流式細胞學在血液病中的臨床應用〔根底篇〕1精選ppt流式細胞術的根本概念流式細胞術是一項集激光技術、流體力學技術、光電測量技術、計算機技術以及細胞熒光化學技術、單克隆抗體技術為一體的新型高科技技術。快速、準確、客觀，多參數，可同時對特定群體加以分選。研究對象為生物顆粒，如各種細胞、微生物及人工合成微球等。研究的微粒特性包括多種物理及生物學特征，并加以定量。

是當代最先進的細胞定量分析技術

2精選ppt白血病和淋巴瘤的免疫分型微量殘留白血病細胞檢查陣發性睡眠性血紅蛋白尿多發性骨髓瘤干細胞計數腫瘤細胞的周期和倍體分析網織紅細胞和網織血小板計數免疫狀態監測血小板功能及相關疾病HLA-B27流式細胞儀的臨床應用3精選ppt標本來源：外周血、骨髓、組織塊、培養細胞、脫落細胞及其他血清或各類體液樣本。肝素抗凝的外周血和骨髓標本，存放時限為48～72小時；EDTA抗凝標本，存放時限只有12～24小時，因為髓細胞在此條件下會裂解；4精選ppt直方圖散點圖二維等高圖密度圖常見的幾種流式細胞圖5精選ppt設門淋巴細胞亞群6精選ppt一：白血病免疫分型7精選ppt白血病診斷依賴于多種檢測方法樣本形態學流式細胞術細胞遺傳學/FISH分子生物學根底和金標準

必需

重要8精選ppt急性白血病免疫分型的價值區分淋系、髓系白血病區分淋系白血病中的T、B-ALL鑒定混合細胞性白血病的類型：

T-M、B-M、T-B、T-B-M治療過程中監測MRD，評價療效提示某些遺傳學異常：CD19+AML---t(8;21)；CD13+CD33+B-ALL---t(9;22)提示預后：CD56等陽性的AML患者預后不良CD15陽性的AML患者CR率高

9精選ppt正常造血細胞各系列抗原表達的演進不管是在胚胎期、老年期、還是化療以后，正常造血細胞抗原組合的表達模式都不改變。10精選ppt白血病細胞外表抗原異常表達造血細胞抗原組合的表達模型能夠用于鑒別惡性克隆!白血病克隆與正常細胞之間抗原表達不同---白血病相關的免疫表型〔LAIP〕11精選ppt正常造血細胞白血病細胞抗原表達遵循系列保守性出現抗原跨系表達髓系:CD33+,T系:CD7+髓系:CD33+CD7+抗原表達有一定的時序性出現抗原時序混亂表達原始細胞:CD34+CD15- 原始細胞:CD34+CD15+各階段細胞按一定的比例分布出現分化阻滯原幼細胞<5%原幼細胞>20%

抗原表達的缺失抗原強度的異常

12精選ppt需要掌握正常造血細胞的抗原表達規律不同系列的細胞表達的抗原？同一系列不同階段的細胞表達的抗原？每種抗原的表達強度？13精選ppt免疫分型常用的抗體干祖細胞CD34、TDT、CD117、CD38、HLA-DR、AMLCD33、CD13、CD11b、CD15、CD64、CD14、MPO疑心M6加做CD71、GPA疑心M7加做CD61、CD41、CD42B-ALLCD10、CD19、CD20、CD22、c/mIg、cCD22/CD79aT-ALLCD10、CD3、CD4、CD8、CD2、CD5、CD7、CD1a、cCD3NK細胞CD16、CD56、CD57漿細胞CD38、CD138、cκ、cλ、CD19、CD5614精選ppt根據骨髓細胞CD45/SSC圖中分布情況設門圈定各類細胞R1門為成熟淋巴細胞R2門為正常單核細胞位置R3門正常粒細胞位置R4門為幼稚淋巴細胞出現位置R5門為有核紅細胞或細胞碎片位置R6門為幼稚髓細胞出現位置白血病細胞通常會在R4R6兩門位置處出現正常成人骨髓樣本----CD45設門15精選pptAML-M116精選pptAML-M217精選pptAML-M318精選ppt結論：ANLL,建議結合染色體和分子生物學和形態學診斷M3。

