片段進入受體細胞(三)DNA的粗提取與鑒定1．實驗原理DNA、RNA、蛋白質和脂質等在物理和化學性質方面存在差異，可以利用這些差異，選用適當的物理或化學方法對它們進行提取。(1)DNA不溶于酒精。(2)DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2_mol/L的NaCl溶液。(3)在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑會呈現藍色。2．實驗步驟————————————■鏈教材資料·發展科學思維■————————————1．(選擇性必修3P71旁欄思考拓展)限制酶來源于原核生物，為什么不能切割自己的DNA分子？提示：限制酶具有特異性，即一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并在特定的位點上進行切割。限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在該酶的識別序列或識別序列已經被修飾。2．(選擇性必修3P72旁欄思考拓展)DNA連接酶和DNA聚合酶的作用相同嗎？試簡要說明。提示：不相同。DNA連接酶連接的是兩個DNA片段，而DNA聚合酶是將單個脫氧核苷酸依次連接到DNA單鏈的末端。題點考法·練全練通考法(一)考查基因工程的操作工具1．下面是3種限制性內切核酸酶對DNA分子的識別序列和剪切位點圖(箭頭表示切點，切出的斷面為黏性末端)。下列敘述不正確的是()A．不同的限制酶有不同的識別序列和切割位點，體現了酶的專一性B．限制酶2和3識別的序列都包含6個堿基對C．限制性酶1和酶3剪出的黏性末端相同D．能夠識別和切割RNA分子內一小段核苷酸序列的酶只有限制酶2解析：選D由圖可知，限制酶2和3識別的序列分別是CCGCGG和GGATCC，均為6個堿基對，B正確；限制酶1和3剪出的黏性末端相同，均為GATC，C正確；限制酶只能識別特定的DNA序列，且具有專一性，因此三種限制酶均不能識別和切割RNA中的核糖核苷酸序列，A正確，D錯誤。2．圖(a)中的三個DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三種限制酶的識別序列與切割位點，圖(b)為某種表達載體的示意圖(載體上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切點是唯一的)。根據基因工程的有關知識，回答下列問題：(1)經BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以與上述表達載體被________酶切后的產物連接，理由是_________________________________________________________________________________________________________________________________________。(2)若某人利用圖(b)所示的表達載體獲得了甲、乙、丙三種含有目的基因的重組子，如圖(c)所示，這三種重組子中，不能在宿主細胞中表達目的基因產物的有________，不能表達的原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)DNA連接酶是將兩個DNA片段連接起來的酶，常見的有________________和________________，其中既能連接黏性末端又能連接平末端的是________________________________________________________________________。解析：(1)由于限制酶Sau3AⅠ與BamHⅠ切割DNA后形成的黏性末端相同，所以經BamHⅠ酶切割得到的目的基因可以與上述表達載體被Sau3AⅠ酶切后的產物連接。(2)在基因表達載體中，啟動子應位于目的基因的首端，終止子應位于目的基因的尾端，這樣目的基因才能表達。圖中甲、丙均不符合，所以不能表達目的基因產物。(3)常見的DNA連接酶有E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶，其中既能連接黏性末端又能連接平末端的是T4DNA連接酶。答案：(1)Sau3AⅠ兩種酶切割后產生的片段具有相同的黏性末端(2)甲、丙甲中目的基因插入在啟動子的上游，丙中目的基因插入在終止子的下游，二者的目的基因均不能被轉錄(3)E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶T4DNA連接酶[歸納拓展]與DNA有關的幾種酶的比較酶種類作用底物作用部位作用結果限制酶DNA分子磷酸二酯鍵將DNA切成兩個或多個片段DNA連接酶DNA分子片段磷酸二酯鍵將兩個DNA片段連接為一個DNA分子DNA聚合酶脫氧核苷酸磷酸二酯鍵以DNA單鏈為模板，將單個脫氧核苷酸依次連接到另一條短的單鏈末端解旋酶DNA分子堿基對中的氫鍵將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈，形成兩條長鏈DNA水解酶DNA分子磷酸二酯鍵將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸考法(二)考查DNA的粗提取與鑒定的原理和操作3．(2022·山東高考)關于“DNA的粗提取與鑒定”實驗，下列說法錯誤的是()A．過濾液沉淀過程在4℃冰箱中進行是為了防止DNA降解B．離心研磨液是為了加速DNA的沉淀C．在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑呈現藍色D．粗提取的DNA中可能含有蛋白質解析：選B低溫時DNA酶的活性較低，過濾液沉淀過程在4℃冰箱中進行是為了防止DNA降解，A正確；離心研磨液是為了使細胞碎片沉淀，B錯誤；在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺試劑呈現藍色，C正確；細胞中的某些蛋白質可以溶解于酒精，可能有某些蛋白質不溶于酒精，在體積分數為95%的冷酒精中與DNA一起析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白質，D正確。4．下圖是“DNA的粗提取與鑒定”實驗中的兩個操作步驟示意圖，相關敘述正確的是()A．圖1中溶液a是去掉上清液的研磨液B．圖2所示實驗操作中有一處明顯錯誤，可能導致試管2中藍色變化不明顯C．圖1所示操作的原理是DNA能溶于酒精，而蛋白質等雜質不溶D．圖2試管1的作用是證明物質的量濃度為2mol/L的NaCl溶液遇二苯胺出現藍色解析：選B圖1中溶液a是研磨液靜置幾分鐘后取的上清液，A錯誤；圖2所示實驗的試管中溶液的液面高于燒杯中的液面，可能導致加熱不充分，試管2中藍色變化不明顯，B正確；圖1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精，而蛋白質等雜質能溶于酒精，C錯誤；圖2試管1起對照作用，目的是證明沸水浴下物質的量濃度為2mol/L的NaCl溶液遇二苯胺不會出現藍色，而DNA遇二苯胺出現藍色，D錯誤。