植物生理學實驗

實驗二葉綠素a、b含量測定實驗原理根據葉綠體色素提取液對可見光譜的吸收，利用分光光度計在某一特定波長測定其吸光度，即可用公式計算出提取液中各色素的含量。根據朗伯—比爾定律，某有色溶液的吸光度A與其中溶質濃度C和液層厚度L成正比，即A＝αCL式中：α比例常數。當溶液濃度以百分濃度為單位，液層厚度為1cm時，α為該物質的吸光系數。實驗原理各種有色物質溶液在不同波長下的吸光系數可通過測定已知濃度的純物質在不同波長下的吸光度而求得。如果溶液中有數種吸光物質，則此混合液在某一波長下的總吸光度等于各組分在相應波長下吸光度的總和。今欲測定葉綠體色素混合提取液中葉綠素a、b和類胡蘿卜素的含量，只需測定該提取液在三個特定波長下的吸光度A，并根據葉綠素a、b及類胡蘿卜素在該波長下的吸光系數即可求出其濃度。實驗原理葉綠素a、b在95%乙醇中最大吸收峰的波長分別為665nm和649nm，類胡蘿卜素為470nm，可據此得出以下公式:

色素濃度計算公式（濃度單位：mg·L-1）

Ca=13.95A665

–

6.88A649Cb=24.96A649

–

7.32A665CT=Ca+Cb=

18.08A649

+

6.63A665Cx.C=（1000A470–2.05Ca–114.8Cb）/245實驗目的；實驗材料、儀器設備與試劑目的：掌握在未經分離的葉綠體色素溶液中測定葉綠素a和b的方法及其計算；鞏固分光光度計的使用。材料：白蘭葉片儀器設備：

分光光度計，天平，研缽，容量瓶，漏斗，濾紙，滴管試劑：

95％乙醇，石英砂，碳酸鈣粉實驗步驟1、取新鮮白蘭葉片，擦凈表面，去掉中脈，剪碎混勻。2、稱取剪碎的新鮮樣品0.2g，放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及2～3ml95％乙醇，研磨成均漿，再加95％乙醇10ml，繼續研磨至組織變白。靜置3～5min。3、取濾紙1張，置漏斗中，用95％乙醇濕潤，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，過濾到25ml容量瓶中，用少量95％乙醇沖洗研缽、研棒及殘渣數次，最后連同殘渣一起倒入漏斗中。實驗步驟4、用滴管吸取95％乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中。直至濾紙和殘渣中無綠色為止。最后用95％乙醇定容至25ml，搖勻。5、把葉綠體色素提取液倒入光徑1cm的比色杯內。以95％乙醇為空白，在波長665nm、649nm和470nm下測定吸光度（調節波長旋鈕，選擇所需測的波長。蓋上樣品室蓋，使光路通過參比溶液比色皿。將選擇開關調至“A”，調節吸光度旋鈕，使數字顯示為“000.0”。再將被測溶液置于光路后，數字顯示值即為溶液的吸光度）。實驗步驟吸光度色素濃度（mg·L-1）組織中各色素含量（mg·g-1）樣品質量提取液總量A665A649A470CaCbCTCx·CCa'Cb'CT'Cx·C'Ca/Cb6、將上述數值填入書上表2-12-1中（不要求重復組）。實驗結果計算與分析1.將測定得到的吸光值代入下面的式子，計算葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的濃度(mg.L-1)以及葉綠素總濃度，葉綠素a/b的濃度比值。

Ca=13.95A665

–

6.88A649Cb=24.96A649

–

7.32A665CT=Ca+Cb=

18.08A649

+

6.63A665Cx.C

=（1000A470–2.05Ca–114.8Cb）/2452.最后根據下式可進一步求出植物組織中葉綠素的含量：

色素的濃度(mg.L-1)×提取液體積(mL)（×稀釋倍數）樣品鮮重(g)×1000注意事項1、為了避免葉綠素的光分解，操作應在弱光下進行；研磨時間盡可能短些，以不超過兩分鐘為宜。2、過濾時必須將濾紙及葉片殘渣洗至無綠色為止。比色時提取液不能混濁。3、比色杯光學面保持清潔；換樣品時倒凈即可，不需潤洗。4、樣品濃度控制在吸光度值0.2-0.8范圍之間進行測定，如超出此范圍可適當稀釋（或濃縮）。5