高效液相色譜串聯質譜法測定人血漿中氯沙坦氫氯噻嗪

氯磺酸-氫氯仿銨是第一個血管緊張素（ang）的受體阻滯劑和尿劑的聯合制劑。氯沙坦和氫氯噻嗪的降壓作用疊加,二者合用時,能削弱氫氯噻嗪因刺激腎素-血管緊張素-醛固酮系統而產生的對抗血壓調節的作用,AngⅡ受體選擇性地被阻斷的同時,利尿劑的降壓作用可得到增強,且副作用降低。所以氯沙坦鉀/氫氯噻嗪復方制劑在臨床上適用于聯合用藥的高血壓患者,以及重度高血壓患者的初期治療。本實驗用HPLC-MS/MS法對氯沙坦鉀和氫氯噻嗪進行分別測定,對20名健康男性志愿者口服氯沙坦鉀氫氯噻嗪參比和受試制劑后的藥物動力學進行了研究,以便為臨床用藥提供參考。材料、對象和方法1氯沙坦鉀和氫氯噻嗪的對照品受試制劑:氯沙坦鉀氫氯噻嗪片,規格:每片含氯沙坦鉀50mg、氫氯噻嗪每片12.5mg,批號:050506,北京雙吉制藥有限公司生產;參比制劑:氯沙坦鉀氫氯噻嗪片(商品名:海捷亞),規格:每片含氯沙坦鉀50mg、氫氯噻嗪每片12.5mg,批號:S1170,MerckSharp&DohmeLtd.(UK)生產;氯沙坦鉀和氫氯噻嗪的對照品(99.8%);內標:布洛芬對照品,含量:99.6%,均由北京雙吉制藥有限公司提供;替米沙坦對照品,含量:99.6%,北京萬生藥業有限公司提供。甲醇、乙腈、甲酸、氨水、乙醚,色譜純,均為迪馬公司提供;水為雙重蒸餾水;空白血漿,沈陽軍區總醫院提供。1100液相系統,包括G1311A四元輸液泵、G1313A自動進樣器、G1316A柱溫箱和G1379A脫氣機,美國安捷倫公司產品;API2000三重四極桿串聯質譜儀,配備電噴霧離子源、Analyst1.4.1軟件,均為美國AppliedBiosystems公司產品;BS124SSartorius電子天平,北京賽多利斯儀器系統有限公司產品;TGL-16G離心沉淀機,上海安亭科學儀器廠產品;XW-80渦旋混合器,上海手術器械廠產品。DAS1.0統計計算軟件,中國藥理學會。2試驗前后的體質量選擇健康男性志愿受試者20名,年齡為21～25歲,身高156～180cm,體質量在標準體質量的±10%內。無繼往病史和藥物過敏史,精神狀態良好,平時很少服藥,不吸煙,不嗜酒,試驗前2周內未服用任何藥物。試驗前后,接受全面體檢(包括血常規、肝、腎功能及心電圖檢查),結果均屬正常。受試者于試驗前簽署知情同意書。3飲食、飲食試驗試驗方案由遼寧中醫藥大學附屬第二醫院倫理委員會批準。隔夜禁食12h后,于次日早晨空腹單次口服氯沙坦鉀氫氯噻嗪片(氯沙坦鉀50mg、氫氯噻嗪每片12.5mg),用溫開水200mL吞服。試驗期間統一飲食;試驗期間,禁止抽煙喝酒和劇烈運動,并不得使用其他任何藥物及大蒜蔥等有抑菌作用的食品;服藥后2h,進食統一標準餐。分別于服藥前及服藥后0.33、0.67、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10、12、24、36h,由肘正中靜脈取血5mL,并立即移入經肝素處理的離心試管中,3500r·min-1離心10min,分離血漿,于-20℃冰箱保存待測。4鉻和鉻的形成4.1水質條件:3.2色譜柱:ZobaxXDB-C18色譜柱(150mm×4.6mm,5μm);流動相為甲醇-1%甲酸(80∶20);流量:0.5mL·min-1;柱溫25℃;進樣:10μL。質譜條件:離子源為電噴霧電離源(TurboIonspray);正離子方式檢測;掃描方式為多反應監測(MRM),碰撞能量(CE)分別為30eV(氯沙坦)和50eV(替米沙坦);用于定量分析的離子反應分別為m/z423→m/z207(氯沙坦)和m/z515→m/z276(替米沙坦),掃描時間為0.2s。4.2質譜條件色譜柱:ZobaxXDB-C18色譜柱(150mm×4.6mm,5μm);流動相為乙腈-2%氨水(80∶20);流量0.5mL·min-1;柱溫25℃;進樣:10μL。質譜條件:離子源為電噴霧電離源(TurboIonspray);負離子方式檢測;掃描方式為多反應監測(MRM),碰撞能量(CE)分別為-28eV(氫氯噻嗪)和-10eV(布洛芬);用于定量分析的離子反應分別為m/z296.0→m/z204.9(氫氯噻嗪)和m/z205.1→m/z161.0(布洛芬),掃描時間為0.2s。