系統學習(二)基因工程的操作程序與應用(釋疑點)基礎知識·全面掌握(一)基因工程的操作程序1．目的基因的篩選與獲取(1)篩選合適的目的基因。①目的基因：在基因工程的設計和操作中，用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產物等的基因。主要是指編碼蛋白質的基因。②篩選目的基因的方法：從相關的已知結構和功能清晰的基因中進行篩選是較為有效的方法之一。(2)利用PCR獲取和擴增目的基因。①原理：DNA復制。②條件：DNA模板、2種引物、耐高溫的DNA聚合酶和4種脫氧核苷酸。③擴增過程。過程說明圖解變性溫度超過90℃，雙鏈DNA解聚為單鏈復性溫度下降到50℃左右，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結合延伸溫度上升到72℃左右，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據堿基互補配對原則合成新的DNA鏈2．基因表達載體的構建(1)構建基因表達載體的目的。①使目的基因在受體細胞中穩定存在，并且遺傳給下一代。②使目的基因能夠表達和發揮作用。(2)基因表達載體的組成。(3)基因表達載體的構建過程。3．將目的基因導入受體細胞項目植物細胞動物細胞微生物細胞常用方法農桿菌轉化法、花粉管通道法顯微注射技術Ca2＋處理法受體細胞受精卵、體細胞受精卵原核細胞4．目的基因的檢測與鑒定檢測水平檢測目的檢測方法分子水平目的基因是否插入到轉基因生物染色體DNA上PCR目的基因是否轉錄出了mRNA目的基因是否翻譯出蛋白質抗原—抗體雜交個體水平轉基因生物是否表現出相應的特性如抗蟲、抗病的接種實驗(二)基因工程的應用1．基因工程在農牧業方面的應用①轉基因抗蟲植物；②轉基因抗病植物；③轉基因抗除草劑植物；④改良植物的品質；⑤提高動物的生長速率；⑥改善畜產品的品質。2．基因工程在醫藥衛生領域的應用①對微生物或動植物的細胞進行基因改造，使它們生產藥物。②讓哺乳動物批量生產藥物。③可能使建立移植器官工廠的設想成為現實。3．基因工程在食品工業方面的應用利用基因工程菌生產食品工業用酶、氨基酸和維生素等。————————————■鏈教材資料·發展科學思維■————————————1．(選擇性必修3P78圖3-5)PCR反應過程示意圖分析：(1)PCR技術的原理是什么？提示：體外DNA雙鏈復制。(2)由圖分析可知，在PCR反應過程中需要兩種引物，原因是什么？提示：DNA由兩條反向平行的脫氧核苷酸鏈組成，DNA聚合酶不能從頭合成DNA，而只能從3′端延伸DNA鏈。2．(選擇性必修3P80正文拓展思考)為什么切割含有目的基因的DNA片段和載體要選用同一種限制酶？是否只能用同一種限制酶？提示：選用同一種限制酶切割會產生相同的黏性末端，可以在DNA連接酶的作用下將切割的目的基因和載體連接起來。也可以使用能產生相同末端的限制酶切割。3．(選擇性必修3P81正文拓展思考)在用土壤農桿菌轉化法將目的基因導入植物細胞的過程中，為什么一定要將目的基因插入到Ti質粒的T-DNA上？提示：Ti質粒上T-DNA也稱為可轉移DNA，可轉移至受體細胞，并且整合到受體細胞染色體DNA上。重難盲點·講練疏通eq\a\vs4\al(———————)eq\a\vs4\al(微點釋解一)———————————————————————————基因工程的操作步驟————————————————————————————————————————1．目的基因的獲取方法(1)利用PCR獲取和擴增目的基因。(2)人工合成目的基因。①逆轉錄法：主要用于相對分子質量較大而又不知其核苷酸序列的基因。它以目的基因的mRNA為模板，借助逆轉錄酶合成雙鏈DNA，其過程如下：eq\x(目的基因的mRNA)eq\o(→,\s\up7(逆轉錄),\s\do5())eq\x(雙鏈DNA目的基因)②化學合成法：依據某一蛋白質的氨基酸序列，推測出其基因序列，然后直接合成目的基因，其過程如下：(3)從基因文庫中獲取目的基因。根據目的基因的有關信息，例如，根據基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色體上的位置、基因的轉錄產物mRNA，以及基因的表達產物蛋白質等特性來獲取目的基因。2．目的基因的檢測與鑒定方法(1)載體上標記基因的標記原理。載體上的標記基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要轉入的受體細胞沒有抵抗相應抗生素的能力。當含有抗生素抗性基因的載體進入受體細胞后，抗性基因在受體細胞內表達，使受體細胞能夠抵抗相應抗生素，所以在受體細胞的培養體系中加入該種抗生素就可以只保留轉入載體并已表達的受體細胞，原理如圖所示：(2)目的基因的檢測。①使用PCR等技術，檢測目的基因是否插入轉基因生物染色體DNA上及目的基因是否轉錄出特定mRNA。②采用抗原—抗體雜交技術，從轉基因生物中提取蛋白質(作抗原)，與相應抗體雜交，依據是否出現雜交帶確認目的基因是否“指導”特定蛋白質的合成。③采用抗蟲、抗病毒等接種實驗，進行目的基因成功表達的“個體生物學”水平的檢測。[典例1]人乳鐵蛋白是一種重要的藥用保健蛋白。如圖表示利用乳腺生物反應器生產人乳鐵蛋白的過程，圖中Tetr表示四環素抗性基因，AmpR表示氨芐青霉素抗性基因，五種限制酶的識別序列及切割位點如表所示，請回答以下問題：限制酶BamHⅠHaeⅢBclⅠSau3AⅠNotⅠ識別序列及切割位點(1)①過程常采用的方法是______________。(2)要將人乳鐵蛋白基因插入質粒，若只允許使用一種限制酶，應選擇的限制酶是________________。構建基因表達載體時，需要將人乳鐵蛋白基因嵌入__________________之間，這樣人乳鐵蛋白基因才能在乳腺細胞中表達。(3)據圖分析篩選含有重組質粒的受體細胞首先需要在含______________(填“四環素”“氨芐青霉素”或“四環素或氨芐青霉素”)的培養基上進行。(4)若BamHⅠ酶切的DNA末端與BclⅠ酶切的DNA末端連接起來，連接部位的6個堿基對序列為____________，對于該部位，這兩種酶____________(填“都不能”或“只有一種能”)切開。[解析](1)將目的基因導入動物細胞最有效的方法是顯微注射法。(2)根據表中五種酶的識別序列及切割位點可知，限制酶Sau3AⅠ還可以切割限制酶BclⅠ和限制酶BamHⅠ的識別序列，因此要將人乳蛋白基因插入載體，在只允許用一種限制酶切割載體和人乳鐵蛋白基因的情況下，應選擇限制酶Sau3AⅠ。構建基因表達載體時，需要將人乳鐵蛋白基因嵌入到啟動子和終止子之間，這樣人乳鐵蛋白基因才能在乳腺細胞中表達。(3)用限制酶Sau3AⅠ切割后會破壞四環素抗性基因，但不會破壞氨芐青霉素抗性基因，因此導入重組質粒的受體細胞可在含有氨芐青霉素的培養基上生存下來。