應用dna重組技術構建大鼠鱗狀神經節神經營養因子真核表達載體

cndt是一個含有20-24kd的酸性蛋白質，可以顯著促進中樞神經和周圍運動神經元的生存，防止因破壞而轉移到血管。近年的基礎研究發現神經損傷后采用組織工程方法,將有活性的種子細胞移植治療神經損傷,能促進損傷軸突修復、再生,恢復部分神經功能。近年種子細胞應用的相關研究逐漸成為神經組織工程的熱點,肌源性干細胞也備受廣大學者關注。肌源性干細胞是高度未分化的多潛能細胞,具有長時間強大的自我更新能力;在特定刺激下,其可以分化為成骨細胞,肌細胞,心肌細胞,神經細胞等,可以作為神經組織工程的理想細胞。本實驗通過真核表達載體pEGFP-C3-CNTF的構建并轉染成肌細胞,促使成肌細胞穩定表達CNTF,探討真核表達載體pEGFP-C3-CNTF轉染的成肌細胞作為神經組織種子細胞的可行性。1材料和方法設計:隨機對照的實驗研究。時間及地點:實驗于2011-4/2011-12在遼寧醫學院實驗室完成。1.1菌種和質粒實驗動物:新生3～5d的SD大鼠乳鼠(10g±2g),由遼寧醫學院實驗動物中心提供,動物許可證號:SCXK(遼)2003-2007。菌種和質粒:菌種:E.coliDH5α為本實驗室保存。質粒:pDBLeu-CNTF,pEGFP-C3均為本實驗室保存實驗分組:轉染pEGFP-C3-CNTF重組質粒的成肌細胞組(成肌-CNTF細胞)作為實驗組,轉染pEGFP-C3空載體的成肌細胞(成肌-mock細胞)組作為對照組。1.2重組質粒的構建和表達(1)引物設計與合成引物設計與合成由上海生工生物工程有限公司完成,CNTF引物上游序列為:5,-CTTTCGCAGAGCAAACACCT-3,,下游序列為5,-CATCCCATCAGCCTCATTTT-3,,應用RT-PCR技術擴增CNTFcDNA目的片段.1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測所得擴增產物是否為目的片段。(2)構建真核表達載體采用分子克隆技術構建其真核表達載體。對PCR擴增的目的片段CNTFp-EGFP-C3質粒經XhoI和BamHI雙酶切,1.0%瓊脂糖凝膠電泳后膠回收CNTF目的片段和載體pEGFP-C3片段,經T4DNA連接酶16℃連接過夜,產物轉化入感受態大腸桿菌E.coliDH5α菌株,用含卡那霉素(50ms/L)的LB瓊脂平板培養,隨機挑選10個單克隆,以菌落為模板進行PCR初步篩選。重組真核表達載體命名為p-EGFP-C3-CNTF。鑒定正確的陽性克隆,在含卡那霉素(50mg/L)的LB培養液中培養過夜,抽提重組質粒后,以質粒為模板雙酶切鑒定并將陽性克隆進行測序。p-EGFP-C3-CNTF質粒轉染成肌細胞參照Lipofectamine2000試劑盒(LF2000,Invitrogen公司)說明書采用陽離子脂質體介導兩組質粒(pEGFP-C3-CNTF和pEGFP-C3)轉染成肌細胞。原代培養成肌細胞生長至70%～80%匯合時,以無血清培養液沖洗細胞1次。用p-EGFP-C3空質粒和pEGFP-C3一CNTF重組質粒轉染成肌細胞,各轉染12孔。分別于轉染后24h和48h在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達情況以檢測轉染效率。抗生素篩選穩定轉染的細胞系。擴增培養獲得的能穩定表達大鼠CNTF的成肌細胞,命名為成肌-CNTF細胞,作為實驗組;將作為對照的穩定轉染pEGFP-C3空質粒的細胞命名為成肌-mock細胞。設β-actin為內參,引物設計,引物上游序列為:5,-GTAAAGACCTCTATGCCAACA-3,,下游序列為:5,-GGACTCATCGTACTCCTGCT-3,,RT-PCR檢測CNTFmRNA的表達情況。