5lc/ms分析氯沙坦取血漿200μL,分別加入甲醇50μL,內標溶液50μL(200ng·mL-1替米沙坦溶液)和1%甲酸50μL,混勻;加乙醚6mL,渦流混合1min,10000r·min-1離心5min;取上清液于另一試管中,40℃氮氣流下吹干,殘留物加入流動相100μL溶解,渦流混合,取10μL進行LC/MS/MS分析。氫氯噻嗪取血漿200μL,分別加入流動相50μL,內標溶液50μL(100ng·mL-1布洛芬溶液),渦流混合1min;加乙醚5mL,渦流混合2min,10000r·min-1離心5min;分取上層有機相于另一試管中,于40℃氮氣流下吹干,殘留物加入流動相100μL溶解,渦流混合,取20μL進行LC/MS/MS分析。結果1方法學評價1.1內標布洛芬和氯沙坦的保留時間用內標法進行測定,本試驗條件下,測得色譜圖見圖1、2。由圖1、2可見,血漿中氯沙坦和內標替米沙坦的保留時間分別為2.53、2.00min;氫氯噻嗪和內標布洛芬的保留時間分別為2.5、2.05min。表明空白血漿中內源性物質不干擾測定。1.2標準曲線和回歸方程氯沙坦取空白血漿200μL,加氯沙坦標準溶液50μL,配制成相當于氯沙坦血漿濃度為5、10、20、50、100、200和400ng·mL-1的樣品,按上述方法操作,每一濃度進行雙樣本分析,進樣10μL;以待測物濃度為橫坐標、待測物與內標物峰面積比值為縱坐標,用加權(W=1/X2)最小二乘法進行回歸運算,求得直線回歸方程為Y=1.74×10-2X+1.06×10-2(γ=0.9982);定量下限為5.0ng·mL-1。氫氯噻嗪取空白血漿200μL,加標準系列溶液50μL,配制成相當于氫氯噻嗪血漿濃度為1、2、5、10、20、50和100ng·mL-1的樣品,按上述方法操作,每一濃度進行雙樣本分析,進樣20μL;以待測物濃度為橫坐標、待測物與內標物峰面積比值為縱坐標,用加權(W=1/X2)最小二乘法進行回歸運算,求得直線回歸方程為Y=2.72×10-3X+1.14×10-3(γ=0.9988);定量下限為1.0ng·mL-1。1.3準確度、精密度和回收率取空白血漿,配置氯沙坦低、中、高3個濃度(10、50和320ng·mL-1)的質控樣品和氫氯噻嗪低、中、高3個濃度(2、20和80ng·mL-1)的質控樣品,每一濃度進行6樣本分析,連續測定3d,根據當日標準曲線,求得準確度與日內、日間精密度,結果見表1。以提取后的色譜峰面積與空白血漿提取后加入對照品溶液進樣獲得的色譜峰面積之比,考察方法的提取回收率,結果見表2。內標物提取回收率試驗方法相同,提取回收率均>60%。1.4萃取藥物穩定性的測定取空白血漿,配制氯沙坦和氫氯噻嗪的低、中、高3個濃度的質控樣品,每濃度3樣本分析,考察藥物的穩定性。結果表明,氯沙坦血漿樣品經液液萃取處理后,室溫放置12h;經2次冷凍-解凍循環,-20℃保存15天穩定;氫氯噻嗪血漿樣品經液液萃取處理后,室溫放置12h,經2次冷凍-解凍循環,-20℃保存15天穩定。2服藥時間曲線20名健康受試者口服受試制劑和參比制劑(氯沙坦鉀50mg、氫氯噻嗪12.5mg)后,平均血藥濃度-時間曲線,見圖3。3藥房動態參數用梯形法計算AUC,以半對數作圖法由消除相濃度點計算t1/2;tmax和Cmax用實測值,結果見表3。4生物利用度測定結果20名受試者口服含氯沙坦鉀50mg、氫氯噻嗪12.5mg的受試制劑和參比制劑后氯沙坦相對生物利用度平均為(96.5±21.2)%,方差分析結果表明,受試制劑與參比制劑相比,生物利用度無顯著性差異,受試制劑AUC0-t的90%置信區間為參比制劑相應參數的86.0%～103.2%。氫氯噻嗪的相對生物利用度平均為(106.8±22.9)%,方差分析結果表明,受試制劑與參比制劑相比,生物利用度無顯著性差異,受試制劑AUC0-t的90%置信區間為參比制劑相應參數的96.3%～113.5%,表明2種制劑具有生物等效性。流動相條件存在的靈敏度氯沙坦正離子電離方式下有強吸收;而氫氯噻嗪在正離子電離方式下無質譜響應。氫氯噻嗪在負離子電離方式下有較強的吸收;而氯沙坦在負離子電離方式下強度很弱,因此選擇分別用2種離子模式對氯沙坦、氫氯噻嗪進行測定。由于氯沙坦在正離子電離方式下進行測定,因此在流動相中加入適量甲酸能明顯提高靈敏度;同樣,氫氯噻嗪在負離子電離方式下進行測定,在流動相中加入適量氨水,使其靈敏度較同樣不加氨水條件下峰型和靈敏度均得到明顯改善,增加了實驗結果的穩定性和可靠性。將主要藥代動力學參數經對數轉換后進行方差分析,結果顯示,受試制劑和參比制劑中氯沙坦和氫氯噻