(4)根據表格中各種限制酶的識別序列和切割位點可知，若BamHⅠ酶切的DNA末端與BclⅠ酶切的DNA末端連接起來，連接部位的6個堿基對序列為eq\a\vs4\al(TGATCC,ACTAGG)eq\a\vs4\al(或GGATCA,CCTAGT)，對于該部位，這兩種酶都不能切開。[答案](1)顯微注射法(2)Sau3AⅠ啟動子和終止子(3)氨芐青霉素(4)eq\a\vs4\al(TGATCC,ACTAGG)eq\a\vs4\al(或GGATCA,CCTAGT)都不能[對點練習]1．下列關于基因工程的敘述，正確的是()A．培育轉基因動物時選擇的受體細胞只能是動物的受精卵B．構建重組質粒時必須選擇相同的限制性內切核酸酶處理載體質粒與目的基因C．經檢測發現抗除草劑基因成功導入某抗鹽植物，該植物一定具有抗除草劑及抗鹽性狀D．用氯化鈣處理大腸桿菌，增加其細胞壁的通透性，可提高重組DNA分子的導入成功率解析：選D培育轉基因動物時選擇的受體細胞最好是動物的受精卵，也可以是胚胎干細胞或核移植形成的重組細胞，A錯誤；構建重組質粒時一般選擇相同的限制性內切核酸酶處理載體質粒與目的基因，也可以選擇不同的限制酶處理，但必須產生相同的黏性末端，B錯誤；目的基因成功導入受體細胞后不一定能成功表達，因此經檢測發現抗除草劑基因成功導入某抗鹽植物，該植物不一定具有抗除草劑及抗鹽性狀，C錯誤。2.紫苜蓿是一種重要的牧草。某研究團隊擬將耐鹽基因HAL1導入紫苜蓿中培育耐鹽牧草。具體實驗流程如圖所示。下列操作錯誤的是()A．可選用氯化鈣處理農桿菌，有利于重組Ti質粒導入農桿菌B．將農桿菌與苜蓿愈傷組織一起培養一段時間后，往往需要添加適量抗生素抑制農桿菌生長C．為確認轉基因苜蓿是否培育成功，需對苜蓿植株進行耐鹽檢測D．植物細胞具有全能性，所以誘導形成苜蓿幼苗的成功率與苜蓿愈傷組織的基因型無關解析：選D用氯化鈣處理農桿菌可使其處于易于吸收周圍環境中DNA分子的感受態，這樣有利于重組Ti質粒導入，A正確；將農桿菌與苜蓿愈傷組織一起培養一段時間后，需要用抑菌類抗生素抑制農桿菌的生長，以防止農桿菌過度生長對轉化組織產生毒害作用，B正確；要判斷耐鹽性的紫花苜蓿是否培育成功，還需進行個體水平的鑒定，即讓轉基因紫花苜蓿進行耐鹽性試驗，C正確；愈傷組織中導入目的基因改變了其遺傳物質，所以誘導形成苜蓿幼苗的成功率與苜蓿愈傷組織的基因型有關，D錯誤。3．TALEN是一種靶向基因操作技術，該技術利用了TAL靶向識別單元對靶向基因的識別作用和FokI蛋白對靶向基因的切割作用實現了對特定靶向基因的敲除。相關操作如下：(1)TAL靶向識別單元的構建。TAL靶向識別單元為間隔32個氨基酸的雙連氨基酸(即兩個相連的氨基酸)序列。不同的雙連氨基酸分別與靶向基因中的A、T、C、G有恒定的對應關系，根據靶向基因的堿基序列可以設計出雙連氨基酸序列。(2)目的基因的獲取與擴增。根據TAL靶向識別單元中雙連氨基酸序列和FokI蛋白的氨基酸序列，可按照__________________________________，最終合成目的基因(寫出具體步驟)。再通過PCR技術進行擴增。擴增前，需根據目的基因的核苷酸序列設計出____種引物；擴增時，需先加熱至90～95℃，再冷卻至50～60℃，再加熱至70～75℃，此操作的目的是__________________________________________________。(3)利用質粒和目的基因構建基因表達載體。在構建的基因表達載體中，啟動子應位于基因的上游，它是________________的部位；標記基因的作用是________________________________________________________________________。(4)目的基因的表達與檢測。目的基因進入受體細胞后，在受體細胞中維持穩定和表達的過程，稱為________。從分子水平上，通過______方法可檢測基因工程操作是否成功。(5)靶向基因的敲除。TAL靶向識別單元能夠識別特定的靶向基因序列，FokI蛋白能夠從被識別的靶向基因兩端切斷磷酸二酯鍵，從而將靶向基因從原雙鏈DNA上敲除。由此推測，FokI蛋白實際上是一種________。解析：(2)已知TAL靶向識別單元中雙連氨基酸序列和FokI蛋白的氨基酸序列，可先推測出信使RNA序列，再推測出目的基因的核苷酸序列，然后利用化學法以單個核苷酸為原料最終合成目的基因，再通過PCR技術進行擴增。PCR擴增前，需根據目的基因的核苷酸序列設計出2種引物；擴增時，需先加熱至90～95℃使DNA變性后解聚為單鏈，再冷卻至50～60℃使引物結合到互補DNA鏈上，再加熱至70～75℃促進DNA聚合酶發揮作用，開始互補鏈的合成。(3)在構建的基因表達載體中，有啟動子、終止子、目的基因、標記基因等，其中啟動子位于基因的首端，它是RNA聚合酶識別和結合的部位；標記基因的作用是鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來。(4)目的基因進入受體細胞后，在受體細胞中維持穩定和表達的過程，稱為轉化。分子水平上的檢測：①檢測轉基因生物染色體的DNA上是否插入目的基因：PCR技術；②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA：PCR技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質：抗原—抗體雜交技術。(5)FokI蛋白能夠從被識別的靶向基因兩端切斷磷酸二酯鍵，從而將靶向基因從原雙鏈DNA上敲除。由此推測，FokI蛋白實際上是一種限制性內切核酸酶。答案：(2)先推測出信使RNA序列，再推測出目的基因的脫氧核苷酸序列，利用化學法以單個核苷酸為原料2加熱使DNA變性后解聚為單鏈，冷卻使引物結合到互補DNA鏈上，再加熱促進DNA聚合酶發揮作用，開始互補鏈的合成(3)RNA聚合酶識別和結合鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來(4)轉化抗原—抗體雜交(或PCR技術)(5)限制性內切核酸酶(限制酶)eq\a\vs4\al(———————)eq\a\vs4\al(微點釋解二)———————————————————————————分析基因工程的應用————————————————————————————————————————乳腺生物反應器與工程菌生產藥物的區別比較內容乳腺生物反應器工程菌含義指讓外源基因在哺乳動物的乳腺中特異性表達，利用動物的乳腺組織生產藥物蛋白指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表達的菌類細胞株系受體基因結構與人類基因結構差異動物基因結構與人類的基因結構基本相同細菌和酵母菌的基因結構與人類有較大差異基因表達合成的藥物蛋白與天然蛋白質相同細菌合成的藥物蛋白可能沒有活性受體細胞動物受精卵微生物細胞目的基因導入方式顯微注射法Ca2＋處理法生產條件不需嚴格滅菌；溫度等外界條件對其影響不大需嚴格滅菌，嚴格控制工程菌所需的溫度、pH、營養物質濃度等外界條件藥物提取從動物乳汁中提取從微生物細胞或其培養液中提取[典例2](2021·廣東高考)非細胞合成技術是一種運用合成生物學方法，在細胞外構建多酶催化體系，獲得目標產物的新技術，其核心是各種酶基因的挖掘、表達等。