19精選ppt結論：ANLL，伴單核細胞分化，免疫表型符合M4。20精選ppt結論：ANLL，伴單核細胞分化，免疫表型符合M5。21精選ppt結論：ANLL，建議結合形態學以確診M6。

22精選pptAML-M723精選pptB-ALL24精選pptT-ALL25精選pptEGILScoringSystemForBAL(>2points)ScoreB-lymphoidT-lymphoidMyeloid2CD79aCD3MPOcCD22Anti-TCRa/bAnti-TCRg/d1CD19CD2CD117CD20CD5CD13CD10CD8CD33CD10CD650.5TdTTdTCD14CD7/1aCD15/6426精選pptRequirementsforassigningmorethanonelineagetoasingleblastpopulationMyeloidlineageMyeloperoxidase(flowcytometry,immunohistochemistryorcytochemistry)orMonocyticdifferentiation(atleast2ofthefollowing:NSE,CD11c,CD14,CD64,)TlineageCytoplasmicCD3(flowcytometrywithantibodiestoCD3epsilonchain;immunohistochemistryusingpolyclonalanti-CD3antibodyzetachain,whichisnotT-cellspecific)orSurfaceCD3(rareinmixedphenotypeacuteleukemia)BlineageStrongCD19withatleast1ofthefollowingstronglyexpressed:CD79a,cytoplasmicCD22,CD10orWeakCD19withatleast2ofthefollowingstronglyexpressed:CD79a,cytoplasmicCD22,CD10MPAL(mixedphenotypeacuteleukemia)WHO202127精選pptCD19+CD22+CD10-CD15+(B-lineageALL)B-negative,CD64+CD14+/-CD33+(MonocyticLeukemia)TwoLeukemicPopulationsMonoblastsLymphoblasts結論：急性混合細胞白血病(AM-LL)28精選ppt二.白血病微小殘留病灶

〔MRD〕目的：判斷預后，指導個體化分層治療，預測復發29精選pptB-ALL:多數表達CD34、CD38dim、TDT、CD19、CD10str、CD20,這些標志的任意組合CD34/CD22、CD34/CD20、TDT/CD10等，也可加上某些異常標志如CD13、CD33、CD15即可將ALL細胞與正常骨髓和外周血細胞分開〔60～80%〕。T-ALL:TDT結合T細胞外表標志如CD5或CD3，加上cCD3(90%).30精選pptAML:CD34、CD56、CD15在內的多種組合，表達TDT、CD13、CD33與散射光及抗原密度，可確定殘留的AML細胞〔70～80%〕31精選pptLEUKEMIAATDIAGNOSISNORMALDAY290.039%32精選ppt2021.4.21,原始細胞占79.2%2021.5.18，MRD:1.09%CD19/CD33/CD10/CD2033精選ppt34精選ppt三.成熟淋巴細胞增殖性疾病35精選ppt慢性淋巴細胞白血病幼稚淋巴細胞白血病毛細胞白血病脾邊緣區淋巴瘤大顆粒淋巴細胞白血病皮膚T細胞淋巴瘤相關白血病…………循環淋巴細胞增殖性疾病這類疾病必須有流式細胞術的輔助診斷！36精選ppt正常淋巴細胞淋巴細胞增殖性疾病(克隆擴增)TBNKoror確定克隆來源！37精選pptB-LPD:B淋巴細胞出現輕鏈的單一抑制性表達；

