微生物工程工藝與設備

——微生物工程下游技術概述

底物發酵罐檢測控制儀表培養基（滅菌）經加工原料酶細胞生物催化劑（游離或固定化）機械能除菌空氣產品提取純化副產品產品廢物熱能原材料營養物典型發酵工業技術過程本部分解決的問題微生物工程下游技術的時代背景

①下游技術是生物產品工業化的必經之路

②下游技術是目前產品競爭力的關鍵技術

③下游技術經常是新產品開發能否工業化的關鍵因素。

④下游技術與環境保護密切相關。微生物工程下游技術概述

生物工程下游技術(DownstreamProcessing)，為提取生物產品時所需的原理、方法、技術及相關硬件設備的總稱，微生物工程下游技術特指從發酵液中提取、分離純化、富集生物產品的過程。下游技術的任務

發酵液目的產物原料伴隨物，發酵副產物設備磨蝕物，添加劑低成本質量合格高收率微生物工程下游技術概述

1、下游技術的特點：物質分離

（1）非自發過程，需要能量（2）專有設備

（3）清潔生產

微生物工程下游技術的發展歷程19世紀60年代前利用自然微生物來釀酒、制醬、醋、酸奶和干酪等疾病的預防我國古代的釀酒工藝利用牛痘預防天花不分離或簡單分離微生物工程下游技術的發展歷程19世紀60年代至20世紀40年代篩選和構建純種微生物培養技術生產特殊產品。典型的例子發酵產乙醇、丙酮、丁醇1940年，丙酮和丁醇的產量分別超過了9000噸和4500噸有機溶劑蒸餾、精餾、過濾等技術生物工程下游技術的發展歷程20世紀中葉（1940-1970）

無菌空氣制備技術和液體深層耗氧發酵開發成功不僅有小分子，也有具生命活性的大分子典型產品：抗生素、酶、氨基酸。萃取、吸附、沉淀等技術微生物工程下游技術的發展歷程20世紀70年代末

基因重組技術和細胞如何技術的進步第一個基因蛋白質———胰島素大量高附加值產品吸引了大量投資。層析、電泳等技術微生物工程下游技術的發展歷程

微濾、絮凝和連續過濾機等的新型固液分離技術與設備冷凍加壓釋放和酶、化學破碎等細胞破碎技術離子交換、雙水相萃取、超濾等初步分離純化技術。親和層析和凝膠層析等高度分離純化技術。酶色素細胞鹽離子（水合）有機小分子小分子微生物工程下游技術難點多糖核酸發酵產物濃度較低，大多小于10%，懸浮液中大部分是水；酶的濃度經常小于千分之一，產品濃縮等環節能耗大，步驟多微生物工程下游技術難點生物制品的多樣性而導致的生物分離方法的多樣性。生物制品除糖類、脂類、蛋白質、氨基酸、核苷酸等以外，還有胰島素、生長激素、干擾素等基因工程產品，另外，還有丁醇、丙二醇、甘油等小分子，產品的多樣性導致分離方法的多樣性。微生物工程下游技術難點懸浮物顆粒小，相對密度與液相相差不大；固體粒子可壓縮性大；液相粘度大，大多為非牛頓型流體；固液分離難度大離心、過濾難度大、效率低微生物工程下游技術難點整個分離過程要求條件溫和，及時快速操作。欲分離的目的產物，通常不穩定，易失活。整個過程必須溫度合適，pH合適，時間短，避免染菌。殘留底物和產物共存，大量活細胞新陳代謝的生命活動還在進行，有可能引起產物的破壞和降解，導致發酵液的變質，給下游操作帶來不必要的困難。微生物工程下游技術難點產品的質量要求高尤其是藥品等。成品青霉素對其強致敏原---青霉噻唑蛋白必須控制RIA值（放射免疫測定）小于100（1.5*10-6），蛋白類藥物（雜質<2%）、重組胰島素（Humulin）中雜蛋白小于0.01%微生物工程下游技術難點絕大多數生物分離方法來源于化學品的分離方法成分簡單成分復雜微生物工程下游技術現狀分離純化成本高、工藝復雜，過程精細。分離過程所占費用是產品的總成本的40～80%。基因工程的精細產品一般占到總成本的70～90%勞動力和物力成本占整個勞動力的70-90%。產品收率低。抗生素(80%左右)，蛋白質(60-90%)。比化工分離研發難度大，費用高。下游研究費用占整個R&D費用的50%以上原理技術應用Phasechange1)、蒸餾乙醇沸點和蒸汽壓2)、精餾有機溶劑回收3)、蒸發制鹽、抗生素富集Extraction1)、液-液萃取抗生素分配系數2)、液-固萃取中藥分離