中國科學家設計了4步酶促反應的非細胞合成路線(如圖)，可直接用淀粉生產肌醇(重要的醫藥食品原料)，以期解決高溫強酸水解方法造成的嚴重污染問題，并可以提高產率。回答下列問題：(1)研究人員采用PCR技術從土壤微生物基因組中擴增得到目標酶基因。此外，獲得酶基因的方法還有________________________________(答出兩種即可)。(2)高質量的DNA模板是成功擴增出目的基因的前提條件之一。在制備高質量DNA模板時必須除去蛋白，方法有____________________(答出兩種即可)。(3)研究人員使用大腸桿菌BL21作為受體細胞、pET20b為表達載體分別進行4種酶的表達。表達載體轉化大腸桿菌時，首先應制備________細胞。為了檢測目的基因是否成功表達出酶蛋白，需要采用的方法是________________________________________________________________________。(4)依上圖所示流程，在一定的溫度、pH等條件下，將4種酶與可溶性淀粉溶液混合組成一個反應體系。若這些酶最適反應條件不同，可能導致的結果是________________。在分子水平上，可以通過改變____________，從而改變蛋白質的結構，實現對酶特性的改造和優化。[解析](1)分析題干，研究人員從土壤微生物基因組中擴增得到目標酶基因采用了PCR技術，此外獲得酶基因的方法還有從基因文庫中獲取和人工合成法。(2)高質量的DNA模板是成功擴增出目的基因的前提條件之一。在制備高質量DNA模板時必須除去蛋白，可根據DNA和蛋白質的溶解性、對酶、高溫和洗滌劑的耐受性去除蛋白質，方法有鹽析法、酶解法或高溫變性法等。(3)研究人員使用大腸桿菌BL21作為受體細胞、pET20b為表達載體分別進行4種酶的表達。表達載體轉化大腸桿菌時，首先應制備感受態細胞，即利用Ca2＋處理大腸桿菌，使其成為易于接受外來DNA分子的感受態細胞。基因工程中，酶基因(目的基因)成功表達的產物酶蛋白的化學本質是蛋白質，常用抗原—抗體雜交技術進行檢測。(4)依題圖所示流程，在一定的溫度、pH等條件下，將4種酶與可溶性淀粉溶液混合組成一個反應體系。由于酶的作用條件較溫和，若這些酶最適反應條件不同，則可能導致有的酶失活而使反應中斷。在分子水平上，可以通過改變基因的堿基序列，從而改變蛋白質的結構，實現對酶特性的改造和優化。[答案](1)基因文庫中獲取、人工合成法(2)鹽析法、酶解法或高溫變性法(3)感受態抗原—抗體雜交技術(4)有的酶失活而使反應中斷基因的堿基序列[對點練習]4．核酸疫苗是將編碼某種抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)導入動物體細胞內，并通過宿主細胞的表達系統合成抗原蛋白，誘導宿主產生對該抗原蛋白的免疫應答，以達到預防和治療疾病的目的。如圖為針對某種RNA病毒抗原(S蛋白)研制DNA疫苗和RNA疫苗的思路。下列相關敘述正確的是()A．該疫苗中核酸可作為抗原刺激人體產生體液免疫B．步驟①中對S蛋白基因進行擴增，需要用到DNA聚合酶和解旋酶C．步驟②構建重組表達載體，其S基因應插入載體，只需不破壞標記基因D．核酸疫苗能在人體細胞中成功表達S蛋白，說明了生物界共用一套密碼子解析：選D該疫苗中核酸用來編碼抗原蛋白，核酸本身不能作為抗原刺激人體產生體液免疫，A錯誤；步驟①中對S蛋白基因進行擴增，利用的是PCR技術，該過程需要用到耐高溫的DNA聚合酶，不需要解旋酶，B錯誤；步驟②構建重組表達載體，其S基因應插入載體，不能破壞標記基因、啟動子序列和終止子序列等，C錯誤；核酸疫苗中的核酸源自病毒等病原體，其在人體細胞中能成功表達S蛋白，說明了生物界共用一套密碼子，D正確。5．應用生物工程技術可獲得人們需要的生物新品種或新產品。請據圖回答下列問題：(1)要獲得抗蟲基因，可采用____________________等方法，基因工程的核心是_____________________。(2)如果要獲得一只含目的基因的小鼠，則選擇的受體細胞通常是____________，原因是______________________。若用大腸桿菌儲存目的基因，則需先將其用________處理，使大腸桿菌細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態。(3)在培育轉人生長激素基因牛的過程中，①過程需要的工具酶是__________________，②過程常用的方法是______________。(4)轉人生長激素基因牛可通過分泌的乳汁來生產人生長激素，在基因表達載體中，人生長激素基因的首端必須含有______________。解析：(1)獲得目的基因的方法有PCR技術擴增、人工合成等，基因工程的核心是構建基因表達載體。(2)動物受精卵具有全能性，能發育成完整個體，要獲得一只含目的基因的小鼠，則選擇的受體細胞通常是受精卵。若用大腸桿菌儲存目的基因，則需先將其用Ca2＋處理，使大腸桿菌處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態。(3)①是目的基因與載體結合的過程，需要限制酶、DNA連接酶；②是重組質粒導入受體細胞的過程，常用的方法是顯微注射法。(4)基因表達載體的首端必須含有啟動子。答案：(1)PCR技術擴增、人工合成構建基因表達載體(2)受精卵動物受精卵具有全能性Ca2＋(3)限制酶、DNA連接酶顯微注射法(4)啟動子6．(2023·南昌模擬)藍細菌中的ictB蛋白能高效轉運和濃縮CO2從而提高細胞光合速率。我國科學家構建了葉片特異性啟動子Cab(葉綠體捕光色素蛋白Cab基因啟動子)驅動的藍細菌ictB基因表達載體，并通過農桿菌轉化法獲得了轉ictB基因水稻，大大提高了水稻的產量。在ictB基因載體的構建中，含Cab啟動子和ictB基因的重組DNA分子和Ti質粒的酶切位點如圖1所示。請回答下列問題：(1)為使重組DNA分子能定向插入T-DNA中，可用PCR的方法在重組DNA分子兩端添加限制酶識別序列，據圖可知，M端添加的序列所對應的限制酶是________，N端添加的序列所對應的限制酶是__________。經過酶切的重組DNA分子和Ti質粒進行連接時，可選用______________________(填“E.coliDNA連接酶”或“T4DNA連接酶”)。添加了限制酶識別序列的重組DNA分子與Ti質粒的重組過程共需要________種酶。(2)將農桿菌液浸泡過的水稻愈傷組織進行植物組織培養，培養基中需加入________進行篩選，最終獲得多個水稻株系a1、a2、a3、a4。