T/NK-CLPD:由于缺乏單克隆的標記物，通過FCM診斷成為難點。38精選ppt正常單克隆雙克隆單克隆CD20+細胞39精選pptCD19+淋巴細胞增多的鑒別診斷DighieroG,HamblinTJ.Lancet,2021,371(March22),1017B-LPD(lymphoproliferativedisease)40精選ppt結論：CLL/SLL.41精選ppt結論：慢性B淋巴細胞增殖性疾病，建議進一步FISH檢測t(11;14)以確診MCL.42精選ppt結論：免疫表型符合HCL,建議結合形態學和臨床明確診斷。43精選ppt44精選ppt1、前驅T淋巴母細胞白血病/淋巴瘤〔T-ALL/T-LBL〕2、母細胞性NK細胞淋巴瘤3、慢性前淋巴細胞白血病/淋巴瘤〔T-CLL/T-PLL〕4、顆粒淋巴細胞白血病〔T-LGL〕5、侵襲性NK細胞白血病〔ANKCL〕6、成人T細胞淋巴瘤/白血病〔ATCL/L〕7、節外NK/T細胞淋巴瘤，鼻型〔NK/TCL〕8、腸病型T細胞淋巴瘤〔ITCL〕9、肝脾γδT細胞淋巴瘤10、皮下脂膜樣T細胞淋巴瘤11、菌樣霉菌病/賽塞里(Sezary)綜合征(MF/SS)12、間變性大細胞淋巴瘤(ALCL),T和非T非B細胞,原發性皮膚型13、周圍T細胞淋巴瘤(PTL)14、血管免疫母細胞T細胞淋巴瘤(AITCL)15、間變性大細胞淋巴瘤(ALCL),T和非T非B細胞,原發性全身型WHO2021成熟T/NK細胞腫瘤淋巴增殖性疾病分類45精選ppt免疫表型特征46精選ppt1.光散射信號的異常：FS

47精選ppt2.抗原喪失75％成熟腫瘤T細胞會喪失正常抗原CD7是最易發生喪失的抗原CD2和CD5也是經常發生喪失的抗原48精選ppt3.抗原表達異常：如：伴CD10＋49精選ppt4.抗原表達強度異常：

50精選ppt正常：CD4/CD8=1.5-2.5:1腫瘤細胞出現CD4或CD8某一個群體的限制性表達模式：

CD4+,CD8-CD4-,CD8+CD4+CD8+CD4-CD8-

多見5.細胞群體數量的異常增加以及抗原的限制性表達：51精選ppt52精選ppt常見T-CLPD免疫表型T-幼稚淋巴細胞白血病(T-PLL〕通常CD4+orCD4+CD8+,PB:>55%幼淋細胞杭XX,女/60,結果：異常淋巴細胞占47.4%，表達CD3-cCD3+CD4+CD8+CD5-占比例47.4%，表型符合T-PLL.53精選ppt血管免疫母細胞淋巴瘤(AITCL):CD4+CD2+CD5+CD10+CD26-,CD7-,CD3-常見T-CLPD免疫表型54精選ppt患者，丁XX,男/59

淋巴結骨髓結論:異常T淋巴細胞占78%,抗原表達異常(CD3-CD4+CD7-CD10+CD2+CD5+),提示T-CLPD55精選ppt外周T細胞淋巴瘤〔PTCL〕骨髓侵犯:CD4+,多數CD7-and/orCD5-常見T-CLPD免疫表型56精選ppt成人T細胞淋巴瘤〔ATLL〕:CD4+CD2+,其他T系抗原可有缺失局部伴有髓系抗原表達：CD13，CD33，CD15外周血：多形核淋巴細胞確診：HTLV-1基因陽性

常見T-CLPD免疫表型57精選pptT-LGLCD4+orCD8+，伴有NK抗原表達CD16+，CD57+，局部CD56+形態學：大顆粒淋巴細胞常見T-CLPD免疫表型58精選pptTCRVβ限制性表達1.包含24種抗體，兩種熒光素，識別70％Vβ亞家族；2.在診斷和MRD監測中的作用59精選ppt60精選ppt61精選pptSTRUCTUREOFTCELLRECEPTORBecauseTCRisapartofCD3complex,vbetaanalysiscannotbeusedforsurfaceCD3-negativeTcells.62精選ppt局部病例運用免疫標記物難以將惡性成熟T淋巴細胞從正常T淋巴細胞中精確鑒別(反響性或克隆性)。原因：1.腫瘤細胞被反響性T細胞掩蓋2.CD8+占優勢群體還見于：V感染(AIDS,EBV)，BMT后

