啤酒酵母水溶性多糖的分離純化研究

蛋白質是最重要的生物材料。它是細胞原生質的主要成分，在生物體中發揮著特殊的作用。蛋白質分子是由20種天然氨基酸通過酰胺鍵以一定的方式結合,并具有特定的空間構象的高分子化合物。組成蛋白質的化學元素主要為C、H、O、N,在某些蛋白質中還含有P、Cu、Fe、I等元素,但氮元素的相對豐度基本穩定,是區別于其它有機化合物的標志性元素。由于不同的蛋白質所含的氨基酸比例及構成方式不同,各種蛋白質的含氮量也不同。一般蛋白質平均含氮量為16%,即1克氮元素相當于6.25克蛋白質,此即蛋白質系數。我們利用蛋白質的這一特性,主要采用半微量凱氏定氮法測定啤酒酵母水溶性多糖中蛋白質含量。啤酒酵母(S.cerevisiae)屬真菌,是單細胞微生物。啤酒酵母含有25%-30%酵母多糖,主要是葡聚糖和甘露聚糖(MOS),葡聚糖具有抗腫瘤、促進和激活人體免疫力等作用,因而被稱為“生化反應修飾物”(BRF)。它主要由β-D-(1,3)糖苷鍵連接聚合而成,周期性的分支點主要是β-(1,6)糖苷鍵。葡聚糖的分離方法是引起葡聚糖分子量變化的主要因素,在分離過程中將酵母葡聚糖進行磷酸化修飾,可以有效降低葡聚糖的分支度使它具有很強的免疫調節活性。另外,葡聚糖是低熱量食品,不易消化,因而可以減少血糖含量,預防糖尿病。甘露聚糖可以防止病源菌在腸道里繁殖,減少腸道疾病,也可以作為免疫刺激因子,提高人體免疫力。在對啤酒酵母水溶性多糖進行分離純化研究時發現,在粗多糖和純化后的單一級份多糖中都含有一定量的蛋白質,本文主要通過對啤酒酵母水溶性多糖中蛋白質含量的測定,以進一步了解啤酒酵母水溶性多糖的功能、藥用價值和作用機理,并為充分開發和利用這一真菌資源提供理論基礎。1材料和試劑1.1材料表面實驗材料購自廣東丹寶利酵母有限公司。1.2試劑及試劑廠濃硫酸(哈爾濱理工化學試劑有限公司工廠批號:200301170);硫酸銅(沈陽市東興試劑廠批號:20021025);硫酸鉀(天津市四新化學試劑廠批號:20030710);硼酸(哈爾濱市化工試劑廠批號:051210);甲基紅(崇明縣裕安裕西試劑廠批號:820716);氫氧化鈉(哈爾濱市金麗化工試劑有限公司批號:061018);鹽酸(哈爾濱理工化學試劑有限公司工廠批號:200301230)。所有試劑均為國產分析純試劑,均用無氨蒸餾水配制。1.3儀器與設備LNK凱氏定氮快速自動蒸餾器(中國宜興市科教儀器研究所);LNK-872型多功能快速消化器(中國宜興市科教儀器研究所制造);HDK-4型恒溫定時控制儀(中國宜興市科教儀器研究所);消化管架;250ml直消化管;微量酸式滴定管;電子天平(北京賽多利斯天平有限公司);DHG-9245A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海一恒科技有限公司);752型紫外可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)。2實驗方法2.1凍融法提取自分子中sa精密稱取啤酒酵母15.000g,加20倍體積蒸餾水浸泡過夜,沸水煮提3次,每次一個小時,合并濾液。減壓濃縮至50mL,加3倍體積97%乙醇醇析過夜,離心,常規干燥得水溶性啤酒酵母粗多糖SA。按照文獻報道的方法,將SA反復凍融后,分別以體積分數為47%、57%、63%的乙醇進行分級,相應得到3個級份,其中以63%乙醇分級所得沉淀為主要級份,進一步純化:經Sevage法脫蛋白、Sephadex6B凝膠過濾,得SA1。752型紫外分光光度計在波長280nm處分別檢測SA和SA1是否有光吸收。2.2采用硅氮法測定了茶多酚的含量2.2.1消化非游離水將待測樣品SA和SA1粉末置于稱量瓶中,在105℃烘箱中烘干4h,用坩堝鉗取出放入干燥器內,降至室溫后稱重,重復此操作,直至2次稱重的質量數值不變,表明非游離水被去除,樣品質量已達恒重,可用作消化。2.2.2混合催化劑的制備準確稱取按如上方法烘干至恒重的多糖樣品100mg,放入250ml直消化管底部,加濃硫酸5ml,加入混合催化劑(m(K2SO4)∶m(CuSO4)=5∶1)800mg,消化管置于多功能快速消化器中進行消化,直至消化液完全透明,呈現淡綠色為止,同時以0.1ml蒸餾水做空白試驗,消化完畢,冷卻至室溫,消化液轉入50ml容量瓶,以蒸餾水洗滌燒瓶數次,并入容量瓶中,定容到刻度,備用。2.2.3防回收滴液法精確吸取消化液5ml于消化管中,插接盛有樣品的消化管;再取5ml質量分數為2%硼酸和1—2滴混合指示劑于錐形瓶中,放置錐形瓶,使凱氏定氮快速自動蒸餾器裝置的防回收滴管置于硼酸液面以下。然后加入質量分數為40%NaOH溶液過量,至燒瓶內液體變為深藍色;按下蒸餾開關,通氣后關閉排廢液閥;加熱蒸餾至氨全部蒸出。2.2.4鹽酸標準溶液體積消耗量的測定將上述餾出液用0.01028mol/L鹽酸標準溶液滴定至淡綠色變為粉紅色即為終點,記錄鹽酸溶液體積的消耗量,平行做三次,取平均值;同時做一空白對照。3sa和sa1的紫外分光光度計檢測結果本研究中,按2.1,SA經凍融、乙醇分級后,取其中以63%乙醇分級所得沉淀為主要級份,進一步純化,得SA1。752型紫外分光光度計在280nm檢測SA和SA1均有紫外吸收,表明二者均含有蛋白質。按2.2,凱氏定氮法結果如表1。按文獻,經計算,分別得出SA中蛋白質含量是7.36%,SA1中蛋白質含量是2.45%,見表1。4糖質蛋白食品SA1是由SA分級后純化而得,在純化中進行反復脫蛋白,仍檢測到SA1中蛋白質存在;經苯酚-硫酸法測定SA1的糖分布,發現SA1中所含蛋白質的分布與糖分布相同,表明SA1中的蛋白質為結合蛋白質。啤酒酵母具有食用價值,其蛋白食品含有人體必需的8種氨基酸,尤其是谷類食物中缺乏的賴氨酸含量豐富,可以改善人類的營養均衡。作為營養型食品,測定其蛋白質的含量,是食品分析的主要內容之一