對a1～a4四個水稻株系的ictB蛋白表達量進行測定，結果如圖2，其中a4株系ictB蛋白表達量較低的原因可能是________________________________。檢測應選用的植物器官是________，原因是____________________________________________________________________________________________________________。解析：(1)據圖可知，ictB基因中有BamHⅠ的酶切位點，故不能選擇BamHⅠ，又因為Sau3AⅠ也可識別BamHⅠ的酶切位點，故也不能選擇該酶，又由于SpeⅠ能切割Cab啟動子，也不能選擇，故只能選擇BglⅠ和EcoRⅤ，再根據啟動子的方向可知，M端添加的序列所對應的限制酶是BglⅠ，N端添加的序列所對應的限制酶是EcoRⅤ；由于EcoRⅤ酶切后是平末端，而T4DNA連接酶既能連接黏性末端也能連接平末端，故經過酶切的重組DNA分子和Ti質粒進行連接時，可選用T4DNA連接酶；添加了限制酶識別序列的重組DNA分子與Ti質粒的重組過程共需要4種酶，分別是BglⅠ、EcoRⅤ、T4DNA連接酶和Sau3AⅠ(切割載體，BglⅠ與Sau3AⅠ切割后的黏性末端一樣)。(2)由圖1可知潮霉素抗性基因位于Ti質粒的T-DNA上，隨T-DNA整合到水稻細胞的染色體DNA上，所以將農桿菌浸泡過的水稻愈傷組織進行植物組織培養，培養基中需加入潮霉素進行篩選，篩選出的愈傷組織可(再)分化形成叢芽，最終獲得多個轉基因水稻株系；蛋白質的表達量與基因的表達有關，故a4株系ictB蛋白表達量較低的原因可能是其沒有導入目的基因或者目的基因沒有表達；由于Cab啟動子是葉片特異性啟動子，它使ictB基因只能選擇性的在葉片中表達，故檢測應選用的植物器官是葉片。答案：(1)BglⅠEcoRⅤT4DNA連接酶4(2)潮霉素a4水稻株系中目的基因未表達葉片Cab啟動子是葉片特異性啟動子，它使ictB基因只能選擇性的在葉片中表達系統學習(三)蛋白質工程及DNA片段的擴增及電泳鑒定(固基點)主干知識·記準理清(一)蛋白質工程的原理和應用1．蛋白質工程的概念基礎蛋白質分子的結構規律及其與生物功能的關系目的合成滿足人類生產和生活需求的蛋白質手段基因改造或基因合成2.蛋白質工程的基本原理3．蛋白質工程的應用(1)醫藥工業方面：研發藥物，如延長干擾素的保存時間；降低小鼠單克隆抗體誘發免疫反應的強度。(2)其他工業方面：改進酶的性能或開發新的工業用酶。(3)農業方面：通過改造某些參與調控光合作用的酶，增加糧食產量；改造微生物蛋白質的結構，設計優良微生物農藥，增強防治病蟲害的效果。(二)DNA片段的擴增及電泳鑒定1．實驗基礎(1)PCR原理：利用了DNA的熱變性原理，通過調節溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結合。(2)電泳：DNA分子具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳。(3)PCR的產物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構象等有關。2．PCR實驗操作步驟3．DNA的測定凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300_nm的紫外燈下被檢測出來。————————————■鏈教材資料·發展科學思維■————————————1．(選擇性必修3P94正文拓展分析)對天然蛋白質進行改造，你認為應該直接對蛋白質分子進行操作，還是通過對基因的操作來實現？原因是什么？提示：應該通過對基因的操作來實現對天然蛋白質的改造。主要原因有：①蛋白質具有十分復雜的空間結構，基因的結構相對簡單，容易改造；②改造后的基因可以遺傳給下一代，被改造的蛋白質無法遺傳。2．(選擇性必修3P85“結果分析與評價”)電泳鑒定時未出現特異性條帶的原因有哪些？提示：模板DNA出現污染；TaqDNA聚合酶出現質量問題；引物特異性不強(如與非目的序列有同源性)或形成引物二聚體；復性時的溫度過低；PCR循環次數過多；等等。題點考法·練全練通考法(一)考查蛋白質工程的原理和應用1．某種病毒通過其表面刺突蛋白(S蛋白)的受體結合域(RBD)與人體細胞表面的ACE2受體相互作用，侵入人體細胞。研究人員設計并合成了一種自然界不存在的LCB1蛋白藥物，可識別并緊密結合S蛋白的RBD，以干擾該病毒的感染。下列敘述錯誤的是()A．LCB1可能與ACE2受體的某些區域結構類似B．LCB1可以依據S蛋白的RBD結構進行設計C．LCB1是通過細胞中原有的基因表達產生的D．LCB1設計和合成是通過蛋白質工程實現的解析：選C由題干信息可知，S蛋白的RBD與人體細胞表面的ACE2受體相互作用；而LCB1可識別并緊密結合S蛋白的RBD，阻止S蛋白的RBD與ACE2受體結合，這說明LCB1可能與ACE2受體的某些區域結構類似，LCB1可以依據S蛋白的RBD結構進行設計，A、B正確；LCB1是人工設計并合成的一種自然界不存在的蛋白質，故LCB1并不是通過細胞中原有的基因表達產生的，而基因工程在原則上只能生產自然界已存在的蛋白質，故LCB1設計和合成是通過蛋白質工程實現的，C錯誤，D正確。2．近年來，蛋白質工程與基因工程的結合使得干擾素生物工程的研究取得了更大的進展。回答下列有關生物工程生產干擾素的問題。(1)根據人們對干擾素結構和功能上的需求，將干擾素的第17位半胱氨酸替換成絲氨酸，這種生物工程屬于________________。(2)可通過點突變技術使干擾素基因中的堿基對發生改變，將改造后的基因與載體構建成__________后導入大腸桿菌生產干擾素。干擾素是一種糖蛋白，在大腸桿菌內不能加糖基團，這是因為________________________________________________________。用家蠶來生產干擾素更為理想，生產過程中，用到了家蠶核型多角體病毒(NPV)，NPV的作用是充當基因工程的________。(3)人們設想，如果能將干擾素基因導入哺乳動物的受精卵，再將受精卵進行______________至桑葚胚或囊胚階段，然后進行____________。可從轉基因動物分泌的乳汁中獲得干擾素，人們把這種轉基因動物稱為______________。若該設想變為現實，則干擾素的活性及產量均會大幅提高。解析：(1)根據人們對干擾素結構和功能上的需求，將干擾素的第17位半胱氨酸替換成絲氨酸，即改造蛋白質，因此這種生物工程屬于蛋白質工程。(2)將改造后的基因與載體構建成基因表達載體。干擾素是一種糖蛋白，在大腸桿菌內不能加糖基團，原因是糖基團是在內質網中加入的，而大腸桿菌為原核生物，細胞中無內質網。家蠶核型多角體病毒(NPV)可以充當基因工程的載體。(3)將目的基因導入哺乳動物的受精卵，再將受精卵進行早期胚胎培養至桑葚胚或囊胚階段，然后進行胚胎移植，可以獲得轉基因動物。可從轉基因動物分泌的乳汁中獲得干擾素，這種轉基因動物稱為乳腺生物反應器。