臨床特點對診斷更為重要！63精選ppt流式診斷NK細胞淋巴瘤典型：CD2+,CD16+,CD56+,CD122+,CD3-沒有特征性抗體區分腫瘤和反響性NK細胞：數量以及FSKIR：KIRs、CD94/NKG2；均一性表達KIR同種型64精選ppt四.陣發性睡眠性血紅蛋白尿65精選ppt陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥〔PNH〕糖基化磷脂酰肌醇錨〔GPI〕連接的錨連蛋白缺乏補體介導的血管內溶血為特征的獲得性造血干細胞克隆性疾病磷脂酰肌醇聚糖A(PIG－A)基因突變PIG－A基因突變對補體敏感性增高溶血錨連蛋白：補體調節蛋白CD55、CD59、CD16、CD24、CD14、Flaer等66精選ppt樣本收集：優先選擇外周血，不推薦骨髓抗凝劑:EDTA、肝素RBC最多可存放至7天WBC必須在48小時內檢測〔粒細胞上的抗原表達和散射會隨著時間而改變〕CCS指南推薦對>2種細胞系進行檢測

標本類型

抗凝劑標本儲存67精選ppt常規檢測：敏感度1%，獲取5000個目的細胞高敏檢測：敏感度0.01%，獲取250，000個目的細胞中性粒細胞：必做紅細胞：中性粒細胞檢出PNH克隆時必做，或全部標本都做，但單獨檢測不推薦單核細胞：可提供穩定的結果淋巴細胞：不推薦細胞獲取目的細胞68精選ppt抗體的選擇僅檢測CD55/CD59------不推薦敏感性：5-10%(Sutherlandandal,CytometryPartB72B:167-177)Flaer-----組成高特異性的PNHPanel

69精選ppt紅細胞分析：優點：與WBC相比，RBC檢測能更好地鑒別II型細胞。缺點：輸血和溶血會造成PNH克隆大小檢測值偏低。

單檢測紅細胞不能充分評估PNHI型：正常紅細胞II型：CD59局部缺失的PNH克隆III型：CD59完全缺失的PNH克隆70精選ppt同個患者的紅細胞和粒細胞檢測結果粒細胞PNH克隆：54.5%紅細胞PNH克隆：6.1%溶血/輸血對PNH克隆大小的影響71精選ppt紅細胞分析-----抗體選擇和分析CD59優于CD55CD59在紅細胞上的表達水平遠高于CD55結果分析：PNH細胞比較多時，適合使用直方圖異常細胞數少時，適合使用散點圖同一個患者，CD59能區分出II型和III型細胞，CD55那么不能紅細胞PNH克隆很少時，適合散點圖分析72精選ppt中性粒細胞和單核細胞都可以檢測。不適宜采用淋巴細胞白細胞分析-----

檢測PNH克隆最好的方法

73精選pptCD59—最早用于檢測粒系PNH克隆的標記物FLAER-能和WBC上所有的GPI錨連蛋白特異性結合：當前成為最正確標記物CD14是表達在單核細胞上的GPI錨連蛋白，用于檢測單核細胞的PNH克隆。CD24是表達在粒細胞上的GPI錨連蛋白，用于檢測粒細胞的PNH克隆。白細胞分析-----

檢測PNH克隆最好的方法

74精選ppt什么是FLAER?FLAER(FLuorescentAERolysin〕，熒光標記的嗜水氣單胞菌溶素，它不是單克隆抗體，而是滅活的細菌蛋白質，能和WBC上所有的GPI錨連蛋白特異性結合。FLAERCD24FLAERCD1475精選pptICCSPNH指南:WBC檢測的組合Colors細胞類型1234563colorGFLAERCD24CD153colorMFLAERCD14CD334colorGFLAERCD24CD15CD