3)、固相萃取天然產物4)、雙水相萃取酶

5)、反膠束萃取DNA重組蛋白質

6)、超臨界萃取中藥提取Densitydifference1)、常規離心細胞分離比重、密度2)、高速離心細胞、病毒分離3)、超速離心病毒,細胞器,DNA微生物分離工程的分類大約80%的化工分離方法應用于生物分離技術微生物分離工程的分類Membrane1）、常規過濾發酵液膜分離2）、微濾細菌、細胞碎片

3）、超濾蛋白質、酶4）、納濾有機物回收,污水治理

5）、反滲透濃縮、污水處理Solubility1）、結晶味精溶解度2）、鹽析蛋白質、酶3）、有機試劑蛋白質

4）、等電點法蛋白質、酶

微生物分離工程的分類Absorbance1）、非特異性吸附抗生素(吸附)2）、特異性吸附抗體3）、親和吸附抗原抗體

4）、離子交換抗生素Chromatography1）、凝膠抗生素、蛋白質(色譜或層析)2）、親和色譜抗體3）、離子交換蛋白質ElectricField1）、磁性免疫微球抗原抗體(場致分離)2）、區帶電泳蛋白質3）、等速電泳蛋白類

4）、等點聚焦電泳蛋白類

發酵液成分復雜產物穩定性差

產品濃度低發酵液預處理加熱調pH值細胞分離細胞破碎碎片分離初步分離精制產品絮凝離心過濾勻化超聲研磨胞溶離心萃取膜過濾萃取吸附超濾沉淀分子篩離子親和吸附電泳冷凍干燥胞外產物1）工藝復雜2）連續操作困難3）回收率低下游技術的一般工藝過程

具體的產品分離提取需考慮：（1）是胞內產物還是胞外產物；（2）原料中產物和主要雜質濃度；（3）產物和主要雜質的物理化學特性及差異；（4）產品用途和質量標準；（5）產品的市場價格；（6）廢液的處理方法。下游技術的一般工藝過程

24工藝設計前應了解的信息

原料特性：(原料選擇（粗、精)）粗料雜質多粗料發酵（酒精、檸檬酸、酶制劑等工業）—粗料中帶入大量的不參與發酵過程的可溶性雜質和不溶性懸浮物—成本（下游技術）上升—分離提取困難、（環保）發酵廢液處理成本高。清料（清液）發酵是發展方向。產品特性：小分子產品因分子結構簡單，性質相對穩定，分離技術可選范圍較大。產品性質限制下游技術的可選范圍。如當生物技術產品是食品或藥物時，從安全性考慮，溶媒的使用受到一定限制，如苯、或氯仿對人都是有害的。是否污染，分離介質、膜材料等方面都有一些限制。工藝設計前應了解的信息

產品特性(1)、溶解度及影響因素；(2)、分子量和分子形狀；(3)、沸點和蒸汽壓；(4)、極性大小；(5)、分子電荷及影響因素；(6)、功能團；(7)、免疫原性；(8)、穩定性及其影響因素；(9)、分子的淌度及影響因素；(10)、等電點pI。產品用途和質量標準

表1.3五肽胃泌素的上海市藥品標準（1993年版32頁）指標名稱指標含量（C37H49N7O9S）97.0-103.0

比旋光度-25?~-29?

吸收值比A(280nm):A(288nm)=1.12-1.22

氨基酸各氨基酸之比為1

干燥失重，%0.5

產品的價格工藝設計前應了解的信息

4）、生產規模5）、危害性離心產生的氣溶膠、發酵產的廢氣、干燥產生的粉塵等。目的產物本身的危害性；試劑危害。微生物的危害。6）、分批分離還是連續純化工藝設計前應了解的信息

分離方法選擇的基本原則1)、盡可能簡單、低耗、高效、快速。2)、分離步驟盡可能少。

如φ5=0.955=0.77φ10=0.9510=0.63，

分離步驟多，設備投入大，人員物資消耗大，生產周期長

分離方法選擇的基本原則3)、避免相同原理的分離技術多次重復出現

4)、盡量減少新化合物進入待分離的溶液。

A)、引起新的化學污染；B)、活性物質的變性失活

5)、合理的分離步驟次序。原則是：先低選擇性，后高選擇性；先高通量，后低通量；先粗分，后精分；先低成本，后高成本。

對環境的考慮1）、廢水

A、除菌過濾和滅菌處理；

B、符合BOD的要求；2）、廢料

A、滅菌處理；

B、綜合利用：動物飼料、飼料添加劑，有機肥料3）、廢氣

A、除菌過濾和滅菌處理；

B、廢氣（有機溶劑）回收4）、溶劑的回收

A、減少環境排放，減少污染；

B、循環利用，減低成本

分離效率的評價1）、濃縮率

意義：1）、如mT

>1，則目標產物得到富積；2）、如mT

=mX，則目標產物未得到分離純化。原料分離器產品廢液

分離效率的評價2)分離因子