答案：(1)蛋白質工程(2)基因表達載體糖基團是在內質網中加入的，大腸桿菌為原核生物，細胞中無內質網載體(3)早期胚胎培養胚胎移植乳腺生物反應器[歸納拓展]蛋白質工程與基因工程的區別和聯系項目蛋白質工程基因工程區別過程預期蛋白質功能→設計預期的蛋白質結構→推測應有的氨基酸序列→找到并改變相對應的脫氧核苷酸序列或合成新基因→獲得所需要的蛋白質獲取目的基因→構建基因表達載體→將目的基因導入受體細胞→目的基因的檢測與鑒定實質定向改造或生產人類所需的蛋白質定向改造生物的遺傳特性，以獲得人類所需的類型或生物產品結果可生產自然界沒有的蛋白質只能生產自然界已有的蛋白質聯系①蛋白質工程是在基因工程基礎上延伸出來的第二代基因工程②基因工程中所利用的某些酶需要通過蛋白質工程進行修飾、改造考法(二)考查DNA片段的擴增及電泳鑒定3．下列關于PCR操作過程的敘述，錯誤的是()A．PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌B．PCR利用了DNA的熱變性原理C．PCR所用的緩沖液和酶從冰箱拿出之后，迅速融化D．在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換解析：選C緩沖液和酶應分裝成小份，在－20℃儲存，使用前，將所需試劑從冰箱取出，放在冰塊上緩慢融化，C錯誤。4．下列有關電泳的敘述，錯誤的是()A．電泳是指帶電粒子在電場的作用下發生遷移的過程B．待測樣品中各種分子的形狀、大小及帶電性質的差異等會影響其在電泳中的遷移速度C．進行電泳時，帶電粒子會向著與其所帶電荷相同的電極移動D．常用的電泳方法是瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳解析：選C進行電泳時，帶電粒子會向著與其所帶電荷相反的電極移動，C錯誤。5．在基因工程操作過程中，科研人員利用識別兩種不同序列的限制酶(R1和R2)處理基因載體，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，結果如下圖所示。以下相關敘述中，不正確的是()A．該載體最可能為環狀DNA分子B．兩種限制酶在載體上各有一個酶切位點C．限制酶R1與R2的切點最短相距約200bpD．限制酶作用位點會導致氫鍵和肽鍵斷裂解析：選D當僅用一種限制酶切割載體時，僅產生一種長度的DNA片段，因此該載體最有可能為環狀DNA分子，A正確；當僅用一種限制酶切割載體時，兩種限制酶切割產生的DNA片段等長，而兩種限制酶同時切割時則產生兩種長度的DNA片段，所以兩種限制酶在載體上各有一個酶切位點，B正確；兩種限制酶同時切割時則產生600bp和200bp兩種長度的DNA片段，所以兩種限制酶的酶切位點最短相距200bp，C正確；限制酶切割DNA分子，破壞的是作用位點上兩個脫氧核糖核苷酸之間的磷酸二酯鍵，D錯誤。系統學習(四)生物技術的安全性和倫理問題(固基點)主干知識·記準理清1．轉基因產品的安全性2．關注生殖性克隆人(1)治療性克隆和生殖性克隆的比較。項目治療性克隆生殖性克隆概念利用克隆技術產生特定的細胞、組織和器官，用它們來修復或替代受損的細胞、組織和器官，從而達到治療疾病的目的通過克隆技術產生獨立生存的新個體目的用于醫學研究或治療疾病用于生育，產生新個體水平細胞水平個體水平聯系都屬于無性生殖，產生的新個體或新組織的遺傳物質均不發生變化(2)生殖性克隆人面臨的倫理問題。①生殖性克隆人“有違人類尊嚴”。②生殖性克隆人是人為地制造在心理上和社會地位上都不健全的人。③克隆技術還不成熟，生殖性克隆人會面臨流產、死胎和畸形兒等問題。(3)重要過程。3．試管嬰兒與設計試管嬰兒的異同點(1)不同點。①所用技術手段：設計試管嬰兒在胚胎移植前需進行遺傳學診斷(如診斷血型、診斷性別、診斷HLA的類型等)，試管嬰兒不需進行遺傳學診斷。如下圖，設計試管嬰兒比試管嬰兒多了d過程：②應用：試管嬰兒主要是解決不孕夫婦的生育問題，設計試管嬰兒用于白血病、貧血癥等疾病的治療。(2)相同點。都是體外受精，并進行體外早期胚胎培養，都要經過胚胎移植，都是有性生殖。4．生物武器(1)種類。①致病菌類：例如，炭疽桿菌、霍亂弧菌等。②病毒類：天花病毒，某些動物的痘病毒、通過基因工程改造的流感病毒等。③生化毒劑類：肉毒桿菌毒素等。(2)特點：致病能力強，攻擊范圍廣。(3)散布途徑：可以直接或者通過食物、生活必需品和帶菌昆蟲等散布，經由呼吸道、消化道和皮膚等侵入人、畜體內，造成大規模傷亡，也能大量損害植物。————————————■鏈教材資料·發展科學思維■————————————1．(選擇性必修3P106正文發掘)生殖性克隆與治療性克隆最主要的區別是什么？提示：克隆的目的不同，生殖性克隆的目的是用于生育，產生新個體；治療性克隆的目的是治療人類疾病。2．(選擇性必修3P112正文發掘)我國對待生物武器的態度與轉基因產品安全性的態度有何不同？提示：對待生物武器的態度是在任何情況下不發展、不生產、不儲存生物武器，并反對生物武器及其技術和設備的擴散。對待轉基因產品安全性的態度是趨利避害，而不能因噎廢食。題點考法·練全練通考法(一)考查生物技術的安全性1．下列哪項是轉基因生物存在安全性問題的證據？()A．世界上數億計的人口食用轉基因農作物B．轉基因生物合成的營養物質與天然品種“沒有差別”C．轉基因生物合成的某些蛋白質可能對某些人造成過敏反應D．轉基因產品經過了多環節、嚴謹的安全性評價解析：選C轉基因生物合成的某些蛋白質可能對某些人造成過敏反應，是轉基因生物存在安全性問題的證據，C符合題意。2．為了防止轉基因作物的目的基因通過花粉轉移給自然界中的其他植物，科學家設法將目的基因整合到受體細胞的葉綠體基因組中，其原因是()A．葉綠體基因組不會進入到生殖細胞中B．受精卵中的細胞質幾乎全部來自卵細胞C．轉基因植物與其他植物間不能通過花粉發生基因交流D．植物雜交的后代不會出現一定的性狀分離比解析：選B受精卵中的細胞質幾乎全部來自卵細胞，精子中幾乎不含葉綠體基因組，即葉綠體中的目的基因不會通過花粉傳遞給下一代，將目的基因導入葉綠體基因組中可防止造成基因污染，B正確。考法(二)考查生物技術的倫理問題3．(2023·浙江1月選考)以哺乳動物為研究對象的生物技術已獲得了長足的進步。對生物技術應用于人類，在安全與倫理方面有不同的觀點，下列敘述正確的是()A．試管嬰兒技術應全面禁止B．治療性克隆不需要監控和審查C．生殖性克隆不存在倫理道德方面的風險D．我國不贊成、不允許、不支持、不接受任何生殖性克隆人實驗解析：選D試管嬰兒是允許的，A錯誤；治療性克隆需要監控和審查，B錯誤；生殖性克隆存在倫理道德方面的風險，C錯誤；我國不贊成、不允許、不支持、不接受任何生殖性克隆人實驗，D正確。4．第三代試管嬰兒技術也稱胚胎植入前遺傳學診斷(PGD)，是在試管嬰兒技術基礎上出現的。精子和卵子形成受精卵發育成早期胚胎后，要在植入子宮前進行基因檢測，再進行胚胎移植。目前PGD能診斷一些單基因缺陷引發的疾病，如血友病等。回答有關問題：(1)試管嬰兒技術包括____________、早期胚胎培養和胚胎移植。(2)試管嬰兒技術操作時，首先要采集“卵子”。