觀察p-EGFP-C3-CNTF質粒轉染的成肌細胞向神經元樣細胞分化并鑒定用神經元特異性蛋白(NES)鑒定神經元樣細胞,經免疫組化染色后,在顯微鏡下拍照并計數陽性細胞占細胞總數的比例。主要觀察指標:RT-PCR擴增檢測CNTF基因片段;Desmin鑒定成肌細胞;神經元特異性蛋白(NES)鑒定神經元樣細胞,于鏡下觀察細胞形態并計數陽性細胞占細胞總數的比例。設計、實施、評估:實驗設計為第一作者在第三作者指導下完成,實施為第一、二作者,評估為第三作者。1.3統計分析x=sxs2pegfp-c3-cnrt重組質粒的鑒定2.1重組質粒的雙酶切鑒定重組質粒pEGFP-C3-CNTF經XhoI和BamHI雙酶切后可得到兩條分別為422bp及4726bp的條帶,而pEGFP-C3空質粒雙酶切后則只能得到一條4726pb的條帶、經與GenBank中公布的基因序列比對,證實pEGFP-C3-CNTF重組質粒插入片段的序列與登記的CNTFcDNA序列完全一致,結果表明陽性重組質粒中包含有CNTF目的基因片段。見圖1。2.2用神經元特異性蛋白(NES)鑒定成肌細胞分化為神經元樣細胞,經免疫組化染色后,在顯微鏡下拍照。見圖2。2.3于顯微鏡下計數陽性細胞占細胞總數的比例。實驗組與對照組之間差異有顯著性意義(P<0.05)見下表。不同轉染條件下神經元樣細胞的陽性率(xˉ±s?n=5)(xˉ±s?n=5)2.4RT-PCR分析結果,成肌-CNTF細胞和成肌-mock細胞所提RNA均能擴增出代表CNTF基因的422bp的條帶和內參β-actin基因的條帶,但前者大鼠CNTFmRNA表達量明顯大于后者,表明在穩定轉染pEGFP-C3-CNTF的成肌-CNTF細胞中大鼠CNTF的mRNA表達水平明顯增高。如圖3。3pegfp-c3基因質粒的制備及真核表達載體的選擇傳統觀點認為在中樞神經系統損傷后,由于內在的再生能力差和外在的微環境的抑制,損傷的軸突不能再生。然而近年的基礎研究發現神經損傷后采用組織工程方法,將有活性的種子細胞移植治療神經損傷,能促進損傷軸突修復、再生和恢復神經部分神經功能。近年來組織工程討論的熱點之一就是種子細胞的應用,預期它們在組織工程應用領域特別是細胞移植和基因治療方面前景廣闊,國外已在進行基因治療和組織工程的動物實驗,并取得較明顯的效果。CNTF作為目前研究最多的神經營養因子,它可能在人類運動神經損傷及肌肉萎縮等運動神經系統疾病的治療上發揮重要的作用,研究顯示其能明顯促進中樞和周圍運動神經元存活,防止受損神經元退變的功能。近年的基礎研究發現神經損傷后采用組織工程方法,將有活性的種子細胞移植治療神經損傷,能促進損傷軸突修復、再生,恢復部分神經功能。肌源性干細胞是成年動物或人肌肉組織中特有的成體干細胞,屬高度未分化的多潛能細胞,在特定刺激下,可以分化為成骨細胞,肌細胞,心肌細胞,神經細胞等,可以作為神經組織工程的理想細胞。本部分研究首先根據pEGFP-C3質粒上的MCS以及待克隆的目的片段JNK3的開放閱讀框(openreadingframe,ORF)序列選擇XhoI和BamHI酶切位點作為克隆酶切接頭。設計CNTF特異性的引物時在其兩端分別加上XhoI和BamHI的酶切位點及3個保護堿基。然后以pDBLeu-CNTF質粒為模板,通過PCR的方法獲得大鼠CNTFcDNA編碼區全長。再將CNTF目的片段和pEGFP-C3質粒分別用XhoI和BamHI雙酶切,產生非互補粘端,促使外源CNTF目的片段定向插入至pEGFP-C3載體中。連接產物熱沖擊轉化感受態E.coliDH5α。由于載體帶有Kanr基因,使所有轉入載體的細胞均獲得了抗性,能在含Kana的LB平板上生長成菌落。最后,通過進一步酶切和PCR篩選鑒定重組子,并將重組質粒進行DNA序列測定,經與GenBank中公布的基因序列比對確認插入的目的片段的序列準確無誤,證實大鼠CNTF真核表達載體構建成功,將其命名為pEGFP-C3-CNTF。構建了一個可在真核細胞中組成性表達大鼠CNTF蛋白的pEGFP-C3-CNTF表達載