在采集“卵子”之前，需要給母親注射適量的促性腺激素。目的是__________________。從母親的卵巢中采集的“卵子”________(填“能”或“不能”)直接參與受精作用。在精子入卵后，會立即發生______________，拒絕其他精子再進入卵內。(3)受精卵發育成4或8細胞胚時，若要進行血友病基因檢測，可采用的檢測技術有____________________________(答出2點)。(4)胚胎移植的實質是_______________________________________________________。(5)隨著第三代試管嬰兒技術的不斷發展，將為不孕及基因缺陷患者帶來福音。如果濫用該技術，將會對社會產生負面影響，濫用的表現有________________________________________________________________________。解析：(1)試管嬰兒技術包括體外受精、早期胚胎培養和胚胎移植。(2)試管嬰兒技術操作時，給母親注射適量的促性腺激素，目的是促進母親超數排卵，獲得更多的卵細胞。從卵巢中采集的“卵子”不能直接參與受精作用，需在體外經人工培養成熟后，才能與獲能的精子受精。在精子入卵后，卵細胞膜會立即發生卵細胞膜反應，拒絕其他精子再進入卵內。(3)對胚胎細胞進行基因檢測，可采用PCR技術對目標基因進行擴增，或制備分子探針進行(DNA)分子雜交進行檢測。(4)胚胎移植的實質是早期胚胎在相同生理狀態下空間位置的轉移。(5)濫用第三代試管嬰兒技術的表現主要為設計嬰兒的性別。答案：(1)體外受精(2)促進母親超數排卵不能卵細胞膜反應(3)(DNA)分子雜交、PCR(4)早期胚胎在相同生理狀態下空間位置的轉移(5)設計嬰兒的性別[課時驗收評價]1．若要使目的基因在受體細胞中表達，需要通過質粒載體而不能直接將目的基因導入受體細胞，其原因不包括()A．目的基因無法插入受體細胞DNAB．目的基因無法復制C．目的基因無轉錄所需的啟動部位D．目的基因與受體細胞遺傳信息傳遞方式不同解析：選D不能直接將目的基因導入受體細胞，原因是目的基因無復制原點，無表達所需的啟動子。2．下列有關生物技術與倫理的說法錯誤的是()A．生命科學的發展必須受倫理的規范和制約B．實施生命科學研究必須遵循：自主、不傷害、善行和公正的原則C．關注倫理問題，就是完全限制生命科學的發展D．對于生物技術應科學地控制，合理地使用，使它的發展對人類最有益解析：選C關注倫理問題，并不是完全限制生命科學的發展。對于生物技術，人類所面臨的關鍵問題是如何科學地進行控制，并合理地使用，使它的發展對人類最有益。3．蛋白質工程是在基因工程的基礎上延伸出來的第二代基因工程，有廣闊的發展前景。下列關于蛋白質工程的敘述正確的是()A．由于需要對蛋白質直接改造，因此操作更難B．由于蛋白質不能遺傳，因此蛋白質工程的產物不能大量生產C．蛋白質工程也需要設計出相應的基因D．蛋白質工程發展得已經非常成熟，在各個領域有廣泛應用解析：選C蛋白質工程是在基因工程的基礎上延伸出來的第二代基因工程，是在分子水平上對基因分子直接進行操作，使其遺傳物質發生改變，可以遺傳給下一代，A、B錯誤；蛋白質工程對基因分子直接進行操作，需要推測出應有的氨基酸序列，設計出相應的基因，C正確；蛋白質工程的發展并不成熟，仍需一段時間提升，其目前并不能在各個領域廣泛應用，D錯誤。4．幾丁質是許多真菌細胞壁的重要成分，幾丁質酶可催化其水解。將幾丁質酶基因轉入菊花體內，可增強其抗真菌病的能力。下列有關敘述錯誤的是()A．將幾丁質酶基因插入Ti質粒的T-DNA上構建表達載體B．可通過顯微注射法將農桿菌導入菊花受體細胞C．可用PCR等技術檢測目的基因是否成功導入D．可用真菌接種實驗檢測轉基因菊花對真菌的抗性程度解析：選BTi質粒的T-DNA可以轉移到受體細胞中，并且整合到受體細胞染色體DNA上，根據這一特點，構建表達載體時，應該將目的基因即幾丁質酶基因插入到Ti質粒的T-DNA上，A正確；可通過農桿菌轉化法將農桿菌導入菊花受體細胞，顯微注射法常用于將目的基因導入動物受精卵中，B錯誤；可用PCR等技術檢測目的基因是否成功導入受體細胞，C正確；根據題干信息“幾丁質酶基因轉入菊花體內，可增強其抗真菌病的能力”，故可用真菌接種實驗檢測轉基因菊花對真菌的抗性程度，D正確。5．限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的識別序列及其切割位點分別為：—eq\o(C,\s\up6(↓))AATTG—和—eq\o(G,\s\up6(↓))AATTC—。如圖表示某一目的基因片段與質粒拼接形成重組質粒的過程，下列相關敘述錯誤的是()A．用限制酶EcoRⅠ切割目的基因，同時用限制酶MunⅠ切割質粒B．兩種限制酶切割后形成的黏性末端的堿基可以互補配對C．限制酶能使特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開D．將重組質粒同時用2種限制酶切割則會形成2種DNA片段解析：選D由圖可知，目的基因兩側都是限制酶EcoRⅠ的切割位點，因此應選用限制酶EcoRⅠ切割含有目的基因的外源DNA分子；質粒中含有限制酶MunⅠ和EcoRⅠ的切割位點，但EcoRⅠ的切割位點位于標記基因中，用其切割會破壞標記基因，因此為保證重組質粒表達載體的準確構建，應選用限制酶MunⅠ切割質粒，A正確。將重組質粒同時用2種限制酶切割，則會形成3種DNA片段，D錯誤。6．利用人胰島B細胞構建cDNA文庫，然后通過核酸分子雜交技術從中篩選目的基因，篩選過程如圖所示。下列說法錯誤的是()A．該文庫保存的人類基因沒有完整的基因結構B．探針通常用熒光或者放射性同位素進行標記C．不能用PCR技術從該文庫篩選出目的基因D．該基因文庫還可能存在呼吸酶的相關基因解析：選C由于cDNA文庫是以mRNA為模板，經逆轉錄酶催化，在體外逆轉錄成cDNA，所以形成的cDNA中只包含基因結構中編碼區的部分序列，即該文庫保存的人類基因沒有完整的基因結構，A正確；探針是可以與被檢測的目的基因序列進行堿基互補配對的帶標記的單鏈DNA片段，標記可以是熒光或者放射性同位素，B正確；凡是在胰島B細胞內表達的基因，都可以用PCR技術從該文庫篩選出目的基因，C錯誤；由于呼吸酶基因在胰島B細胞內能夠表達，所以該基因文庫還可能存在呼吸酶的相關基因，D正確。7．OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四個基因分別編碼四種不同的酶，研究人員將這些基因分別與葉綠體轉運肽(引導合成的蛋白質進入葉綠體)基因連接，構建多基因表達載體(載體中部分序列如圖所示)，利用農桿菌轉化法轉化水稻，在水稻葉綠體內構建了一條新代謝途徑，提高了水稻的產量。下列敘述正確的是()A．可用抗原—抗體雜交技術檢測四種酶在轉基因水稻中的表達量B．四個基因轉錄時都以DNA的同一條單鏈為模板C．應選用含卡那霉素的培養基篩選被農桿菌轉化的水稻細胞D．四個基因都在水稻葉綠體內進行轉錄翻譯解析：選A可用抗原—抗體雜交技術檢測四種酶在轉基因水稻中的表達量，雜交帶相對量越多，表明目的基因翻譯成的蛋白質含量越高，A正確；由題圖可知，在同一個T-DNA中OsGLO1啟動子啟動轉錄的方向與其他三個基因的不同，四個基因轉錄時并不都以DNA的同一條單鏈為模板，B錯誤；卡那霉素抗性基因不在T-DNA中，而潮霉素抗性基因在T-DNA中，應選用含潮霉素的培養基篩選被農桿菌轉化的水稻細胞，C錯誤；由題意知，利用農桿菌轉化法轉化水稻，可使目的基因插入到水稻細胞中染色體的DNA上，所以與葉綠體轉運肽基因連接的四個基因，在水稻細胞核內進行轉錄，在核糖體中進行翻譯，D錯誤。8．矮牽牛花瓣紫色的深淺由花青素的含量高低決定，花青素由查耳酮合酶(CHS)催化合成。為獲得紫色更深的矮牽牛，科研人員將CHS基因導入野生型紫花矮牽牛葉肉細胞中，得到的轉基因植株花色反而出現了淺紫色。下列敘述正確的是()A．可以從矮牽牛的幼嫩葉肉細胞中用逆轉錄酶和PCR技術相結合，獲取CHS基因B．農桿菌轉化法和基因槍法都可以將獲得的CHS基因直接導入葉肉細胞中完成轉化過程C．可以用同位素標記的CHS基因檢測目的基因是否成功導入葉肉細胞D．轉基因植株花色為淺紫色的原因可能是CHS基因與載體反向連接，轉錄出的mRNA與內源基因的mRNA互補解析：選DCHS基因只在花瓣細胞中表達，因此可以從矮牽牛的花瓣細胞中用逆轉錄酶和PCR技術相結合，獲取CHS基因，A錯誤；將目的基因導入受體細胞前都需要先構建基因表達載體，因此農桿菌轉化法和基因槍法都不可以將獲得的CHS基因直接導入葉肉細胞中完成轉化過程，B錯誤；葉肉細胞本身就含有CHS基因，因此不可以用同位素標記的CHS基因檢測目的基因是否成功導入葉肉細胞，C錯誤。9．科學研究發現Notch基因編碼一類高度保守的細胞表面受體，通過與其相應的配體結合調控細胞增殖、分化和凋亡等。為了研究Notch基因表達產物的功能，科學家構建含Notch基因的重組質粒，并在大腸桿菌中表達。下列相關分析錯誤的是()A．可以用逆轉錄的方法和PCR技術獲得Notch基因B．利用PCR技術擴增目的基因時，高溫代替了解旋酶的功能C．可通過核酸分子雜交的方法判斷導入的基因是否成功表達D．基因表達載體的構建是基因工程的核心解析：選C獲取目的基因的方法有從基因文庫中獲取、利用PCR擴增、人工合成等，故可以用逆轉錄的方法和PCR技術獲得Notch基因，A正確；利用PCR技術擴增目的基因時，高溫變性可以將DNA雙鏈打開，代替解旋酶的功能，B正確；判斷導入的基因是否成功表達，需要用抗原—抗體雜交技術，C錯誤。10．構建基因表達載體時，可利用堿性磷酸單酯酶催化載體的5′-P變成5′-OH，如圖所示。將經過該酶處理的載體與外源DNA連接時，由于5′-OH與3′-OH不能連接而形成切口(nick)。下列說法錯誤的是()A．經堿性磷酸單酯酶處理的載體不會發生自身環化B．外源DNA也必須用堿性磷酸單酯酶處理C．T4DNA連接酶可連接黏性末端和平末端D．重組DNA經過2次復制可得到不含nick的子代DNA解析：選B將經過該酶處理的載體與外源DNA連接時，由于5′-OH與3′-OH不能連接而形成切口(nick)，因此經堿性磷酸單酯酶處理的載體不會發生自身環化，A正確；外源DNA不能用堿性磷酸單酯酶處理，如用堿性磷酸單酯酶處理，載體與外源DNA不能連接形成重組DNA，B錯誤；T4DNA連接酶可連接黏性末端和平末端，C正確；DNA是半保留復制，重組DNA經過2次復制，可得到2個不含nick的子代DNA，D正確。11．B基因存在于水稻基因組中，其僅在體細胞(2n)和精子(n)中正常表達，在卵細胞中不轉錄。為研究B基因表達對卵細胞的影響，設計了如下圖實驗(Luc基因表達的熒光素酶能催化熒光素產生熒光，融合基因表達的蛋白質能保留兩種蛋白質各自的功能)。下列相關敘述錯誤的是()A．由于DNA聚合酶不能合成導致B基因在水稻卵細胞中不能轉錄B．過程①中T-DNA以雙鏈形式整合到受體細胞的染色體DNA上C．過程②轉化篩選水稻愈傷組織時，需在培養基中加入潮霉素D．可通過檢測加入熒光素的卵細胞中是否發出熒光來鑒定B基因是否表達解析：選A轉錄過程不需要DNA聚合酶，需要RNA聚合酶，A錯誤；由圖可知，過程①中T-DNA以雙鏈形式整合到受體細胞的染色體DNA上，B正確；由圖可知，T-DNA上含有潮霉素抗性基因，因此過程②轉化篩選水稻愈傷組織時，需在培養基中加入潮霉素，C正確；由圖可知B基因與Luc基因連接形成B-Luc融合基因，因此可通過檢測加入熒光素的卵細胞中是否發出熒光來鑒定B基因是否表達，D正確。12．(2022·湖南高考)水蛭是我國的傳統中藥材，主要藥理成分水蛭素為水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。擬通過蛋白質工程改造水蛭素結構，提高其抗凝血活性。回答下列問題：(1)蛋白質工程流程如圖所示，物質a是________，物質b是________。在生產過程中，物質b可能不同，合成的蛋白質空間構象卻相同，原因是__________________。(2)蛋白質工程是基因工程的延伸，基因工程中獲取目的基因的常用方法有____________________、____________________和利用PCR技術擴增。PCR技術遵循的基本原理是_________________________________________________________________。(3)將提取的水蛭蛋白經甲、乙兩種蛋白酶水解后，分析水解產物中的肽含量及其抗凝血活性，結果如圖所示。推測兩種處理后酶解產物的抗凝血活性差異主要與肽的__________(填“種類”或“含量”)有關，導致其活性不同的原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(4)若要比較蛋白質工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解產物和天然水蛭素的抗凝血活性差異，簡要寫出實驗設計思路__________________________________________________________________________________________________________________。解析：(1)據題圖分析可知，物質a是氨基酸序列(多肽鏈)，物質b是mRNA。在生產過程中，物質b可能不同，合成的蛋白質空間構象卻相同，原因是密碼子的簡并性，即一種氨基酸可能有幾種密碼子。(2)蛋白質工程是基因工程的延伸，基因工程中獲取目的基因的常用方法有從基因文庫中獲取目的基因、通過DNA合成儀用化學方法直接人工合成和利用PCR技術擴增。PCR技術遵循的基本原理是DNA雙鏈復制。(3)將提取的水蛭蛋白經甲、乙兩種蛋白酶水解后，據圖可知，水解產物中的肽含量隨著酶解時間的延長均上升，且差別不大；而抗凝血活性有差異，經酶甲處理后，隨著酶解時間的延長，抗凝血活性先上升后相對穩定，經酶乙處理后，隨著酶解時間的延長，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲處理后的酶解產物的抗凝血活性